PLoS ONE: Metformin Reducerer Desmoplasia i kræft i bugspytkirtlen ved Omprogrammering Stjemeformige Celler og tumor-associerede Macrophages

Abstrakt

Baggrund

Pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC) er en meget desmoplastiske tumor med en dystre prognose for de fleste patienter. Fibrose og inflammation er kendetegnende for tumor desmoplasia. Vi har tidligere vist, at forhindre aktiveringen af ​​pancreas stjerneformige celler (kvikskranker) og lindre desmoplasia er gavnlige strategier i behandling PDAC. Metformin er et meget anvendt blodsukkersænkende lægemiddel. Det er også ofte ordineres til diabetiske patienter med pancreascancer og er blevet vist at associere med et bedre resultat. Men de underliggende mekanismer af denne fordel fortsat uklare. Metformin har vist sig at modulere aktiviteten af ​​stjerneformige celler i andre indstillinger sygdomstilstande. I denne undersøgelse, vi undersøge effekten af ​​metformin på PSC aktivitet, fibrose og inflammation hos PDACs.

Metoder /Results

I overvægtige, diabetiske PDAC patienter og prækliniske musemodeller, behandling med metformin reducerede niveauer af tumor ekstracellulære matrix (ECM) komponenter, især hyaluronan (HA).

In vitro

, fandt vi, at metformin reducerede TGF-ß signalering og produktionen af ​​HA og kollagen-I i dyrkede kvikskranker. Endvidere fandt vi, at metformin lindrer tumorinflammation ved at reducere ekspressionen af ​​inflammatoriske cytokiner, herunder IL-1 samt infiltration og M2 polarisering af tumorassocierede makrofager (TAM’er)

in vitro

in vivo

. Disse virkninger på makrofager

in vitro Salg synes at være forbundet med en modulering af AMPK /STAT3 pathway af metformin. Endelig har vi fundet i vores prækliniske modeller, at lindring af desmoplasia ved metformin var associeret med en reduktion i ECM remodellering, epitelial-til-mesenkymale overgang (EMT), og i sidste ende systemisk metastaser.

Konklusion

Metformin mindsker fibro-inflammatoriske mikromiljø i overvægtige /diabetiske individer med kræft i bugspytkirtlen ved at omprogrammere kvikskrankerne og TAM’er, som korrelerer med reduceret sygdomsprogression. Metformin skal testes /undersøges som en del af behandlingen strategi hos overvægtige diabetiske PDAC patienter

Henvisning:. Incio J, Suboj P, Chin SM, Vardam-Kaur T, Liu H, Hato T, et al. (2015) Metformin Reducerer Desmoplasia i kræft i bugspytkirtlen ved Omprogrammering Stjemeformige Celler og tumor-associerede makrofager. PLoS ONE 10 (12): e0141392. doi: 10,1371 /journal.pone.0141392

Redaktør: keping Xie, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, UNITED STATES

Modtaget: Juli 4, 2015; Accepteret: 6 oktober 2015; Udgivet: December 7, 2015

Copyright: © 2015 Incio et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle datafiler er tilgængelige fra Harvard DATAVERSE databasen (tiltrædelse (-numre) https://dx.doi.org/10.7910/DVN/LLN5FL)

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (http: //nih.gov/; R35-CA197743, CA80124, CA85140, CA96915, CA115767, og CA126642 til RKJ og DF), den Lustgarten Foundation (https://www.lustgarten.org/; forskningsbevilling til RKJ) og instituttet for videnskab og teknologi (https://www.fct.pt/, Portugal, POPH /FSE finansiering program, fællesskab og forskningsbevilling til JI). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne af dette manuskript har læst tidsskriftets politik og har følgende konkurrerende interesser: RKJ modtaget konsulenthonorarer fra Ophthotech, SPARC, og SynDevRx. RKJ ejer egenkapital i Enlight, Ophthotech, SynDevRx, og XTuit og tjener på bestyrelsen i XTuit og bestyrelser i Tekla Healthcare Investors, Tekla Life Sciences Investorer, og Tekla Healthcare Opportunities Fund. Ingen reagenser eller finansiering fra disse virksomheder blev anvendt i disse undersøgelser. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Prognosen for patienter med kræft i bugspytkirtlen er dystre, med et samlet fem-år overlevelse 7% [1]. Fedme og type-2-diabetes mellitus (DM2) er blevet en pandemi verdensplan [2, 3]. Nylige undersøgelser har vist, at disse metaboliske abnormiteter er forbundet med øget forekomst, progression og dårlig prognose af PDAC [4-9]. Ved diagnose, cirka halvdelen af ​​PDAC patienter er overvægtige eller fede, og op til 80% af patienterne stede med diabetes eller glucoseintolerance [10-17]. DM2 og fedme kan fremme PDAC ved pro-tumorigen insulin og insulin-lignende vækstfaktor-1 (IGF-1) [18-20] samt kronisk inflammation [21, 22]. Derfor kan farmakologiske interventioner, der er målrettet diabetes /fedme også producere anti-tumor effekt. Et sådant middel, i øjeblikket under intens efterforskning, er metformin, den mest udbredte foreskrevne anti-diabetisk generisk lægemiddel, der også ofte gives til diabetiske PDAC patienter [23]. Metformin har vist sig at forbedre behandlingsresultater i prækliniske modeller af PDAC [24-30]. Desuden reducerer forekomsten af ​​kræft i bugspytkirtlen hos diabetespatienter samt forbedrer overlevelse (nedsat risiko for dødsfald med 32%) hos nydiagnosticerede tilfælde [31-33]. Dog er de virkningsmekanismer for metformin i bugspytkirtelkræft ikke godt forstået.

In vitro

undersøgelser har rettet virkningen af ​​metformin på transkriptionsfaktorer, microRNA’er, DNA-skader, kræft stamceller og stofskifte [34-38]. Desuden har metformin blevet vist at modulere funktionen af ​​hepatiske stjerneformige celler, reducere oxidativt stress i cancerassocierede fibroblaster og sænke tumorinflammation [34, 35, 39, 40]. Vi og andre har vist, at omprogrammere PSC reducerer produktionen af ​​ekstracellulær matrix (ECM) komponenter såsom collagen-I og hyaluronan (HA), og forsinker udviklingen af ​​pancreascancer [41-45]. Men virkningen af ​​metformin på PSC aktivering, produktion af ECM komponenter og tumor desmoplasia er aldrig blevet beskrevet.

Formålet med denne undersøgelse er at belyse de funktionelle mekanismer metformin i PDAC fibro-inflammatorisk tumormikromiljøet.

In vivo

undersøgelser af pancreascancer til dato er blevet hovedsageligt udført i xenograftmodeller i normalvægtige /ikke-diabetiske mus, hvor metformin har vist sig at være mindre effektiv [26, 46-48]. Derfor brugte vi to immunkompetente syngene musemodeller, der nøje efterligner fedme /DM2, for bedre at kunne repræsentere bugspytkirtlen kræftpatienter-flertallet af bugspytkirtlen kræftpatienter stede med enten nye debut DM2 eller forringet glukosetolerance på tidspunktet for diagnosen [10-17] – og målgruppen af ​​metformin. Desuden vi suppleret vores musemodeller med

in vitro

undersøgelser samt med analyse af humane prøver af bugspytkirtelkræft fra normal vægt og overvægtige /fede patienter. Vi fandt, at metformin direkte omprogrammerer kvikskranker og TAMer og lindrer fibrose og inflammation hos overvægtige /diabetiske modeller af PDAC. Disse virkninger af metformin korreleret med reduceret ECM remodellering og epitelial-til-mesenkymale overgang (EMT), i sidste ende påvirker metastaser. Vi bekræftede, at ECM i menneskelige PDAC prøver i overvægtige og svært overvægtige patienter var faktisk lavere i patientpopulationen behandlet med metformin.

Materialer og Metoder

Dyreforsøg

De institutionelle Animal Care og brug Udvalg Massachusetts General Hospital godkendt alle eksperimenterende brug af dyr i denne undersøgelse. Alle procedurer dyr fulgte Public Health Service Policy på human måde af forsøgsdyr retningslinjer. Vildtype (WT) C57BL /6 og FVB-hanmus blev oprindeligt opnået fra The Jackson Laboratory (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine) og avlet og opretholdt i vores definerede-flora dyr facilitet. Mus blev holdt i en 12-timers lys-mørke cyklus i en temperatur-kontrolleret barriere facilitet, med

ad libitum

adgang til mad og syrnet vand. For at generere fede /diabetiske musemodeller, mus (6 uger gamle) fik en 60% fedt diæt (D12492, Research Diets, New Brunswick, NJ) i 10 uger som beskrevet tidligere [49-51] (tidspunkt for tumorimplantation) og fortsatte under hele tumor studier. For tumor eksperimenter blev den PAN02 og AK4.4 syngene PDAC modeller anvendes i C57BL /6 og FVB immunkompetente mus hhv. PAN02 celler (

Smad4-M174

) [52] blev opnået fra ATCC. AK4.4 celler (

KrasG12D

p53

+/-

) blev venligst stillet til rådighed af Dr. Nabeel Bardeesy på MGH. Disse celler blev isoleret fra mus genererer spontane pancreas tumorer (

Ptf1-Cre /LSL-Kras

G12D

/p53

Lox /+

) [53]. Orthotopisk pankreatiske tumorer blev genereret ved at implantere et lille stykke (1 mm

3) af levedygtigt tumorvæv (fra en kilde tumor i et separat donordyret) ind bugspytkirtlen af ​​mandlige lean eller fede FVB (AK4.4 model) eller C57BL /6 (PAN02 model) mus. Begge tumormodeller anvendte bekræftet af IDEXX Laboratories. (PAN02: IDEXX Radil Case # 22.366-2013 AK4.4:. IDEXX Radil Case # 27.818-2014).

Bugspytkirtelkræft tumorvækst undersøgelser

På 7 dage efter implantation, mus bærende ortotopisk PAN02 eller AK4.4 pancreas tumorer blev randomiseret til kontrol eller metformin behandlingsgrupper. På dag 21 blev plasma og tumor prøver indsamlet, og tumorer blev vejet og behandlet til yderligere analyse.

Metformin behandling

standard dosis af metformin til behandling af mennesker er 1000-2500 mg, normalt to gange dagligt. I den foreliggende undersøgelse blev metformin ved 300 mg /kg i drikkevand. Dette kan omregnes til den humane ækvivalent dosis ved hjælp af Reagan-Shaw metoden [54]. Ifølge formlen for den humane ækvivalent dosis [(mg /kg) = animalske dosis (mg /kg) x dyr (km) /human (km). Km for en 60 kg voksne mennesker er lig 37 og for en 20 g mus lig med 3], det humane ækvivalent af murin dosis på 300 mg /kg er 1459 mg for en gennemsnitlig størrelse voksen på 60 kg menneske. Derfor er den valgte dosis i den foreliggende undersøgelse er inden for sikker terapeutiske område konstateret hos mennesker. Den foreliggende undersøgelse den terapeutiske periode at være 2 uger for at evaluere antitumorvirkningen af ​​metformin. Dette var i overensstemmelse med de terapeutiske perioder rapporteret i tidligere studier [55, 56]. Frisk metformin blev administreret i drikkevandet hver 3 dage. Det tilføjes hvert dyr bur blev beregnet på grundlag af gennemsnitlige daglige indtag vand for at bur i en periode på 2 uger før påbegyndelse af behandlingen, og justeret hver tredje dag baseret på vandforbrug og kropsvægt af dyrene. Plasmakoncentrationen af ​​metformin omtrentlige hos patienter med type 2-diabetes tager dette lægemiddel er 0,05 mM, selv om det kan ophobes i væv og nå højere koncentrationer lokalt [35]. For

in vitro

eksperimenter, en række koncentration 0,05-25 mM afhængig af den cellelinje anvendt (se nedenfor for flere detaljer).

Effekt af metformin på kvikskrankerne og makrofager

in vitro

Standard MTT-analyser blev udført på kvikskranker og makrofager behandlet med metformin i en række 0.05-25mM, at undersøge de potentielle virkninger på cellernes levedygtighed. RAW 264,7 (muse leukæmiske monocyt-makrofager) blev opnået fra ATCC og anvendes til at vurdere effekten af ​​metformin på makrofager

in vitro

. Celler blev podet i 10 cm

2 petriskåle i serum /serumfrit medium og behandlet med metformin i 48 timer ved koncentrationer området fra 0,05 til 0,4 mM (koncentrationer, som ikke væsentligt påvirker cellernes levedygtighed). Efter behandling blev celler opsamlet til RNA og protein-ekstraktion for at udføre efterfølgende analyse af genekspression af cytokiner og polarisering markører, og til analyse af signalering og metaboliske pathways. Humane PSC blev podet i 10 cm

2 petriskåle i medier med 2,5% serum og behandlet med metformin i 48 timer ved koncentrationer fra 0,1 til 10 mM. Celler blev indsamlet til proteinekstraktion til analyse af aktiveringen af ​​fibrose-relaterede veje. Derudover blev PSC’er podet i en 8-brønds kammer slide (20.000 celler /brønd), behandlet med metformin (1 mM, en koncentration, der ikke påvirker cellelevedygtighed) i 48 timer, og immunfluorescensfarvning blev udført ifølge standardprotokoller. Cellerne blev fikseret med 4% paraformaldehyd og blokeret med 5% normalt donkey serum i 1 time. De blev inkuberet med de udpegede primære antistoffer natten over ved 4 ° C, derefter i 2 timer med de passende sekundære antistoffer ved stuetemperatur. PBS blev anvendt til alle vaske, og de farvede prøver blev monteret med Prolong guld med DAPI. Billederne blev optaget ved anvendelse af et konfokalt mikroskop. Antistofferne anvendt og indstillinger billedoptagelse er beskrevet nedenfor. Begge celletyper blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (Sigma, St. Louis, MO) suppleret med 5% (v /v) varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS, Sigma), 100 enheder /ml penicillin og streptomycin. Celler blev dyrket ved 37 ° C i en fugtig atmosfære med 5% CO

2

humane prøver Salg

Humane prøver af pancreascancer blev opnået fra MGH væv repository (http:. //www.massgeneral.org/research/resourcelab.aspx?id=31) under et aktivt IRB protokol (Partners Healthcare IRB godkendelsesnummer: 2013P001969). Skriftligt informeret samtykke fra donor eller de pårørende blev opnået for brugen af ​​disse prøver til forskningsformål. Tumorer udvalgte modtog ingen kemoterapi eller strålebehandling før den kirurgiske prøve blev opsamlet på tidspunktet for tumor resektion. I alt 28 prøver blev tilfældigt udvalgt fra denne delmængde af prøver. Body mass index blev opnået for den pågældende prøve. 7 af prøverne (25%) svarer til patienter, der var medicinerede med metformin på tidspunktet for resektion. Paraffinsnit blev farvet for collagen-I og HA som beskrevet nedenfor. Billeder blev erhvervet ved hjælp konfokal mikroskopi og kvantificeres ved hjælp af Matlab. Data blev analyseret anonymt.

Gene Expression

Umiddelbart efter excision, tumorvæv var lynfrosset og opbevaret i flydende nitrogen. Totalt RNA blev ekstraheret og relativ genekspression af makrofag M1 /​​M2 markører blev bestemt ved anvendelse af et Sybr-grøn baseret standardprotokol. Derudover blev totalt RNA ekstraheret, og relativ genekspression blev bestemt under anvendelse RT2 Profiler PCR Arrays systemet (Qiagen) på en Stratagene Mx3000P QPCR System ved hjælp foruddefineret forløb-fokuserede arrays ( “Fibrose” -cat nummer:. PAMM011Z; “Epithelial til Mesenchymale Transition (EMT) “- Kat Antal:. PAMM090Z” TGF-ß signalering mål “-PAMM235Z” ekstracellulær matrix adhæsionsmolekyler:; fælles cytokiner “-cat nummer: PAMM021Z” -cat nummer PAMM013Z og. “. ).

protein Expression

Western blot-analyse.

Hver tumor prøve blev homogeniseret direkte i lysisbuffer for protein udvinding. 20 ug af denatureret protein per prøve blev sat på 7%, 10% og 12% SDS-polyacrylamidgeler. Antistoffer anvendt: phospho-p38 MAPKT

180 /Y182 og p38; phospho-JNK (SAPK /JNK)

Thr183 /Tyr185 og JNK; phospho-AKT

Ser473 og AKT, phospho-ERK (P44 /42 MAPK)

T202 /Y204 og ERK; phospho-NF-KB

Ser536 og NK-KB; p65

Ser536; phospho-Smad2

Ser465 /467 og Smad2; phospho-IGF-I receptor ß

Tyr1135 og IGF; Phospho-IRS-1

Ser612 og IRS; IR; phpspho-STAT3

Tyr705 og STAT3; Phospho-AMPKα

Thr172 og Ampkα; phospho-Ampkβ

Ser108 og AMPK; phospho-ACC

Ser79 og ACC; Phospho-PDGF receptor ß

Tyr751 og PDGF receptor ß og snegl, e-cadherin og vimentin, TGF-ß, ß-catenin, twist, LC3B. Alle antistoffer, der er anført ovenfor blev opnået fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA), og fortyndet 1: 1000 med undtagelse af phospho-JNK (SAPK /JNK)

Thr183 /Tyr185, Phospho-NF-KB p65

Ser536 , phospho-Smad2

Ser465 /467, phospho-IGF-I receptor ß

Tyr1135, kløvet caspase-3, phospho-IRS-1

Ser612. Andre anvendte antistoffer var: αSMA og phospho-insulinreceptoren

Y972 (1: 1000 og 1: 500, Abcam, MA); col-1 (1: 1000); MMP-9 og MMP-2 (1: 500 og 1: 200, EMD Millipore-Billerica, MA), AT1 (1: 1000, LifeSpan BioSciences Inc, WA), ZEB1 (1: 1000, Novus Biologicals, CO), og ß-actin (1: 5000, Sigma, MO). Kvantificering af proteinekspression i forhold til den samlede receptor eller ß-actin blev opnået under anvendelse Billede J software.

Multiplex array.

Hver tumor prøve blev homogeniseret direkte i lysepuffer for protein ekstraktion. 2 ug /ul prøve blev anvendt. En multiplex inflammatorisk multiple cytokiner proteinarray blev anvendt (V-PLEX proinflammatoriske Panel1 mus kit, kat nummer:. K15048D). Til ELISA-analyse

Immunofluorescens /Immunhistokemi

Til analyse af frosne snit af mus tumorvæv, blev tumorerne skåret ud og nedfrosset i optimal skæring temperatur forbindelse (Tissue-Tek). Tværgående tumorsnit, 10 um tykke, blev immunfarvet med specifikke antistoffer. For at opnå mosaik billeder af tumor sektioner, blev et Olympus FV1000 konfokal laser-scanning mikroskop anvendes. En 10x luft mål erhvervet 1260 um kvadratiske felter, og et automatiseret stadium scannes gennem hele tværsnittet af tumorvæv. De afbildede fliser blev syet ind i en afsluttende mosaik billede ved hjælp Olympus software. Antigen-ekspression blev kvantificeret ved at måle arealet pletten af ​​interesse normaliseret med arealet af DAPI-farvede kerner (dvs. uden enhed), og analyseret ved hjælp af en brugerdefineret algoritme i MATLAB (The MathWorks). Identiske indstillinger og tærskler for analyse blev anvendt til alle tumorer. Antistoffer anvendt til immunfluorescens var følgende: Collagen-I [LF-68-antistof, 1:50, leveret af Dr. Larry Fisher (NIDCR)]; Hyaluronan (biotinyleret hyaluronan proteoglycan fragment, 385.911, Calbiochem, 1: 200 fortynding); αSMA (C6198-antistof, Sigma, 1: 500 fortynding); og F4 /80 (MCA497A488 antistof, ABDserotec, 1: 200 fortynding). Cy3-, Cy5- eller FITC-konjugerede sekundære antistoffer blev anvendt til detektion af signaler ved konfokal mikroskopi. Slides blev modfarvet med DAPI for nuklear farvning.

MMP aktivitet assay

Hver tumor prøve blev homogeniseret direkte i lysisbuffer for protein udvinding. En standard kommerciel assay (Abcam ab112146) blev anvendt til at detektere den generelle aktivitet af MMP’er i tumorprøverne. Tumorlysater blev inkuberet med et fluorescerende substrat [fluorescensresonansenergioverførsel (FRET) peptid] for 1, 2, og 16 timer, og fluorescens blev målt under anvendelse af et fluorescerende mikropladelæser.

Flowcytometri

Tumor-bærende mus blev perfunderet gennem intrakardial injektion af PBS og aflivet. Pancreas-tumorvæv blev høstet, hakket, og fordøjet ved 37 ° C i 1 time med DMEM indeholdende collagenase typen 1A (1,5 mg /ml), hyaluronidase (1,5 mg /ml) og DNase (2 ug /ml). De fordøjelse blandinger blev filtreret gennem 70 um celle filtre. Encellede suspensioner blev inkuberet med rotte-anti-muse CD16 /CD32 mAb til blokering og farvet med fluorochrom-konjugerede antistoffer i kold buffer (1% BSA, 0,1% NaN3 i PBS). 7-amino-actinomycin D (7AAD) reagens (eBioscience) blev tilsat til de farvede rør pr fabrikantens anvisninger umiddelbart før kører flow analyse. Flowcytometri data blev opnået på en LSRII flowcytometer (Becton Dickinson) og blev analyseret med FACSDiva software. FSC-A vs. FSC-W og SSC-A versus SSC-W blev anvendt til at diskriminere de dublet /aggregerede begivenheder. De følgende monoklonale anti-muse antistoffer blev anvendt: CD45-PE, CD45-PE-Cy7, CD45-FITC, CD11-APC-Cy7, CD11b-APC, F4 /80-APC (BD Biosciences) og F4 /80-FITC og F4 /80-PE (eBioscience).

makrofag isolation

efter skæring tumorvævet i stykker på 0,5 mm i diameter, tumorer blev dissocieret med collagenase og hyaluronidase i en time. Dissocierede tumorer blev vasket med sortering puffer (0,5% BSA i PBS) og ledes gennem celle sier, før de blev blokeret af Fcr og efterfølgende inkuberet med en F4 /80 biotinyleret primært antistof (eBiosciences) i 15 min. Anti-biotin konjugerede magnetiske perler (Miltenyl Biotech) blev tilsat til cellesuspensionen og inkuberet i 15 minutter før udsættelse af cellerne for magnetiske søjler (MACS LS-kolonner fra Miltenyl Biotech) til celleseparation.

Statistisk analyse

statistiske forskelle mellem grupper blev vurderet ved en to-halet Student t-test. To-vejs variansanalyse blev anvendt ved sammenligning kropsvægt over tid mellem betjeningsorganet og metformin-behandlede grupper. Forekomsten af ​​metastase og væg invasion blev analyseret under anvendelse chi-square. Alle statistiske analyser blev udført ved anvendelse af Prism Graphpad software. Alle resultater blev betragtet som statistisk signifikant, når P-værdien var mindre end 0,05, når beregnet med den passende statistisk test. Resultaterne er præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse.

Resultater

Metformin reducerer desmoplasia i mus og menneskelige PDACs

Vi har vist, at reduktionen af ​​desmoplasia-sænkende ECM komponenter sådanne som HA og collagen-i-i PDACs potenserer anti-tumor-behandlinger [41-43]. Derfor undersøgte vi sammenhængen mellem metformin behandling og desmoplasia i PDACs i kemo /strålebehandling naive PDAC kirurgiske prøver. Vi fandt, at i overvægtige eller fede patienter i behandling med metformin, niveauer af HA var 30% lavere end hos patienter, der ikke tager metformin (Fig 1i og 1ii). Interessant nok blev ingen forskel i HA-niveauer observeret i metformin behandlede patienter med normal vægt. På den anden side, behandling med metformin syntes at have nogen indvirkning på kollagen-I-ekspression i enten kropsvægt gruppe (S1 Fig).

(i) Repræsentative histologiske billeder, der viser effekten af ​​metformin på tumor hyaluronanbindende niveauer i normal vægt [Body mass index (BMI) 25)] eller overvægtige /fede patienter (BMI 25) (n = 22 kontroller, 7 metformin). (Ii) Immunohistokemisk analyse af totale tumor hyaluronanbindende niveauer. Metformin nedsætter hyaluronan-positive fraktion område (%) i overvægtige /fede patienter. Data er præsenteret som middelværdi ± standardafvigelse. * P 0.05 vs. kontrol hos patienter med BMI . 25

For at vurdere, om vi kunne rekapitulere disse resultater i prækliniske modeller, vi brugte FVB og C57BL /6 mus fodret med en kost med højt fedtindhold . Vi, sammen med andre har vist, at en kost med højt fedtindhold inducerer fedme og metaboliske abnormaliteter typiske for DM2, høj glucose, insulin og IGF-1 [50, 57-60] i disse stammer. Efter 10 uger på kosten med højt fedtindhold, AK4.4 og PAN02 tumorer blev orthotopisk implanteret i fede FVB og C57BL /6-mus, henholdsvis. Dyrene blev randomiseret til metformin i drikkevand (300 mg /kg) eller ingen behandling på dag 7 indtil dag 21, når plasma og tumorer blev opsamlet. Behandling med metformin korreleret med reduceret ekspression af HA med 64% (fig 2AI og 2Aii) og af collagen-I med 35% (fig 2AI og 2Aiii) i AK4.4. tumorer. Endvidere procentdelen af ​​aktiverede PSC’er (som bestemt ved ekspression af a-glat muskel-antigen, αSMA) at co-udtrykker HA og kollagen-I faldt med 58 og 38%, henholdsvis (fig 2Bi-2Biii). I et andet, mindre desmoplastiske model (PAN02), metformin faldt udtryk for HA med 40% og af kollagen-I med 22%, selv om det ikke nåede statistisk signifikans (S2i-S2iii Fig). Alligevel metformin signifikant reduceret tætheden af ​​collagen-I-positive aktiverede PSC’er i tumorer med 54% i denne model (S2V Fig). Tætheden af ​​HA positive aktiverede PSC’er i PAN02 tumorer blev også reduceret med 57% (S2iv Fig), men nåede ikke signifikans. Vi har tidligere vist, at angiotensin-II receptor 1 (AT1) er kritisk for HA og kollagen-I produktion i PDACs [43]. Faktisk bemærkede vi, at metformin var i stand til at reducere ekspressionen af ​​AT1 (Fig 2C). Tilsammen indikerer disse data, at metformin reducerer desmoplasia i PDACs i overvægtige /fede værter.

Efter 10 ugers fedtrig kost, AK4.4 tumorer blev orthotopisk implanteret i fede FVB mus. Dyr blev randomiseret til metformin i drikkevand (300 mg /kg) eller ingen behandling på dag 7 indtil dag 21, når tumorer blev opsamlet. (A-i) Repræsentative immunhistokemi billeder, der viser effekten af ​​metformin på tumor hyaluronan og kollagen-I-niveauer i AK4.4 tumorer (n = 3-4). (A-II) Kvantificering af hyaluronan ekspression i AK4.4 tumorer. Metformin nedsætter hyaluronan-positive fraktion område (%). (A-iii) Kvantificering af collagen-I-ekspression i AK4.4 tumorer. Metformin nedsætter collagen-I-positive fraktion område (%). (Bi) Repræsentative immunhistokemi billeder viser effekten af ​​metformin på udtryk (co-lokalisering) af hyaluronanbindende og kollagen-I-niveauer i aktiverede (αSMA-positive) pancreas stjemeformige celler (PSC) i AK4.4 tumorer (n = 3-4) . (B-ii) Kvantificering af hyaluronan ekspression i PSC. Metformin nedsætter procentdelen af ​​aktiverede PSC’er udtrykker hyaluronan. (B-iii) Kvantificering af collagen-I-ekspression i PSC. Metformin nedsætter procentdelen af ​​aktiverede PSC’er udtrykker kollagen-I. (C-i) Repræsentative Western blots for angiotensin-II-receptor-1 (AT1) ekspression i AK4.4 tumorer. ß-actin anvendt som kontrol for protein loading. (C-ii) Densitometrisk analyse af AT1 udtryk normaliseret til ß-actin. Metformin nedsætter ekspressionen af ​​AT1. Data er præsenteret som middelværdi ± standardafvigelse. * P 0,05 vs. kontrol.

Metformin påvirker desmoplasia ved direkte reduktion af TGF-β-signalering og produktionen af ​​kollagen-I /HA af kvikskranker

Collagen-I og HA er hovedsageligt produceret af aktiverede kvikskranker i PDACs [43, 61]. At afgøre, om metformin behandling direkte kan reducere kollagen-I /HA udtryk i kvikskranker, vi inkuberes kvikskranker

in vitro

med metformin. Vi fandt, at, ved en dosis (1 mM), der ikke i væsentlig grad påvirker levedygtigheden af ​​kvikskranker (S3 Fig), metformin faldt udtryk for HA og collagen-I (fig 3AI-3Aiii). Dette indikerer metformin virker på kvikskrankerne til at reducere produktionen af ​​disse kritiske ECM komponenter. Desuden fandt vi, at metformin (0.1-1mM) reduceret ekspression af AT1, TGF-β og nedstrøms signalering via SMAD-2, samt PDGF-β, alle centrale aktører i ECM produktion af kvikskranker (Fig 3B). Derudover metformin påvirkede også aktiveringen af ​​kanoniske signalveje, der fremmer PSC aktivering og fibrose [62], særlig ERK, p38, og STAT3, selvom ved relativt højere doser (1-10 mM) (figur 3B). Vigtigere er det, i hele tumorer, metformin faldt aktivering af STAT3 i begge modeller, med en tendens til reduceret p38 aktivering i PAN02 (S4i-S4iii Fig), tyder på, at metformin kan ophobes i koncentrationer høje nok til at påvirke disse signalveje

in vivo

. Tilsammen indikerer disse data, at metformin påvirker desmoplasia ved direkte reduktion af AT1 /TGF-β /STAT3 signalering og produktionen af ​​kollagen-I /HA af kvikskrankerne.

(A) kvikskranker blev inkuberet

in vitro

med metformin (1 mM) i 48 timer. (A-i) Repræsentative immuncytokemi billeder, der viser effekten af ​​metformin på tumor hyaluronan og kollagen-I-niveauer i humane pancreas stjerneformige celler (PSC)

in vitro

(n = 2). (A-II) Kvantificering af hyaluronan ekspression i PSC. Metformin nedsætter ekspressionen af ​​hyaluronan i kvikskrankerne. (A-iii) Kvantificering af ekspressionen af ​​collagen-I i PSC. Metformin nedsætter ekspression af collagen-I i PSC. αSMA betegner aktiverede PSC’er. (B) Repræsentative Western blots til ekspression af fibrose-relaterede markører og signalproteiner i PSC’er behandlet med metformin ved 0, 0,1, 1 og 10 mM. Metformin nedsætter ekspressionen af ​​fibrose-relaterede markører, signalpaneler proteiner i kvikskranker. Densitometrisk analyse af proteinekspression normaliseret til ß-actin eller totalt protein (i tilfælde af phosphorylerede proteiner) er afbildet som Tallene under repræsentative bands. Data i A er vist som middelværdi ± standardafvigelse. * P 0,05 vs. kontrol.

Metformin forbedrer også desmoplasia ved at forhindre rekruttering og M2 polarisering af makrofager i PDACs

betændelse, der opstår i PDACs er en vigtig del af desmoplasia [63]. Især tumorassocierede makrofager (TAM’er) er en vigtig kilde til cytokiner, der forværrer desmoplasia i PDACs [64] og negativt påvirker sygdom udfald [65]. Derfor bestemte vi her effekten af ​​metformin på TAM infiltration i tumorer. Vi fandt, at TAM niveauer var 60% lavere med metformin behandling i AK4.4 model (figur 4A). De havde en tendens også at være lavere (~ 30%, ikke signifikant) i PAN02 model (S5A Fig). For at bestemme en direkte effekt af metformin på makrofager, vi inkuberes makrofager med metformin

in vitro

for 48 timer ved stigende koncentrationer. Vi fandt, at metformin påvirkede levedygtigheden af ​​makrofager i doser på 0,4 mM eller højere (S6 Fig). Metformin i en koncentration på 0,05 mM (svarende til koncentrationen målt i plasma fra patienter, der tager metformin) reducerede M2 ​​markører, såsom Arg-1 og IL-10, mens metformin ved doser højere end 0,2 mM reduceret både M1 og M2 markører (Fig 4B ). I flow-sorteres TAM’er fra PAN02 tumorer

in vivo

, vi faktisk bekræftet en effekt af metformin på ekspressionen af ​​M2 markører Arg-1 (~ 1/2) og IL-10 (~ 2/3) uden væsentlig påvirkning af ekspressionen af ​​M1 markører (fig 4C). Vi derefter forsøgt at forstå, hvordan metformin påvirker disse celler. Adskillige kanoniske og ikke-kanoniske signaleringsveje kan aktiveres i PDACs under inflammation og fremme ekspression af M2 markører på TAMer [66-69]. I overensstemmelse med virkningerne på TAMs, metformin reduceret aktivering af STAT3, JNK, AKT og p38 i makrofager

in vitro

ved koncentrationer lavere end 0,2 mM (figur 4D). Som nævnt ovenfor, i hele tumorer metformin faldt aktivering af STAT3 i begge modeller, med en tendens til reduceret aktivering af p38 i PAN02, i tråd med vores

in vitro

resultater (S4i-S4iii Fig). Det er blevet vist, at STAT3-aktivitet falder med metformin via aktivering af metabolisk energi sensor AMP-aktiveret protein kinase (AMPK) i multiple celletyper [70]. Faktisk fandt vi, at de inhiberende virkninger af metformin på STAT3 signalering i makrofager

in vitro

associeret med aktivering af AMPKα og nedstrøms enzym Acetyl-CoA-carboxylase (ACC) (sidstnævnte kun tydelig i serum tilsat medie) i disse celler (fig 4D og S7 fig). Taget sammen indikerer disse data, at metformin reducerer TAM infiltration samt ekspression af M2 markører, som kan være medieret i det mindste delvist via AMPK /STAT3 signalhæmning i makrofager. Desuden er inflammation i tumorer kendetegnet ved et overskud af inflammatoriske cytokiner, der fremmer desmoplasia, og metformin er blevet vist at påvirke flere inflammatoriske mediatorer [34, 35]. 0,05, ** p * P * P 0,05, ** p