PLoS ONE: Små interfererende RNA mod Transskription Factor STAT6 fører til øget kolesterol syntese i Lung Cancer Cell Lines

Abstrakt

STAT6 transskription faktor er blevet en potentiel molekyle for terapeutisk intervention, fordi det regulerer bred vifte af cellulære processer i et stort udvalg af celletyper. Selvom nogle målgener og interagerende partnere af STAT6 er blevet identificeret, skal belyses dens nøjagtige virkningsmekanisme. I denne undersøgelse har vi forsøgt yderligere at karakterisere de molekylære interaktioner, netværk og funktioner STAT6 ved profilering af mRNA-ekspression af STAT6 tavshed humane lungeceller (NCI-H460) ved anvendelse af mikroarrays. Vores analyse afslørede 273 differentielt udtrykte gener efter STAT6 nedregulering. Analyse af genekspression data med Ingenuity Pathway Analysis (IPA) software afsløret

Gen-ekspression, Cell død, Lipidmetabolisme

som de funktioner, der er forbundet med højeste karakter netværk.

Kolesterol biosyntese blev

blandt de mest berigede veje i IPA samt i PANTHER analyse. Disse resultater er blevet valideret af real-time PCR og kolesterol under anvendelse scrambled siRNA som en negativ kontrol. Lignende fund er også observeret med humant type II pulmonale alveolære epitelceller, A549. I den foreliggende undersøgelse har vi for første gang, vises det omvendte forhold af STAT6 med cholesterolbiosyntese i lungecancerceller. De nuværende resultater er potentielt betydelige at fremme forståelsen og design af lægemidler til de patologiske tilstande, hvor både STAT6 og kolesterol biosyntesen er impliceret nemlig. astma, åreforkalkning osv

Henvisning: Dubey R, Chhabra R, Saini N (2011) Små interfererende RNA mod Transskription Factor STAT6 fører til øget kolesterol syntese i Lung Cancer cellelinier. PLoS ONE 6 (12): e28509. doi: 10,1371 /journal.pone.0028509

Redaktør: Sunil K. Ahuja, South Texas Veterans Health Care System, USA

Modtaget: 9. juni 2011; Accepteret: November 9, 2011; Udgivet: December 5, 2011

Copyright: © 2011 Dubey et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne anerkende Institut for Bioteknologi (DBT) til finansiering af projektet med titlen ‘Undersøgelse af STAT6 transskription faktor i apoptose regulering ved hjælp af RNAi Technology “(GAP0047). RD blev økonomisk støttet af DBT projekt GAP0047. RC blev støttet med CSIR-Senior Research Fellowship (Rådet for videnskabelig og industriel forskning). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

STAT6 er en af ​​de syv medlemmer af familien af ​​transkriptionsfaktorer, der deltager i reguleringen af ​​genekspression når celler støde på forskellige ekstracellulære polypeptider som cytokiner, hormoner og vækstfaktorer og regulere en bred vifte af cellulære processer, herunder spredning , differentiering og apoptose [1], [2], [3], [4]. Generelt findes der ikke-phosphorylerede STAT-proteiner som latente former i cytoplasmaet. Eksponeringen cytokin fører til STAT phosphorylering af Janus-kinaser og en gang phosphoryleret dimeriseringen af ​​individuelle STAT-proteiner forekommer via deres SH2-domæner efterfulgt af vandring af funktionel STAT dimer til kernen, hvor den kan binde DNA og direkte at aktivere transkription af cytokin-responsive gener [5] [6]. Ligesom andre medlemmer af STAT familien, STAT6 spiller en dobbelt rolle signal transducer og aktivator af transkription ved enten direkte regulering af genekspression eller ved at interagere med en lang række andre transkriptionsfaktorer [7].

IL -4 og IL-13 induceret STAT6 signalering har vist sig at spille en vigtig rolle i differentieringen af ​​Th2-celler, B-celle-induceret ekspression af IgG og IgE og celleoverfladen visning af MHC klasse II og CD23 [8], [9] [10], [11]. Selvom STAT6 er primært kendt for at være forbundet med allergisk inflammation og astma, har STAT6 deregulering også været impliceret i forskellige andre sygdomme. STAT6 spiller en central rolle i T-celle hepatitis via forstærkning af ekspression af eotaxins i hepatocytter og endotelceller, og inducerer IL-5-ekspression, infiltration af eosinofiler og neutrofiler i leveren og fører til hepatitis [12]. Der er også beviser, IL-4-induceret aktivering af STAT6 er forbundet med reduceret hepatisk ekspression af TNFa samt dæmpning af liver neutrofil rekruttering og kan beskytte mod hepatisk iskæmi /reperfusionsskade [13]. STAT6 er også blevet påvist at være involveret i ciliære mechanosensation i nyre epitelcelle [14]. For nylig, IL-4 og STAT6 gen-polymorfier er også fundet forbundet med systemisk lupus erythematosus udvikling i kinesiske patienter [15]. Shum

et al

i 2006 tilvejebragt en forbindelse mellem allergisk inflammation og fedtsyre metabolisme, hvor de har vist, at en IL-4 /STAT6 reguleret gen aP2, som spiller en vigtig rolle i lipid metabolisme, er påkrævet i Th2-medieret allergisk luftvejsinflammation [16] og for nylig STAT6 har vist sig at spille en rolle i reguleringen af ​​lipid homeostase i leveren som øget lipid deposition blev observeret i STAT6 knockout-mus [17]. Ud over de ovenstående resultater, Zhang

et al

i 2006 rapporterede, at STAT6 lyddæmpning hæmmer proliferation og inducerer apoptose i tyktarmskræft HT-29 celler [4]. I en anden undersøgelse Das

et al

i 2007 fandt, at STAT6 er et konstitutivt udtrykt overlevelsesfaktor i human prostatacancer [18]. Denne effekt af STAT6 blev yderligere styrket i en undersøgelse foretaget af Cui

et al

i 2007, hvor de har vist, at ikke-phosphoryleret STAT6 transkriptionelt op regulerer COX-2-ekspression og beskytter mod apoptose i NSCLC (ikke-småcellet lungekræft ) celler [19].

Selv et par målgener og nogle interagerende partnere af STAT6 har været kendt indtil dato, de præcise mekanismer af STAT6 medieret signalering er stort set ukendt. I lyset af dette, forsøgte vi at undersøge virkningen af ​​STAT6 silencing på genom genekspressionsmønstre i NCI-H460 celler (lungekræft epitelial). De opnåede efter siRNA-medieret nedregulering af STAT6 i NCI-H460 celler resultater blev også valideret i A549 celler.

Materialer og metoder

Cell kultur og siRNA transfektion

Lunge carcinom ( NCI-H460 og A549) -celler blev opnået fra National Center for Cell Science, Pune, Indien og opretholdt i RPMI-1640 /DMEM-medium indeholdende 10% føtalt kalveserum og antibiotika (100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin) ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO

2 i luft.

til transfektion i 12-brønds plader, 1,2 x 10

5-celler blev podet per brønd og tilladt at adhærere natten over. Den følgende dag blev cellerne transficeret med 60 nM valideret siRNA (Ambion, USA) under anvendelse 4 pi Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) ifølge fabrikantens protokol. Uanset hvor angivet, blev cellerne stimuleret med 50 ng /ml rekombinant human IL-4 (BD Pharmingen, USA) i 4 timer. Cellerne blev høstet efter 24 h /48 h /72h efter transfektion og anvendt til forsøgene. Den ikke-transficeret og krypterede siRNA transficerede celler blev høstet efter 48 timer for alle forsøgene med mindre andet er angivet.

RNA-ekstraktion og Real Time PCR

Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen, CA, USA) og 2 ug af RNA blev revers transkriberet under anvendelse RevertAid ™ H Minus revers transkriptase-kit (Fermentas, USA) ifølge producentens protokol. Real time PCR blev udført ved hjælp af SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA). Resultaterne blev normaliseret med 18s rRNA. Dataene blev analyseret ved anvendelse Pfaffl metode [20]. Primersekvenserne anvendt til RT-PCR er anført i tabel S1.

Western Blotting

Celler blev trypsinbehandlet og cellepellets lyseredes med modificeret RIPA buffer {50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40, 0,25% Na deoxycholat, 1 ug /ml aprotinin, 1 ug /ml leupeptin, 1 ug /ml pepstatin, 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 1 mM natrium orthovandate, og 1 mM natriumfluorid} og holdt i is i 30 minutter. Lysatet blev centrifugeret ved 12000 rpm i 30 minutter blev supernatanten opsamlet og protein estimation udført under anvendelse af BCA-metoden. Lige store mængder protein (50 ug) blev separeret på 12% natriumdodecylsulfat – polyacrylamid-gelelektroforese (SDS-PAGE) og overført til PVDF-membran. Membranen blev blokeret med 3% skummetmælk i Tris-bufret saltvand (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,4) med 0,1% Tween-20 i 1 time og derefter inkuberet med primært antistof i 1% skummetmælk i 2 timer efterfulgt af inkubering med passende sekundært antistof (anti-muse ALP bundne eller /anti-kanin ALP bundet) i 1 time. Blots blev udviklet ved anvendelse NBT- BCIP som substrat. Lige belastning af protein blev bekræftet under anvendelse GAPDH antistof. Måling af signalintensitet på PVDF-membraner efter western blotting blev udført under anvendelse AlphaImager 3400 (Alpha Innotech Corporation, San Leandro, California). De IDV værdier beregnes som massefylde værdier af specifikke protein band /GAPDH densitetsværdier. Fold ændring i forhold til utransficerede celler blev derefter beregnet baseret på IDV værdier. Alle forsøg blev gentaget mindst tre gange; repræsentative resultater præsenteres.

Illumina Microarray

Genom bred effekt af STAT6 lyddæmpning blev undersøgt ved hjælp af Illumina microarray. To biologiske replikater af utransficerede NCI-H460-celler og NCI-H460-celler transficeret med 60nm af STAT6 siRNA (i 48 timer) blev anvendt i array eksperiment. Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen, CA, USA), renset og koncentreret under anvendelse af RNeasy MinElute Cleanup Kit (Qiagen, CA, USA) i henhold til fabrikantens protokol. Alle RNA-prøver blev testet for integritet ved gelelektroforese. Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit (Ambion, TX, USA) blev anvendt til at generere biotinylerede, amplificerede RNA. Kort fortalt blev 500 ng af total RNA revers transkriberet med en oligo (dT) primer under anvendelse ArrayScript enzym og amplificeret natten over med T7 RNA-polymerase og mærket med biotin ifølge fabrikantens protokol. Dette mærkede forstærket RNA (aRNA) blev hybridiseret til Illumina Genome-Wide Expression BeadChips (Humane Ref-6 v.3.0, Illumina, CA, USA), der repræsenterer ~43,000 menneskelige udskrifter ved 58 ° C natten over. Arrays blev inkuberet med Cy3 streptavidin og vaskes i overensstemmelse med producentens protokol. Chippen blev scannet ved hjælp af Illumina scanner (iScan) og analysen af ​​microarray data blev udført ved hjælp af Illumina Beadstudio 2.0 software. Dataene var gennemsnitlige normaliserede og de gener, som krydsede tærsklen til påvisning p-værdi ≤ 0,05 imellem prøverne og forskellen score p-værdi ≤ 0,05 blandt testprøverne blev anset for at være differentielt udtrykte gener. Arbejdet-rutediagram af dette eksperiment er angivet i figur S1. De opnåede data er blevet deponeret i NCBI s Gene Expression Omnibus [21], og er tilgængelig gennem Gene Expression Omnibus (GEO) Serie tiltrædelse nummer GSE25942 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi ? acc = GSE25942)

opfindsomhed pathway analyse (IPA)

datasæt repræsenterer gener med ændret udtryk profil afledt microarray analyser blev importeret til Ingenuity pathway Analysis Tool (IPA værktøj;. Ingenuity®Systems , Redwood City, CA, USA; https://www.ingenuity.com). I IPA, differentielt udtrykte gener kortlagt til genetiske netværk til rådighed i Ingenuity databasen og derefter klassificeret efter score.

Grundlaget for IPA-programmet består af opfindsomhed Pathway Knowledge Base (IPKB), som er afledt fra kendte funktioner og interaktioner af gener publiceret i litteraturen. , IPA Tool Således tillader at identificere biologiske netværk, globale funktioner og funktionelle veje for en bestemt datasæt. Programmet giver også betydningen værdien af ​​generne, de andre gener, med hvilke det interagerer, og hvordan produkterne af generne direkte eller indirekte virker på hinanden, herunder de ikke er involveret i microarray analyse. Netværkene er oprettet er rangeret afhængigt af antallet af betydeligt udtrykte gener, de indeholder, og også liste sygdomme, der var mest markant. Et netværk er en grafisk repræsentation af de molekylære forhold mellem molekyler. Molekyler er repræsenteret som knudepunkter, og det biologiske forhold mellem to knudepunkter er repræsenteret som en kant (linje). Alle kanter er støttes af mindst en reference fra litteraturen, fra en lærebog eller fra kanonisk information lagret i opfindsomhed Pathways Knowledge Base. Intensiteten af ​​knudepunktet farve indikerer graden af ​​op- (rød) eller ned- (grøn) regulering. Nodes vises ved hjælp af forskellige former, der repræsenterer den funktionelle gruppe af genet produkt.

PANTHER analyse

PANTHER (proteinanalyse gennem Evolutionary Relationships) Classification System er en unik ressource, der klassificerer gener ved deres funktioner, der bruger offentliggjorte videnskabelige eksperimentelle beviser og evolutionære relationer til at forudsige funktion selv i mangel af direkte eksperimentel evidens [22]. De differentielt udtrykte gener opnået efter STAT6 lyddæmpning i NCI-H460 celler blev importeret til PANTHER (https://www.pantherdb.org/), hvor antallet af gener i hver sti blev sammenlignet mod antallet af gener fra NCBI s

Homo sapiens

genom i denne pathway. Den binomialtest blev brugt til statistisk bestemme overrepræsentation af kategorier PANTHER klassificering. Bonferroni-korrigeret p-værdier 0,05 blev betragtet som signifikante.

cholesterolassay

kolesterolindholdet blev bestemt i cellerne under anvendelse cholesterol kvantificeringskit (BioVision, CA, USA) ifølge producentens anvisninger. Kort fortalt 10

6 celler blev lyseret, og lipider blev ekstraheret ved homogenisering med 200 pi chloroform: isopropanol: Triton X-100 (7: 11: 0,1). Disse lipid ekstrakter blev vakuumtørret i 30 minutter og resterne blev opløst i 200 pi kolesterol Reaction Buffer tilvejebragt med kittet. Cholesterol blev estimeret ved spektrofotometri ved λ = 570 nm i en 96 brønds plade i overensstemmelse med producentens anvisninger. De kolesteroltallet var normaliseret til mængder af totalt cellulært protein.

Promoter Analyse

For at identificere de fælles myndighedskontrol blandt de ændrede gener, gener af kolesterol biosyntesen vejen (HMGCR- 3-hydroxy 3-methylglutaryl-Coenzym A reduktase, HMGCS1- 3-hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzym A syntase 1 og IDI1- isopentenyl-diphosphat delta isomerase 1) blev udtaget til promotor-analyse. Ensembl [23] blev anvendt til at hente 5,0 kb opstrøms regioner fra transcription start sites for disse gener og transkriptionsfaktoren (r) binding i denne region blev bestemt ved anvendelse overrepræsenteret transskriptionsfaktorbindende site Prediction (OTFBS) værktøjet [24], der registrerer overrepræsenterede motiver af kendte transkriptionsfaktorer for et sæt af gener.

elektroforetiske mobilitet (EMSA)

Den elektroforetiske mobilitet shift assay blev udført som beskrevet af Shiraga

et al

. [37]. Nukleare ekstrakter fremstillet fra ikke-transficerede, siRNA-transficerede (60 nM, 48 h /72 h) og krypterede siRNA transficerede NCI-H460 celler ved hjælp NE-PER Nuclear og cytoplasmiske Extraction Reagent Kit (Pierce) ifølge producentens protokol.

Oligonucleotidsekvenserne anvendt i EMSA blev taget fra en tidligere offentliggjorte undersøgelse [25]. Dobbeltstrenget DNA blev frembragt ved at blande ækvimolære mængder af de komplementære oligonukleotider i annealing-puffer (Ambion, CA, USA). Muterede sekvens af transkriptionsfaktoren blev også anvendt til at kontrollere specificiteten af ​​bindingen af ​​transkriptionsfaktoren. Disse annealede dobbeltstrengede DNA blev mærket med [C32-P] -ATP (BRIT, Hyderabad, Indien) i nærvær af T4-polynucleotidekinase (New England Biolabs, MA, USA) ifølge producentens anvisninger. Nukleare ekstrakter (18 ug) fra utransficerede og siRNA-transficerede celler blev inkuberet i 30 min ved stuetemperatur i nærvær af reaktionsbuffer indeholdende 8 mM Tris-KCl (pH 8,0), 2 mM EDTA, 1 mM DTT, 12% glycerol , 1 mg BSA og 1 mg poly (di-dC). Enten vildtype eller muteret mærkede dobbeltstrengede oligonukleotid (40.000 cpm) blev derefter tilsat til reaktionsblandingen og inkuberes i 45 minutter ved stuetemperatur. Ved ophør af inkubation, blev prøver påsat en ikke-reducerende 6% polyacrylamidgel og elektroforesebehandlet i 0,5X TBE. Geler blev derefter tørret og udsat for phosphorimager analyser (FLA 2000, Fujifilm, Japan). De densitometriske analyser blev udført under anvendelse af AlphaImager 3400 (Alpha Innotech Corporation, San Leandro, California). Samme størrelse rektangel kasse blev trukket omkring hvert bånd og intensiteten af ​​hver blev analyseret af programmet efter fradrag af baggrunden intensitet.

Annexin-V assay

Apoptose blev vurderet af Guava nexin kit og Guava PCA-systemet (Guava Technologies, Hayward, CA, USA). Eksponeringen af ​​phosphatidylserin (PS) på celleoverfladen (forbundet med indtræden af ​​apoptose) danner grundlag af Guava nexin assayet. Den Guava nexin analysen anvender to pletter (annexin V og 7-amino actinomycin D [7-AAD]). Annexin V-PE binder til PS på celleoverfladen af ​​apoptotiske celler og 7-AAD, cellen impermeabel farvestof er en indikator for membran strukturel integritet. 7-AAD er udelukket fra levende, sunde og tidlige apoptotiske celler, men gennemsyrer sent apoptotisk og døde celler. Assayet blev udført ifølge producentens protokol og Annexin-PE-fluorescens blev analyseret ved hjælp af cytosoft software (Guava Technologies, Hayward, CA, USA). Mindst 2.000 hændelser blev talt.

Cell cyklus assay

Til analyse af cellecyklusfordeling, celler blev fikseret med iskold 70% ethanol og behandlet med 1 mg /ml RNase i 30 minutter ved 37 ° C. Cellerne blev derefter behandlet med fluorescens farvestof propidiumiodid (50 ug /ml, Sigma, USA), der binder til DNA ved indskydning mellem baserne ved 4 ° C i 30 minutter og analyseret under anvendelse flowcytometer (Guava Technologies, Hayward, California, USA ). Mindst 5.000 hændelser blev talt.

Resultater

STAT6 nedregulering hjælp STAT6 specifikt siRNA

Effekten af ​​STAT6 specifikt siRNA til nedregulere STAT6 udtryk i NCI-H460 celler var evalueret ved real time PCR for RNA-ekspression og western blotting for proteinniveauer. Som vist i fig. 1b, de RNA-niveauer faldt med 1,20 gange ved 24 h, 2,12 fold (p-værdi = 0,046) ved 48 timer og ved 1,66 gange (p-værdi = 0,05) efter 72 timer i siRNA transficerede NCI-H460-celler i sammenligning med utransficerede NCI-H460 celler. Der var ingen signifikant ændring i de ikke-transficerede celler og krypteret siRNA transficerede celler på forskellige tidspunkter. Imidlertid blev proteinniveauer af STAT6 reduceret på en tidsafhængig måde. Som vist i fig. 1a og 1b, der var 1,12 gange fald på 24 timer, 1,79 fold (p-værdi = 0,02) fald ved 48 timer og 2,40 gange (p-værdi = 0,028) reduktion på 72 timer efter transfektion af STAT6 specifikt siRNA i NCI-H460 celler i sammenligning med utransficerede NCI-H460 celler ved respektive tidspunkter. Dernæst kontrolleres ekspressionen af ​​phosphoryleret STAT6 (pSTAT6) protein, som er den aktiverede signalering form af STAT6. I konkordans med STAT6 protein niveauer blev ekspressionen af ​​pSTAT6 protein niveauer også reduceret i en tidsafhængig måde. Der var 1,13 gange fald på 24 timer, 1,85 fold (p-værdi = 0,0008) fald ved 48 timer og 2,67 gange (p-værdi = 0,001) reduktion på 72 timer efter transfektion af STAT6 specifikt siRNA i NCI-H460-celler sammenlignet med ikke-transficerede NCI -H460 celler ved respektive tidspunkter (fig. 1A og B). blev observeret Ikke væsentlige ændringer i celler transficeret med røræg siRNA (negativ kontrol) på forskellige tidspunkter.

a) western blot af STAT6 og phosphorylerede form af STAT6 (pSTAT6) protein på celleekstrakter fra utransficerede, STAT6 specifikke siRNA og krypterede siRNA transficerede NCI-H460-celler på forskellige tidspunkter som angivet. b) Graf repræsenterer gange ændring i STAT6 mRNA-niveau, STAT6-protein og pSTAT6 proteinniveauet i forhold til utransficerede NCI-H460 celler ved respektive tidspunkter. Scrambled siRNA på forskellige tidspunkter blev anvendt som en negativ kontrol. GAPDH blev anvendt som en loading kontrol for densitometrisk analyse for Western blot-analyse. MRNA niveauer var normaliseret til 18s rRNA udtryk i Real time PCR-analyse. Dataene er udtrykt som middelværdi ± S.D. af 3 uafhængige forsøg. * Angiver p-værdi 0,05 i sammenligning med utransficerede celler. ** Angiver p-værdi 0,01 i sammenligning med utransficerede celler. c).

Genome brede effekter af STAT6 silencing i NCI-H460-cellelinje ved hjælp Illumina microarray

De genekspression profiler i utransficerede NCI-H460 celler og NCI-H460 celler transficeret med STAT6 siRNA blev bestemt ved illumina mikroarray anvendelse af to biologiske replikater. Illumina vifte eksperiment identificeret 273 differentielt udtrykte gener (

187 nedreguleres og 86 opreguleret)

. Rådata blev analyseret under anvendelse Beadstudio 2.0-software. Array data var gennemsnitlige normaliserede og filtreret ved detektering af en p-værdi ≤ 0,05 og forskellen p-værdi ≤ 0,05. Listen over differentielt udtrykte gener sammen med deres fold ændringer findes i tabel S2.

Forklaring af veje og samspil mellem differentielt udtrykte gener

For at undersøge mulige biologiske interaktioner af forskelligt regulerede gener, datasæt repræsenterer gener med ændret udtryk profil afledt microarray analyser blev importeret til Ingenuity Pathway Analysis Tool.

listen over differentielt udtrykte gener analyseret af IPA afsløret 20 væsentlige netværk (tabel S3). Fig. 2a repræsenterer liste over top 5 netværk identificeret af IPA. Af disse netværk,

Gen-ekspression, Cell død, Lipidmetabolisme

var den højeste nominel netværk med 28 fokus molekyler og betydningen score på 54 (fig. 2b). Scoren er sandsynligheden for, at en samling af gener lig med eller større end antallet i et netværk kan opnås ved et tilfælde alene. En score på 3 angiver en 1/1000 chance for, at de firkantede gener er i et netværk ikke skyldes tilfældig chance. Listen over gener i dette netværk med deres respektive fold ændringer i array-data leveres i tabellen S4.

For at undersøge mulige interaktioner af forskelligt regulerede gener, datasæt, der repræsenterer 273 gener med ændret udtryk profil opnået fra Illumina microarray blev importeret til Ingenuity Pathway Analysis Tool og følgende data er illustreret: a) en liste med fem netværk med deres respektive scores opnået fra IPA b) mest højt ratede netværk i IPA analyse netværket repræsentation af de mest højt ratede netværk ( Gene Expression, celledød Lipid Metabolism). De gener, der er skraverede blev bestemt til at være af betydning fra den statistiske analyse. Generne skraverede røde opreguleres og dem, er grønne nedjusteres. Intensiteten af ​​skraveringen viser i hvilken grad hvert gen var op eller nedreguleret. En optrukket linje repræsenterer en direkte interaktion mellem de to genprodukter og en stiplet linje betyder, at der er en indirekte interaktion. Generne er markeret med blå stjerne er blevet valideret af real time PCR. Gener forbundet med Gen-ekspression, celledød og Lipid Metabolism er cirklede med orange, blå og lilla farver, hhv. c) Toxicology pathway listen i IPA-analyse. X-aksen repræsenterer toppen toksikologiske funktioner som beregnet af IPA baseret på differentielt udtrykte gener fremhæves og y-aksen er forholdet mellem antallet af gener fra datasæt, til virksomheden pathway og antallet af alle kendte gener tilskrives pathway. De gule linjer repræsenterer tærsklen til p-værdi 0,05 som beregnet af Fischers test.

IPA analysen også grupper de differentielt udtrykte gener i biologiske mekanismer, der er relateret til toksicitet grupper. I toksikologi listen,

Kolesterol biosyntese og p53 Signaling

kom ud for at være de øverste to væsentligste veje med en p-værdi på 0,011 og 0,013 henholdsvis (fig. 2c). De gener associeret med toppen tox listen er også angivet i tabel S5.

Samtidig blev differentielt udtrykt gen liste opnået efter STAT6 inaktivering i NCI-H460 celler tilføres PANTHER web-ressource til at afsløre berigede veje. Interessant i denne analyse også fandt vi kolesterol biosyntesen og apoptose signalering blandt de væsentligt beriget veje. De veje, der passerede tærsklen til p-værdi 0.05 i PANTHER analyse er anført i tabel 1.

STAT6 tavshed øger ekspression af gener, der er forbundet med kolesterol biosyntesen /homeostase og forbedrer kolesteroltallet

Da den øverste opnået i IPA-analyse var

Gen-ekspression, Cell død, Lipidmetabolisme

og kolesterol biosyntesen kom ud beriget med både IPA og PANTHER analyse vi kontrollerede ændringer i kolesterolniveau efter STAT6 silencing af siRNA i NCI-H460 celler. Scrambled siRNA blev anvendt som en negativ kontrol. Fig. 3a viser, at STAT6 lyddæmpning forøgede kolesterolniveauer på en tidsafhængig måde med 1,23 gange forøgelse på 24 timer, 1,8 fold (p-værdi = 0,005) øges ved 48 timer og 2,3 fold (p-værdi = 0,004) øges ved 72 timer efter transfektion af siRNA i NCI-H460 celler. Der blev imidlertid ikke en sådan ændring observeret i kolesterol i NCI-H460 celler transficeret med røræg siRNA. Vi opnåede også lignende resultater i A549-celler (fig. 3a). Der var 1,28 gange stigning på 24 timer, 1,6 fold stigning (p-værdi = 0,03) efter 48 timer og 2,2 gange stigning (p-værdi = 0,04) ved 72 h efter transfektion af siRNA i A549-celler, hvilket viser, at stigningen i kolesterolniveauer kunne være en generel virkning af STAT6 silencing på lungeceller.

totale cholesterolniveauer efter STAT6 knockdown blev kontrolleret på forskellige tidspunkter i NCI-H460 og A549-celler. Scrambled siRNA blev anvendt som negativ kontrol. Dataene er udtrykt som middelværdi ± S.D. af 3 uafhængige forsøg udført in triplo. * Angiver p-værdi 0,05 i sammenligning med utransficerede celler. a) Western blot-analyse blev udført for at analysere den nye ekspression af pSTAT6 protein upon IL-4 behandling i NCI-H460 celler. GAPDH blev anvendt som en loading kontrol for densitometrisk analyse. Graf repræsenterer gange ændring i proteinekspression forhold til utransficerede NCI-H460 celler. Dataene er udtrykt som middelværdi ± S.D. af 3 uafhængige forsøg. * Angiver p-værdi 0,05 i sammenligning med utransficerede celler. b) Real time PCR blev udført for at bestemme ændringer i ekspressionsniveauet for gener relateret til cholesterol biosyntese og homøostase i NCI-H460-celler og A549-celler 48 timer efter transfektion af STAT6 specifikt siRNA. Prøverne blev normaliseret til 18S rRNA-ekspression. Den tidstro data er udtrykt som middelværdi ± S.D. af 3 uafhængige forsøg udført in triplo. * Angiver p-værdi 0,05 i sammenligning med utransficerede celler. c) Kolesterol-assay blev udført for at bestemme virkningen af ​​IL-4-behandling på totale cholesterolniveauer i utransficerede og siRNA transficerede NCI-H460-celler og A549-celler. Dataene er udtrykt som middelværdi ± S.D. af 3 uafhængige forsøg udført in triplo. * Angiver p-værdi 0,05 i sammenligning med utransficerede celler. d) western blot af HMGCS1, HMGCR og IDI1 blev udført på celleekstrakter fra utransficerede og siRNA transficerede NCI-H460 celler på forskellige tidspunkter. GAPDH blev anvendt som en loading kontrol for densitometrisk analyse. Graf repræsenterer gange ændring i proteinekspression forhold til utransficerede NCI-H460 celler. Dataene er udtrykt som middelværdi ± S.D. af 3 uafhængige forsøg. * Angiver p-værdi 0,05 i forhold til utransficerede celler.

Da IL-4 er kendt for at phosphorylere STAT6, vi ønskede at se til rollen af ​​IL-4 i kolesterol syntese. I NCI-H460 celler, der var 1,48 gange (p-værdi = 0,01) ændring i niveauet af pSTAT6 (phosphorylerede form af STAT6) protein efter IL-4 behandling, 0,48 fold (p-værdi = 0,01) ændring efter transfektion af STAT6 siRNA og 0,69 fold (p-værdi = 0,05) ændring når cellerne transficeret med STAT6 siRNA blev behandlet med IL-4 (fig. 3b). Svarende til dette, var der 0,8 gange (p-værdi = 0,05) ændring i kolesterolniveau efter IL-4 behandling, 1,5 gange (p-værdi = 0,01) ændring efter transfektion af STAT6 siRNA og 1,32 gange (p-værdi = 0,03) ændring, når cellerne transficeret med STAT6 siRNA blev behandlet med IL-4 (fig. 3d). Lignende resultater blev også observeret i A549-cellelinje (fig. 3d).

Vi næste søgte de differentielt udtrykte gener associeret med cholesterolbiosyntese /homøostase opnået fra microarray data. I konkordans med Illumina array-data blev Transcript niveauer af disse gener bekræftet at være opreguleret ved real time PCR. Vi observerede 1,27 fold (p-værdi = 0,03) stigning i HMGCR niveauer, som er nøglen regulerende enzym af kolesterol biosyntesevejen. Vi observerede også 1,94 gange (p-værdi = 0,03) stigning i HMGCS1, 2,7 gange stigning i IDI1, 4,2 gange (p-værdi = 0,04) stigning i CYP27B1

(cytochrom P450, familie 27, underfamilie B, polypeptid 1)

, og 3,0 gange stigning i INSIG1

(Insulin-induceret gen 1)

niveauer på 48 h efter transfektion af NCI-H460-celler med STAT6 specifikt siRNA i sammenligning med de ikke-transficerede NCI-H460-celler (fig. 3c).

tilsvarende stigning i transkriptniveauer af disse gener blev også observeret i et andet lungecancer-cellelinie, A549 (fig. 3c) hvor vi observerede 1,6 fold (p-værdi = 0,03) stigning i HMGCR niveauer, 1,4 fold stigning i HMGCS1, 1,56 gange stigning i IDI1, 2,4 gange stigning i CYP27B1, og 1,25 gange stigning i INSIG1 niveauer ved 48 h efter transfektion af A549-celler med STAT6 specifikt siRNA i sammenligning med de utransficerede A549-celler. Dette indebærer, at virkningerne af STAT6 lyddæmpning er generelle og ikke begrænset til en bestemt lungekræft cellelinje.

protein niveauer af HMGCR, HMGCS1 og IDI1 blev også undersøgt i utransficerede og siRNA transficerede NCI-H460 celler på 48 timer og 72 t efter transfektion. Der var 2,9, 3,5 (p-værdi = 0,048) og 4,3 gange stigning i HMGCS1 niveauer, 0,94, 1,8 og 2,4 (p-værdi = 0,03) fold stigning i HMGCR niveauer, 1,6, 2,4 og 2,5 (p-værdi = 0,024) fold stigning i Som vist i fig. GAPDH blev anvendt som en loading kontrol.