PLoS ONE: DNA hypometylering Påvirker kræftrelaterede biologiske funktioner og Gener Relevante i neuroblastom Pathogenesis

Abstrakt

neuroblastom (NB) patogenese er blevet rapporteret at være tæt forbundet med en række genetiske ændringer. Men underliggende DNA methylering mønstre er ikke blevet grundigt undersøgt i denne udviklingsmæssige malignitet. Her, genereret vi microarray-baserede DNA methylering profiler af primære neuroblastic tumorer. Stringent overvåget differentiel methylering analyser tilladt os at identificere epigenetiske ændringer karakteristiske for NB tumorer såvel som for kliniske og biologiske undertyper af NB. Vi observerede, genspecifik tab af DNA-methylering er mere udbredt end promotor hypermethylering. Bemærkelsesværdigt, sådan hypometylering påvirket kræftrelaterede biologiske funktioner og gener er relevante for NB patogenese såsom

CCND1

,

SPRR3

,

BTC

,

EGF

FGF6

. Især differentiel methylering i

CCND1

påvirkes hovedsagelig en evolutionær bevaret funktionelt relevant 3 ‘utranslaterede region, hvilket antyder, at hypometylering udenfor promotorregioner kan spille en rolle i NB patogenese. Hypermethylering målrettede gener involveret i celle udvikling og spredning såsom

RASSF1A

,

POU2F2

eller

HOXD3

, blandt andre. Resultaterne stammer fra denne undersøgelse give nye kandidat epigenetiske biomarkører forbundet med NB, samt indsigt i den molekylære patogenese af denne tumor, som indebærer en markant gen-specifikke hypometylering

Henvisning:. Mayol G, Martín-Subero JI , Ríos J, Queiros A, Kulis M, SUNOL M, et al. (2012) DNA hypometylering Påvirker kræftrelaterede biologiske funktioner og Gener Relevante i neuroblastom Patogenese. PLoS ONE 7 (11): e48401. doi: 10,1371 /journal.pone.0048401

Redaktør: Javier S. Castresana, Navarra Universitet, Spanien

Modtaget: August 7, 2012; Accepteret: 1 oktober 2012; Udgivet: November 7, 2012 |

Copyright: © 2012 Mayol et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra det spanske sundhedsministerium (Instituto de Salud Carlos III, Fondo de Investigación Sanitaria, 2007; PI070286) og spansk Society mod kræft (Asociación Española Contra el cANCER, 2007). G.M. understøttes af en bevilling på Hospital Sant Joan de Deu i Barcelona (Grant BR201102), S. G. med en donation fra NEN foreningen og J.I.M-S. undersøgelser af Epigenomics understøttes af det spanske ministerium for videnskab og innovation (Ryc kontrakt og SAF2009-08663)

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Neuroblastom (NB), den mest almindelige extrakraniel tumor af barndommen, er en kompleks udviklingsmæssig malignitet præget af talrige biologisk signifikante genetiske ændringer, der er nært forbundet med det kliniske resultat af patienterne [1]. Ud over genetiske ændringer, den komplekse og heterogene kliniske udvikling af NB i høj grad afhænger af patientens alder ved diagnose, samt kliniske fase og histopatologiske træk af tumor [1].

Altered DNA methylering mønstre har været bredt rapporteret at være en kritisk faktor i cancerudvikling og progression. Især er regional DNA hypermethylering (hyperM) af CpG øer i promotorområder af tumorsuppressorgener samt global hypometylering (hypoM) påvirker DNA gentagelser anses for at være de hyppigste kræftrelaterede epigenetiske ændringer [2], [3]. Hidtil har de fleste undersøgelser fokuseret deres opmærksomhed på den rolle og mekanismer promotor hyperM, da tab af global DNA methylering mentes at påvirke DNA gentagelser og for at være hovedsageligt involveret i strukturel-nukleare funktioner såsom kromosomal ustabilitet [2].

Selvom den genomiske profil NB er velkarakteriseret, DNA methylering ændringer er ikke blevet grundigt undersøgt i disse tumorer. Adskillige gener er blevet rapporteret som værende methyleres i NB [4] – [9], alligevel genom-dækkende DNA methylering mønster af NB er stadig meget ukendt. Formålet med den foreliggende undersøgelse var at undersøge mønsteret af epigenetiske ændringer i NB ved genomet-plan under anvendelse af DNA methylering specifikke mikroarrays. Ud over at identificere ændringer globalt forbundet med NB, vi kendetegnet DNA mønstre for methylering er forbundet med særskilte kliniske og biologiske undertyper af sygdommen. Interessant observerede vi, at genspecifik tab af DNA-methylering er mere udbredt end promotor hyperM. Sådanne hypoM påvirket kræftrelaterede biologiske funktioner og gener er relevante for NB patogenese såsom

CCND1

[10].

Materialer og metoder

Patienter og prøver

i alt 25 primære neuroblastic tumorer (NT) herunder 22 NBS 2 ganglioneuromas (GN) og 1 ganglioneuroblastom (GNB) blev anvendt til genom bred methyleringsanalyse. Desuden blev en uafhængig kohorte af 13 bemyndigede organer og 2 GN anvendes til bisulfit pyrosekventering mRNA genekspression og DNA kopital variation analyser (tabel 1 og tabel S1A). GN og GNB samt normal human føtal hjerne (FB) og binyre (AG) væv blev brugt som referenceprøver. NB risikovurdering blev defineret af Den Internationale neuroblastom Staging System (INSS) [11]. Tumorprøver blev vurderet af en patolog (M.S.), tumorer kun med 70% levedygtige tumor celleindhold blev inkluderet i undersøgelsen. DNA blev isoleret fra snap-frosne prøver ved hjælp af Cell Lysis Solution (Promega, USA) og proteinase K (Sigma, USA) efter fabrikantens protokoller

Etik erklæring:. Undersøgelsen blev godkendt af Institutional Research etiske komité (Comité Ético de Investigación Clínica, Fundación Sant Joan de Deu – CEIC-FSJD). Patienter /forældre /værger underskrev et informeret samtykke, før indsamling af prøver.

Genom-dækkende DNA methylering profilering

DNA methylering profilering blev udført ved hjælp af Infinium HumanMethylation27 BeadChip (Illumina, USA). Genomisk DNA bisulfit konvertering og hybridisering til platformen blev udført på menneskelige Genotypning Unit ved det spanske National Cancer Center (CEGEN-CNIO, Madrid, Spanien), som tidligere beskrevet. Data blev analyseret ved anvendelse af BeadStudio software (version 3, Illumina Inc, USA) [12], [13]. For hver CpG sted vi beregnet beta-værdi (βvalue), som er et kvantitativt mål for methylering af DNA i området fra 0 til helt methyleret til 1 for fuldstændigt methylerede cytosiner. Mulige kilder til biologiske og tekniske fordomme, som kan påvirke vores resultater såsom kønsspecifikke og lav kvalitet CpG’er blev udelukket fra undersøgelsen [14] – [16]. Methylering microarray data er blevet deponeret på Gene Expression Omnibus datalager (GSE39626).

Differential DNA-methylering analyse

Da der ikke er enighed strategi for differentieret methyleringsanalyse, vi brugte tre forskellige tilgange. Først blev CpG sites kategoriseret som hyperM når βvalues ​​var 0,25 i referenceprøverne og 0,75 i mindst 10% af NB prøverne, og hypoM når βvalues ​​var 0,75 i referenceprøverne og 0,25 i mindst 10% af NB prøver. Andet forskellen methylering blev defineret, som middelværdier βvalues ​​mellem NB og referenceprøver viser en absolut forskel er større end 0,25 [17]. Endelig blev en uparret t-test udføres ved hjælp af Trin Ned Permutation (SDP) [18] og False Discovery Rate (FDR) analyser [19]. Venn diagrammer blev brugt til at sammenligne lister over forskelligt denatureret CpG’er (https://www.pangloss.com/seidel/Protocols/venn.cgi) og kun dem samtidigt identificeret af alle tre klassificeringskriterier blev defineret som differentielt methylerede.

hierarkisk klyngedannelse og principal komponent analyse

Unsupervised og overvåges agglomerative hierarkisk klyngedannelse blev udført ved hjælp af Cluster Analysis værktøj fra Bead Studio (version 3, Illumina Inc, USA). Principal Component Analysis (PCA) blev udført med R (www.r-project.org) ved hjælp af FactoMineR pakke til rådighed via BioConductor.

Bisulfite pyrosekventering

For at validere DNA methylering data, bisulfit pyrosekventering ( BPS) analyse blev udført som tidligere beskrevet [20]. Kort beskrevet genomisk DNA var bisulfit omdannet hjælp EpiTect Plus omdannelse med bisulfit Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) ifølge producentens instruktioner. En efterfølgende PCR-amplifikation blev udført under anvendelse af biotinylerede primere (tabel S1B). Pyrosequencing og dataanalyse blev udført med pyrosequencer analysator PyroMark Q96 (Qiagen, Hilden, Tyskland) i overensstemmelse med producentens anvisninger.

genanalyse

For at vurdere ekspressionsniveauer af differentielt methylerede gener, børsnoterede tilgængelige udtryk microarray datasæt [21] – [23] med repræsentative NB tumor spektre blev analyseret. Rå data blev normaliseret til en z-score transformation. Parret t-test analyse tilpasset ved SDP og FDR blev udført. Gener med en statistisk signifikant differential udtryk (

s

0,01), z-score 1 i 50% af prøverne, blev anset for differentielt udtrykte

For kandidatgener, alt. RNA-isolering og genekspression kvantificering blev udført i 10 tilfælde indgår i methylering array og et uafhængigt sæt 13 NB prøver under anvendelse kvantitativ realtids polymerasekædereaktion (QRT-PCR) som tidligere beskrevet [22] (tabel S1B).

Bioinformatik annotation af differentielt methylerede gener

Database til anmærkning, Visualisering og integreret Discovery (DAVID) v6.7 (https://david.abcc.ncifcrf.gov/) blev anvendt til gen-kommentering berigelse analyse og biologisk vej kortlægning [24]. Sandsynlighed (Benjamini-Hochberg korrektion) lavere end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Differentielt methylerede gener blev klassificeret i henhold til deres kromosomale lokalisering. Sandsynlighedsfordeling analyse blev udført for at bestemme potentielle kromosom berigelse.

P

-værdi. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Promoter klassificering af differentielt methylerede gener i initiativtagere med høj (HCP), mellemliggende (ICP), lav (LCP) og blandet CpG indhold samt identifikation af Polycomb (PCG) målgener blev udført som tidligere rapporteret [14]

hypergeometrisk sandsynlighedsfordeling analyse med en sandsynlighed cut-off. 0,05, blev udført for at bestemme hyperM eller hypoM kromosom berigelse og til at bestemme promotor type og PcG-mark berigelse i forskelligt methylerede gener. Analyser blev udført med SPSS-version 15.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL).

Resultater

DNA methylering profilering og identifikation af forskelligt denatureret gener i NB

For at undersøge mønster af DNA methylering i NB, vi analyserede 22 primære NB tumorer ved hjælp af Infinium HumanMethylation27 BeadChip microarray. To GN, en GNB, samt blev normale humane FB og AG væv anvendes som referenceprøver for at identificere differentielt methylerede gener specifikke for NB.

Vi indledningsvis udføres en kvalitetskontrol af dataene fra den microarray analyse og udelukkede 3337 kønsspecifikke og lav kvalitet CpG’er. Derudover blev en NB prøve (NT18, tabel S1A) udelukkes på grund af dårlig detektion

s

-værdier.

Unsupervised Principal Component Analysis (PCA) udført på alle prøverne indgår i undersøgelsen, viste, at bemyndigede organer vise et klart adskilt DNA methylering profil sammenlignet med normale referenceprøver (FB og AG) og klinisk mindre aggressive GNB og godartet GN (figur 1A), er disse to enheder epigenetisk undistinguishable fra normale referenceprøver. For at identificere differentielt methylerede gener hos NB, blev overvågede analyser udført ved hjælp uafhængigt tre forskellige referenceprøver (FB, AG og 2 GN med en GNB). Ved at sammenligne gen-lister genereres af disse analyser var vi i stand til at identificere et fælles sæt af