PLoS ONE: Udbredt ekspression af BORIS /CTCFL i Normal og Kræft Cells

Abstrakt

BORIS (CTCFL) er den paralog af CTCF (CCCTC-bindende faktor NM_006565), et ubikvitært udtrykte DNA-bindende protein med forskellige roller i genekspression og chromatin organisation. BORIS og CTCF har stort set identiske zinkfinger-domæner, men vise store forskelle i deres respektive C- og N-terminale regioner. I modsætning CTCF har BORIS udtryk rapporteret kun i testiklerne og visse maligne lidelser, hvilket fører til en klassificering som “kræft-testis” antigen. Imidlertid ekspressionsmønsteret for BORIS er både en væsentlig og uløste spørgsmål inden for DNA-bindende proteiner. Her identificerer vi BORIS i cytoplasmaet og kernen af ​​en lang række normale og cancerceller. Vi sammenligner lokaliseringen af ​​CTCF og BORIS i kernen og demonstrere berigelse af BORIS inden nucleolus, inde i nucleolinantistof kernestruktur og støder op til fibrillarin i den tætte fibrillære komponent. I modsætning hertil er CTCF ikke beriges i nucleolus. Live-billeddannelse af celler forbigående transficeret med GFP tagged BORIS bekræftede nucleolar ophobning af BORIS. Mens BORIS transkriptniveauer er lave sammenlignet med CTCF, dens protein niveauer er let påviselige. Disse resultater viser, at BORIS udtryk er mere udbredt end hidtil troet, og foreslå en rolle for BORIS i nucleolar funktion

Henvisning:. Jones TA, Ogunkolade BW, Szary J, Aarum J, Mumin MA, Patel S, et al. (2011) Udbredt ekspression af BORIS /CTCFL i Normal og kræftceller. PLoS ONE 6 (7): e22399. doi: 10,1371 /journal.pone.0022399

Redaktør: Pierre-Antoine Defossez, Université Paris-Diderot, Frankrig

Modtaget: Marts 18, 2011; Accepteret: Juni 21, 2011; Publiceret: 19 jul 2011

Copyright: © 2011 Jones et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af Cancer Research UK program tilskud C5321 /A8318. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

CTCFL eller BORIS (Brother af regulator af imprintede steder), en paralog af CTCF, er klassificeret som en kræft-testis antigen som dens fordeling er rapporteret at være begrænset til testiklerne og visse kræftformer [1] . Unormalt højt indhold af BORIS-transkripter er til stede i en række humane tumorer og cancer-afledte cellelinjer og i nogle har forøget ekspression blevet knyttet til promotor-specifikke demethylering og de-repression af co-udtrykte cancer-testis-gener [2] [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12]. Forskellige undersøgelser har rapporteret modstridende resultater af BORIS udtryk i nogle typer af kræft. For eksempel blev en rapporteret forøget ekspression i flere brystcancercellelinier, og i størstedelen af ​​primære testet i en undersøgelse brysttumorer ikke bekræftet af en anden [3], [13]. Endvidere forøgede transskription niveauer af BORIS er fundet, i melanom-cellelinjer, men ikke i primære melanomer [7]. Ikke desto mindre er betydningen af ​​BORIS i kræft foreslået af konstateringen af ​​høje niveauer i fremskreden epitelial ovariecancer [14].

BORIS

CTCF

gener menes at har udviklet under vertebrat udvikling fra et gen overlapning begivenhed [15]. Mens zinkfinger-domæner, som binder DNA i de respektive proteiner er meget ens, C- og N-terminale domæner af BORIS udviser ingen signifikant homologi med CTCF eller andre proteiner [16]. BORIS indeholder ikke de modulære substrater for specifikke post-translationelle modifikationer, der er kritiske for CTCF funktion og mangler den konserverede C-terminale phosphorylering motiv kræves til CTCF-medieret vækstsuppression. Dette tyder på forskellige funktioner for de to proteiner.

Flere linjer af beviser peger på en rolle for BORIS i epigenetisk regulering af genekspression. Under mus mandlige kim-line udvikling, er BORIS observeret i primære spermatocytter men er gradvist erstattes af CTCF i post-meiotiske kim-line celler [17]. Denne kontakt i udtryk fra BORIS til CTCF falder sammen med genetableringen af ​​stedsspecifikke DNA-methylering mønstre under mandlige kønsceller differentiering [17]. Endvidere i tumorcellelinier hvor CTCF tavsheder gener ved DNA methylering, betingede udtryk for BORIS fører til udskiftning af CTCF af BORIS på disse gener, hvilket resulterer i lokal aktivering demethylering og gen [6], [10], [11], [18 ].

DNA-binding og epigenetiske funktioner tilskrives BORIS vil foreslå en nuklear lokalisering. seneste rapporter viser imidlertid, BORIS præsentere hovedsageligt i cytoplasmaet i prostata epiteler, testikel og prostatakræft-cellelinier [1], mens nuklear lokalisering kun er identificeret på bestemte stadier af spermatogenesen og i nogle 5-aza-dexoxycytidine behandlet prostatakræft-cellelinier [ ,,,0],5]. Her viser vi fremherskende lokalisering af BORIS inden nucleolus i flere cancer cellelinjer og primære celler, med berigelse i nucleolinantistof kerne struktur og støder op til fibrillarin i den tætte fibrillær komponent.

Resultater og Diskussion

BORIS ekspression i normale celler og cancerceller og væv

for at bestemme niveauet af BORIS-ekspression i normale humane væv, total RNA blev opnået fra humant adipøst, blære, hjerne, cervix, colon, spiserør, nyre, lever , ovarie, placenta, prostata, skeletmuskel, tyndtarm, milt, testikel, thymus, thyroidea og luftrøret (Ambion). Real-time RT-PCR viste de højeste BORIS transkriptniveauer i testiklerne (10

10 transkripter /ug total RNA), mens lavere niveauer blev påvist i andre væv (10

5-10

8 transkripter /pg totalt RNA) efter aftale med andre rapporter [7] (fig. 1). Vi har ikke afsløre BORIS i hjerte eller lunger, selv om dette kan skyldes en begrænsning i følsomhed vores assay. CTCF transkriptniveauer var relativt konstant i alle væv (10

9-10

10 udskrifter /pg totalt RNA) (figur 1).

BORIS transkriptniveauer i normale humane væv (First Choice Menneskelig Total RNA Survey Panel, Ambion, UK). Fejlsøjler repræsenterer standardafvigelsen.

Næste sammenlignede vi transcript niveauer af BORIS og CTCF i en række normale og cancer-cellelinjer. Real-time RT-PCR-analyse viste lignende niveauer af BORIS og CTCF mRNA i fibroblaster, embryonale nyreceller, neurale stamceller, neuroner, kolorektale, prostata, medulloblastom, glioblastom, melanom og neuroblastom cellelinier til dem observeret i humane væv. BORIS ekspression var lavere (10

6-10

7 transkripter /ug total RNA), sammenlignet med den mere rigelige CTCF (10

9-10

10 transkripter /ug total RNA) (fig. 2A). Derfor BORIS og CTCF er til stede i både normale og cancerceller, med udtryk for CTCF ofte 1000 gange højere.

A Boris transkriptniveauer i udvalgte cellelinjer. B, Western blotting for BORIS viser større bånd (*) ved ca. 76 kDa (BORIS teoretisk størrelse), 60 kDa og 45 kDa. De mindre bands kan repræsentere BORIS isoproteins som beskrevet for nylig [19]. C, Western blotting for CTCF viser store bånd (*) på ca. 130 kDa, 60 kDa og 48 kDa. Disse forskellige bands kan repræsentere differentielt udtrykte CTCF isoformer som beskrevet for nylig [36]. BORIS og CTCF er til stede i normale celler (neuroner, neurale stamceller (NSC) og MRC5 føtale lungefibroblaster), neuroblastomcellelinier (ACN, IMR32 og LAN-1), melanoma-cellelinier (26258M, A375M og WM983B), glioblastom celle linjer (CRL-2365, U87MG, CRL-2610, CRL-1620, U138MG og U251) og kolorektale cellelinjer (HCT55, HCT116, HCT15 og LoVo). D, GAPDH blev anvendt som en kontrol for lastning forskelle. Invitrogen Novex®Sharp Pre-Stained Protein Standard, LC5800, blev anvendt til bestemmelse af band størrelse. Fejl barer i (A) repræsenterer standardafvigelsen.

Uventet viste Western blotting tilsvarende niveauer af BORIS udtryk i normale og tumorcellelinier (Fig. 2B). Vi identificerede stærke store bånd på 60-70 kDa i overensstemmelse med den teoretiske molekylvægt af BORIS [19]. Vi har detekteret også nogle lavere og højere molekylvægt bands. Det er endnu ikke klart, hvilke af disse bånd svarer til de nyligt beskrevne isoformer af BORIS [19], eller som er BORIS med post-translationelle modifikationer. Men inkubere BORIS antistof med BORIS-peptid blokerede fuldstændigt alle bånd (fig. S1). Ingen af ​​disse BORIS reaktive bånd blev detekteret, når membranerne blev probet med CTCF antistoffer (fig. 2C).

For at bekræfte specificiteten af ​​BORIS-antistoffet, blev HEK293T celler transficeret med GFP-mærkede BORIS eller GFP- tagged CTCF konstruktioner. Western-analyse bekræftede tilstedeværelsen af ​​BORIS-protein i celler transficeret med GFP-mærkede BORIS, mens kun endogent BORIS blev detekteret i utransficerede celler eller celler transficeret med GFP-CTCF eller tom vektor (fig. S2).

Vi derefter brugte real-time RT-PCR til at bestemme niveauerne af BORIS ekspression i normale musevæv herunder lillehjernen, tarm, nyre, lever, ovarie, milt og testikel. Som i humane væv, fandt vi et langt lavere BORIS sammenlignet med CTCF i musevæv med undtagelse af testiklerne (fig. 3A). Western blotting på et udvalg af musevæv afslørede adskillige bånd, den mest rigelige af dem var ved 60-70 kDa (fig. 3B). Vi har registreret også et bånd på ca. 48 kDa i nyrerne, hippocampus, tarm og cortex, mens andre mindre intense bånd over 200 kDa var til stede i testikel, milt, lunger og leveren (fig. 3B). Disse højere molekylvægt bånd kan svare til homo /heterodimer af BORIS, eller poly (ADP) -ribosylation som det er blevet beskrevet for CTCF [20]. Igen blev detekteret nogen bånd, når membranerne blev probet med BORIS-antistoffer præinkuberet med frie BORIS peptider (Fig. S3), heller ikke vi registrerer de samme bånd, når membranerne blev probet med CTCF antistoffer (fig. 3C). Selvom BORIS-protein klart kan spores, vi kun detektere lave niveauer af BORIS-transkripter, både i celler og væv (fig 1, fig 2A og fig 3A). Men uoverensstemmelse mellem mRNA-niveau og protein overflod er blevet rapporteret til at være dårlig til visse andre gener [21], [22], [23].

A Boris og CTCF mRNA-niveauer i udvalgte normale mus væv. B, Western blotting for BORIS viser større bånd (*) ved 60-70 kDa og 45 kDa i musevæv. C, Western blotting for CTCF viser bånd (*) mellem 70-100 kDa i musevæv. D, GAPDH blev anvendt som en kontrol for lastning forskelle. GE Healthcare Full Range Rainbow Marker, RPN800E blev anvendt til bestemmelse af band størrelse. Fejlsøjler i (A) repræsenterer standardafvigelsen

I betragtning af ligheden i deres zinkfinger-domæner, Boris blevet foreslået at være en antagonist, konkurrent eller regulator af CTCF i kimceller og humane cancere [17]. Faktisk BORIS og CTCF konkurrerer om binding til fælles DNA-mål. For eksempel CTCF belægningsprocent på

MAGE-A1

promotor kun opstår, hvis BORIS ekspressionsniveauerne er lave [11]. Som N- og C-terminale ender af BORIS og CTCF er forskellige, vil de sandsynligvis være ansvarlig for forskellige funktionelle udfald, såsom mediere DNA demethylering, efter binding til DNA. De relative niveauer af BORIS og CTCF er således sandsynligt, at være afgørende for at opretholde stabiliteten i normale genekspressionsprofiler.

nucleolar lokalisering af BORIS

Immunfluorescensfarvning viste, at BORIS ligger inden cytoplasmaet og kerne af adskillige humane celletyper, herunder MRC5 fibroblast, HEK293T embyonic nyreceller, neurale stamceller, colorectal, neuroblastom, melanom, prostata og glioblastomcellelinier. I alle celletyper undersøgte, blev BORIS immunreaktivitet beriget i nucleolus (fig. 4 og fig. S4). Overnight inkubation af BORIS antistof med peptid fuldstændigt blokeret immunfluorescent signalet yderligere bekræftelse af specificiteten af ​​Boris antistoffer (fig. S5). Ingen immunoreaktivitet blev påvist, når celler blev farvet med ikke-specifikke IgG-antistoffer. Co-farvning af celler til BORIS eller CTCF og fibrillarin, et stærkt konserveret protein, der er forbundet med små nucleolar RNA’er [24], bekræftede berigelse af BORIS men ikke CTCF i nucleolus (fig. 4A, B). Yderligere co-farvning viste BORIS inden kernelegeme plads, som nucleolin, en rigelig ikke-ribosomale nucleolar protein [25] (fig. 4C). Konfokal mikroskopi og 3D-rekonstruktion bekræftede, at BORIS var inden nucleolus, der støder op til fibrillarin i både normale celler og cancerceller (fig. 5A, B og Film S1, S2, S3 og S4).

A, B Immunofluorescens billeddannelse af BORIS eller CTCF farvning i grøn (Alexa 488) sammen med fibrillarin farvning i rød (Alexa 594) i MRC5 og kolorektal HCT116 viser berigelse af BORIS, men ikke CTCF, inden nucleolus. Celler blev modfarvet med 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) vist i blåt. BORIS og fibrillarin er nære naboer med hinanden og den tætte fibrillær komponent (DFC) i nucleolus. Billeder er vist ved 100x forstørrelse. C Double immunfarvning viser BORIS farvning i grøn (Alexa 488) inden for Nucleolin regionen (rød, Alexa 594) i humane neurale stamceller og glioblastoma-cellelinie CRL2365. Celler blev modfarvet med 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) vist i blåt. Billeder vises på 100x forstørrelse.

Tre-dimensionelle konfokale billeder, der viser BORIS farvning i grøn (Alexa 488) og fibrillarin farvning i rød (Alexa 594). Celler modfarvet med 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI, blue). A, MRC5 fibroblaster og B, C99 kolorektal cellelinie. Billeder vises på 63x forstørrelse.

For at bekræfte disse resultater blev HEK293T celler transficeret med GFP-mærkede BORIS eller GFP-mærkede CTCF konstruktioner. Brug live-cell imaging, blev GFP fundet at akkumulere progressivt i nucleoli af celler transficeret med GFP-BORIS. 71,3% +/- 1,7 af GFP-BORIS transficerede celler viste klar nucleolar lokalisering (873 analyserede celler i alt fra to uafhængige forsøg). I modsætning hertil celler transficeret med GFP-CTCF viste en jævn fordeling af GFP i hele kernen, og de celler transficeret med en tom GFP-vektoren viste primært GFP i cytoplasmaet (fig. 6). Endvidere immunfarvning af celler 72 timer efter transfektion af celler med HEK293T BORIS specifikke shRNA plasmider, men ikke tom vektor, signifikant (

s Restaurant 0,05) reducerede nucleolar immunfarvning af BORIS (. Fig S6A, B). Dette var ledsaget af en tilsvarende reduktion i BORIS transkriptniveauer (Fig S7).

Live-cell imaging af HEK293T celler forbigående transficeret med GFP-mærkede BORIS (grøn), GFP-mærkede CTCF (grøn) eller tom vektor ( grøn), modfarvet med Hoechst 333.412 (blå). Billeder vises på 40x forstørrelse.

Formodede nucleolar lokaliseringssekvenser

Computational analyse af BORIS protein sekvens Q8NI51, [26], afslørede 2 formodede nucleolar lokalisering sekvenser i zinkfingerdomænet :

LIQHQKTHKNEKRFKCKHCSYACKQ (mellem positionerne 473 og 497) (ZF6 /7)

AKSAASGKGRRTRKRKQTILKEATKGQK (mellem positionerne 573 og 600) (Zf9 /10)

Fem formodede nucleolar lokalisering sekvenser blev forudsagt i CTCF, hvoraf tre er i N-terminalen og overlapper CTCF K /R acetyleringsniveauer sites forudsagt af Klenová, et al. [17]. De forventede nucleolar lokalisering sekvenser i CTCF er som følger:

ESETFIKGKERKTYQRRREGGQEE (mellem positionerne 12 og 35)

KDPDYQPPAKKTKKTKKSKLRYTEEGKDV (mellem positionerne 193 og 221)

VGNMKPPKPTKIKKKGVKKTFQCEL (mellem positionerne 246 og 270) (N-terminal)

GENGGETKKSKRGRKRKMRSKKEDSSDSENA (mellem positionerne 585 og 615) (ZF 9/10)

QPVTPAPPPAKKRRGRPPGRTNQPKQNQPTAI (mellem positionerne 639 og 670).

Disse sekvenser ville støtte konstateringen af ​​BORIS i nucleolus samt translokationen af ​​CTCF i kernen under differentiering af humane hæmatopoietiske celler [27].

UBF (opstrøms bindende faktor) er for nylig blevet identificeret som den første fælles interaktion partner BORIS og CTCF [28]. Denne interaktion viste sig at være direkte og til at kræve, at zink finger domæner BORIS og CTCF, den høje mobilitet gruppen (HMG) -boks 1, og dimeriseringsdomænet af UBF. CTCF viste sig at binde umiddelbart opstrøms for ribosom spacer promotor i en methylering-følsom måde, hvor det foreslås at indlæse UBF onto rDNA at danne en del af et netværk, der opretholder rDNA-generne klar til transkription. Vores immunfluorescensfarvning viste ikke berigelse af CTCF i nucleolus imidlertid lave niveauer af CTCF kan være til stede, men under påvisning i vores assay. Torrano et al., Viste, at translokation af CTCF til nucleolus efter induktion af differentiering i humane og rotte celler blev reguleret af poly (ADP-ribosyl) tion [27]. UBF er meget rigelige i nucleolus og har vist sig at være meget dynamisk [29]. Således kan direkte interaktion mellem CTCF og UBF være forbigående og siden BORIS genkender de samme DNA-bindende sites [1], kan der være konkurrence mellem CTCF og BORIS at binde UBF [22]. Taget sammen med resultaterne, der er beskrevet her, den direkte interaktion af BORIS med UBF antyder BORIS spiller en vigtig rolle i ribosom biogenese.

Afsluttende bemærkninger

Dette er den første rapport, der viser BORIS lokalisere overvejende nucleolus i mange forskellige maligne og ikke-maligne celletyper. Nucleolus er en multi-funktionel sub-nukleare rum, hvor der for eksempel er ribosomale RNA syntetiseres, bearbejdes og samles med ribosomale proteiner [30], [31], [32]. Imidlertid har omfattende proteomisk analyse viste den dynamiske karakter af nucleolar proteom og foreslår, at nucleolus kan udføre mange andre biologiske roller i tillæg til ribosom biogenese såsom regulering af specifikke aspekter af mitose og cellecyklusprogression [24], [33] , [34]. Her demonstrerer vi, at BORIS er klart mere end et testis-specifikt protein, og viser en tydelig subcellulære lokalisering i flere cellelinier samt normale mennesker og mus væv. BORIS er beriget i nucleolus, indenfor nucleolin kernestrukturen og støder op til fibrillarin. Vores roman fund af udbredt udtryk for BORIS sammen med sine nucleolar lokalisering berettiger yderligere undersøgelser for at fastslå den præcise funktion i denne sammenhæng.

Materialer og metoder

Cell Culture

Kræft celle linjer blev opretholdt i RPMI eller DMEM suppleret med 10% føtalt bovint serum (medmindre andet er angivet), 100-enheder /ml penicillin, 100 mg /ml streptomycin, og 0,29 mg /ml L-glutamin (Invitrogen). Anvendte cellelinjer var humane lungefibroblaster MRC5 (ECACC); embryonisk nyrecellelinie HEK293T; kolorektale cellelinjer C99, HCT55, HCT116, HCT15, LoVo og SW837; medulloblastom cellelinie DAOY; prostata cancer cellelinjer Du45 og PNT2; melanom cellelinjer A375M, Mel 501, SBCL2, UISO, Mel 6, WM115, WM1158, M2629bM og WM278; neuroblastomcellelinier ACN, IMR-32 og LAN1 og glioblastoma-cellelinier CRL-2365, CRL-2610 (LN-18), CRL-1620 (A-172), CRL-2020 CRL-2611, U-118 mg, U- 138 MG, U251 og U87 MG (ATCC). MRC5 celler blev dyrket i de ovennævnte medier, suppleret med 20% føtalt bovint serum. Humane neurale stamceller fra cellelinien H9 (46, XX) (EnStem-A, Millipore) blev dyrket i Neurobasal medium (Invitrogen, 21.103-049) suppleret med B27 (Invitrogen, 12.587-010), FGF-2 10 ng /ml (PeproTech), 1% penicillin /streptomycin (Invitrogen) og 2 mM glutamin (Invitrogen). Halvdelen af ​​mediet blev udskiftet hver anden dag. In vitro differentiering blev induceret ved at udelade FGF-2 fra mediet.

Tissue proteinisolering

musevæv blev isoleret fra 3 måneder gamle C57BL6 eller NOD mus og lynfrosset i flydende nitrogen. Alle forsøgsprotokoller involverer muse væv blev godkendt af Indenrigsministeriet Animal Procedurer udvalg, under projektet licensnummer PPL 70/6693. Væv blev afbrudt i Qiagen RLT lysepuffer til RNA-ekstraktion, eller i 1X RIPA-buffer (50 mM Tris-HCI pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% Na deoxycholat, 0,1% SDS) indeholdende proteaseinhibitorer (Protease inhibitor Cocktail Set III EDTA-fri, Calbiochem) og phosphataseinhibitorer (phosphatase inhibitor Cocktail Set II, Calbiochem) til proteinanalyse. Total protein lysater blev fremstillet ud fra 10

8 celler i 1X RIPA buffer. Lyserede celler blev ultralydsbehandlet kortvarigt med en Bioruptor og snavs klaret ved centrifugering. Indholdet af ekstrakterne protein blev estimeret ved anvendelse BCA kit (Thermo Fisher Scientific) ifølge producentens protokol.

RNA-isolering og Reverse Transcription

Samlet RNA blev isoleret under anvendelse silicabaserede spin-kolonne ekstraktion kit (RNeasy mini kit, Qiagen) ved at følge fabrikantens protokol. Totalt RNA blev behandlet med RNase-fri DNase1 (Ambion) for at reducere genomisk DNA-kontaminering. RNA integritet blev evalueret ved hjælp af Agilent Bioanalyzer. To mikrogram totalt RNA blev revers transkriberet med SuperScriptase III (Invitrogen) under anvendelse af Oligo-dT-primere eller vilkårlige hexamerer ifølge producentens protokol. Negative (Rt) kontrol indeholdt RNase-frit vand i stedet for revers transkriptase.

Kvantitative Real-Time PCR

Både de offentliggjorte primere [3] og vores egen designet med Primer Express 2.0 blev brugt i denne undersøgelse. Sammen disse primere forstærke 19 ud af de 23 isoformer af BORIS beskrevet for nylig [19]. Menneskelige primere var som følger:

BORIS exon 4-5 fremad:

5′-AAAACCTTCCGTACGGTCACTCT-3 ‘

og omvendt: 5′-TGTTGCAGTCGTTACACTTGTAGG-3′

og sonde: Fam-TAACACCCACACAGGAACCA-Tam

CTCF exon 5-6 fremad: 5′-GAGAAGCCATTCAAGTGTTCCAT-3 ‘

og omvendt: 5′-CTCCAGTATGAGAGCGAATGTGA-3′

og sonde:. Fam-ATTACGCCAGTGTAGAAGTCAGC-Tam

Mus primere var som følger:

BORIS exon 5-6 fremad:

5′-AGTGCTCCCTGTGCAAGTACG-3 ‘

og omvendt 5′-GTAAGCACACTGGCAACACTGG-3′

og sonde: Fam-AAGCAAGATGAAGCGTCACAT-Tam

CTCF exon 5-6 fremad:

5 ‘-TCGTTATAAACACACTCATGAGAAACC-3’

og omvendt: 5′-TCTCCAGTATGAGAGCGAATGTG-3 ‘

og sonde:. Fam-AGTGTTCCATGTGTGATTGTCAG-Tam

mRNA niveauer blev kvantificeret på en ABI7500 instrumentet ved hjælp af SYBR Green JumpStart Taq Readymix kit (Sigma-Aldrich) eller platinium Taq-polymerase (Invitrogen) med 50-100 ng cDNA (undtagen til Boris primere, når 150-200 ng cDNA blev anvendt) og 100-200 nM primere. Vi brugte primere spænder over exon 4/5 krydset af BORIS og resultater blev bekræftet ved hjælp af offentliggjorte primere til exon 6/7 [2], [3], og exon 9/10 [13] i en QRT-PCR assay med forskellige koncentrationer af totalt cellulært RNA. Absolutte koncentrationer blev anslået under anvendelse af standardkurver genereret fra seriefortynding af ampliconer. Tærsklen cyklus fra seriefortyndinger af enkeltstrengede oligonukleotider blev plottet mod de log kopi numrene på de mål PCR-produkterne, og rapporteret som kopiantal /ug total RNA [35].

Western blot analyse

20-50 ug protein ekstrakt og 10 ul af molekylvægt standard (Invitrogen Novex®Sharp Pre-Stained protein standard, LC5800 eller GE Healthcare Full Range Rainbow Marker, RPN800E) blev adskilt på en 4-12% gradient NuPAGE polyacrylamidgel (Invitrogen) og derefter blottet på nitrocelluose membran (Invitrogen) ifølge producentens protokol. Nitrocellulosemembranen blev inkuberet i Tris-bufret saltvand blokeringsopløsning indeholdende 5% skummetmælk og 0,1% Tween-20. Membranen blev derefter probet med primære antistoffer ved anvendelse af standardbetingelser. Vi valgte to antistoffer mod BORIS; en kanin polyklonalt antistof ab18377 (Abcam), dannet mod et syntetisk peptid inden for de første 100 aminosyrer, og en kanin polyklonalt antistof HPA001472 (Sigma), dannet mod aminosyrerne 33-172. Disse kommercielt tilgængelige antistoffer bør anerkende de fleste af de 23 isoformer af BORIS og er blevet karakteriseret tidligere [13], [28]. BORIS antistof ab18337 (1:1000 fortynding Abcam) blev anvendt til alle vestlige data vist og BORIS antistof HPA001472 (1:200 fortynding, Sigma) blev anvendt til at bekræfte båndene (data ikke vist). For CTCF, brugte vi antistof 07-729 (1:1000 fortynding, Millipore) og for GAPDH vi brugte antistof 14C10 (1:2000 fortynding Cell Signalling). Efter adskillige vaske blev bands afsløret med den tilsvarende peberrodsperoxidase koblet sekundært antistof og påvist ved anvendelse af ECL påvisning kit (GE Healthcare) ifølge producentens protokol.

Immunofluorescens

Celler blev dyrket på dækglas og fikseret med 4% paraformaldehyd (Electron Microscopy Sciences) i phosphatbufret saltvand, 0,14 M NaCl, 2,7 mM KCI, 8,1 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4, pH 7,2-7,4 i 10 minutter ved stuetemperatur, efterfulgt af permeabilisering i blokeringspuffer (phosphatbufret saltvand indeholdende 0,1% Triton X-100, 0,01% saponin og 10% gedeserum) i 30 minutter ved stuetemperatur. Celler blev derefter inkuberet med de specifikke antistoffer i blokerende buffer natten over ved 4 ° C. BORIS antistof ab18337 (1:100 fortynding Abcam) blev anvendt til alle standard billeddannelse. BORIS antistof HPA001472 (1:25 fortynding, Sigma) blev anvendt til konfokal billeddannelse og film. Farvning med begge antistoffer viste identisk lokalisering. Vi brugte CTCF antistof 07-729 (1:1000 fortynding, Millipore), Nucleolin (C23) antistof sc-8031 (1:1000 fortynding, Santa Cruz Biotechnology) og Fibrillarin antistof ab18380 (1:1000 fortynding Abcam). Celler blev vasket i PBS, og primære immunreaktioner visualiseret efter inkubation i 1 time ved stuetemperatur med Alexa Fluor 594 kylling anti-mus IgG, A-21201 og Alexa Fluor 488 kylling anti-kanin IgG, A-21441 (begge Invitrogen). Kerner blev modfarvet med 0,1 mg /ml 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI, Molecular Probes) og dækglas blev monteret i Mowiol (Calbiochem). For standard 2 dimensionelle analyse prøver blev visualiseret ved hjælp af en Zeiss Axiophot mikroskop udstyret til epifluorescens hjælp Zeiss plan-Neofluar 20x, 40x eller 100x mål. Separate gråtonebilleder blev registreret med en afkølet CCD-kamera (Hamamatsu, Welwyn Garden City, UK). Billedanalyse blev udført ved anvendelse SmartCapture X-software (Digital Scientific, Cambridge, UK). For 3 dimensionsanalyse prøver blev undersøgt ved anvendelse af et Zeiss Meta 510 LSM anvendelse af en 63x objektiv. Udfoldning af billeder blev udført ved hjælp af Huygens Essential software og billeder behandles derefter i Imaris x64 (v7.1.1).

peptid Konkurrence

Antistof specificitet blev vurderet ved hjælp af en specifik blokerende peptid ab22203 (Abcam). 20 ug peptid blev tilsat til 10 ug BORIS antistof ab18337 (Abcam) i 200 ul TBST buffer og inkuberet ved 37 ° C natten over. Både blokerede og ikke-blokerede antistof blev fortyndet 1:10 i blokerende buffer i immunfluorescens. Alle billeder til både blokeret og blokeret antistof blev indsamlet ved hjælp af de samme eksponeringstider. BORIS antistofspecificitet blev også vurderet ved at udføre Western-blotting med peptid blokeret antistof fortyndet 1:100 i blokeringsopløsning indeholdende 2 ug /ml blokerende peptid. Kontrol ublokeret antistof blev inkuberet på samme tid i passende blokerende buffer uden tilsætning af blokerende peptid.

Kloning og transfektion

rekombinante konstruktioner GFP-BORIS eller GFP-CTCF, blev fremstillet ved at indsætte BORIS eller CTCF cDNA ind i pEGFP-C3-vektoren (Clontech). Fragmenter, der koder fuld længde BORIS (1-663aa) og CTCF (1-727) blev dannet ved PCR under anvendelse af følgende primere:

BORIS-GFP fremad:

5′-CGGAATTCTGATGGCAGCCACTGAGATCTCTGTC-3 ‘

og omvendt: 5′-GCGGGATCCTCACTTATCCATCGTGTTGAGGAGC-3 ‘

CTCF-GFP frem:

5′-CGGAATTCTGATGGAAGGTGATGCAGTCGAAGCC-3′

og omvendt: 5 ‘-GCGGGATCCTCACCGGTCCATCATGCTGAGAGGATC-3’

og pCMV6-XL5-BORIS eller pCMV6-XL5-CTCF plasmider (Origene) som skabeloner, henholdsvis.

PCR-fragmenter blev fordøjet med EcoRI /BamHI indsat i pEGFP-C3 MCS i ramme af EGFP. Hver konstruktion blev bekræftet ved sekventering. Det resulterende GFP-BORIS, GFP-CTCF og pEGFP-C3 vektorer blev transficeret i HEK293T celler under anvendelse FuGene 6-HD (Roche) ifølge producentens protokol. Levende transficerede celler udpladet på dækglas blev farvet med Hoechst 333.412 (Invitrogen) og afbildet 48 timer efter transfektion. For Western-analyse, blev tre millioner celler transficeret hjælp FuGene 6-HD (Roche) og celler opsamles for protein udvinding 72 timer senere.

shRNA medieret knockdown Boris

HEK293T celler blev forbigående transficeret hjælp oprensede og sekvensverificeret plasmider: GI320730 (. målrettet mod en BORIS specifikt sted kodes af exon 5, som er inkluderet i 19/23 splejsningsvarianter identificeret af Pugacheva et al, [19]), GI320731 (målrettet mod en BORIS specifikt sted kodes af exon 3, som er til stede i alle 23 varianter), TR30007 (tomme pGFP-V-RS vektor) og TR30008 (29-mer Ikke-Effektiv GFP (pGFP-V-RS)) fra Origene (kit katalognr TG305184). Kort fortalt blev HEK293T celler transficeret med shRNA kloner GI320730, GI320731, TR30008 eller TR30007 hjælp FuGene 6-HD (Roche). Celler blev analyseret 72 timer efter transfektion. Tre biologiske replikat shRNA eksperimenter blev udført for hver shRNA klon. Kvantificering af mRNA-transkripter blev udført under anvendelse af RT-PCR og alle data normaliseret til GAPDH og tom vektor sat til 1. For kvantificering af BORIS immunfluorescensfarvning blev billeder af HEK293T celler opsamlet 72 timer efter transfektion under anvendelse af samme eksponeringstid. Billeder taget fra 5 tilfældige felter, der indeholder mindst 30 celler blev importeret til ImageJ softwareversion 1,44 (Rasband, WS, ImageJ, amerikanske National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/) . Regioner af interesse (ROI) blev skabt som en maske omkring DAPI farvede cellekerner (blå) og tærsklen justeres for at fjerne baggrunden. Fluorescensintensitet blev beregnet for BORIS Alexa 594 signal (rød) under denne maske og betyde nuklear fluorescens blev beregnet ved at dividere den totale intensitet af nukleare område i hvert billede. Data blev eksporteret til Excel og statistisk signifikans blev vurderet ved One-Way Anova-analyse.

Støtte Information

Figur S1.

antistofpeptid konkurrence i normale og cancer-cellelinjer. Western blot analyse ved hjælp BORIS antistof ab18337 (Abcam) med og uden specifik blokerende peptid ab22203 (Abcam). Inkubere 20 ug peptid med 10 ug BORIS antistof ab18337 (Abcam) i 200 ul TBST-buffer ved 37 ° C natten over blokerede fuldstændigt båndene opnået under anvendelse un-blokeret antistof. magnification.

doi:10.1371/journal.pone.0022399.s011

(AVI)

Acknowledgments

Colorectal