PLoS ONE: Jaeumganghwa-Tang fremkalder apoptose via mitokondrie Pathway og Lactobacillus Fermentation øger sin Anti-Cancer aktivitet i HT1080 Menneskelig Fibrosarcoma Cells

Abstrakt

Jaeumganghwa-tang (JGT,

Zi-yin-jiang -huo-tang

i kinesisk og

jiin-Koka-til

på japansk) er en orientalsk urte formel, der har længe været brugt som en traditionel medicin til behandling af respiratoriske og nyresygdomme. Nylige undersøgelser viste, at JGT udviste potente inhiberende virkninger på allergi, inflammation, smerte, kramper, og prostatahyperplasi. Adskillige konstituerende urter i JGT fremkalde apoptotisk kræft celledød. Imidlertid har anti-cancer aktivitet af JGT ikke undersøgt. I denne undersøgelse undersøgte vi de anti-cancer effekter af JGT ved hjælp stærkt tumorigene HT1080 human fibrosarcomaceller og belyst de underliggende mekanismer. Desuden har vi undersøgt, om

Lactobacillus

fermentering af JGT styrket sin anti-cancer aktivitet ved hjælp af en

in vivo

xenograft model, fordi fermentering af urteekstrakter menes at styrke deres terapeutiske virkninger. Data, afslørede, at JGT undertrykte væksten af ​​kræftceller effektivt ved at stimulere G1 cellecyklusstandsning og derefter fremkalde apoptotisk celledød ved at forårsage skade på mitokondrier og aktivering caspaser. Phosphorylering af p38 og ERK spillede også en rolle i JGT-induceret celledød.

In vitro

forsøg viste, at JGT gæret med

Lactobacillus acidophilus

, betegnet fJGT162, fremkaldte lignende mønstre af celledød, som gjorde ikke-fermenteret JGT. I mellemtiden er den daglige orale indgivelse af 120 mg /kg fJGT162 til HT1080-bærende BALB /c nøgne mus undertrykkes tumorvækst drastisk (op til 90%) sammenlignet med saltvand behandling, hvorimod indgivelse af ikke-fermenteret JGT undertrykte tumorvækst med ~ 70 %. Kollektivt, disse resultater tyder på, at JGT og fJGT162 er sikre og nyttige komplementær og alternativ anti-cancer urte behandlinger, og at

Lactobacillus

gæring forbedrer

in vivo

anti-cancer effekt af JGT betydeligt.

Henvisning: Kim A, Im M, Hwang YH, Yang HJ, Ma JY (2015) Jaeumganghwa-Tang fremkalder apoptose via mitokondrie Pathway og

Lactobacillus

Fermentation øger sin Anti-Cancer aktivitet i HT1080 human fibrosarcomceller. PLoS ONE 10 (5): e0127898. doi: 10,1371 /journal.pone.0127898

Academic Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, UNITED STATES

Modtaget: Februar 25, 2015; Accepteret: April 21, 2015; Udgivet: 28. maj 2015

Copyright: © 2015 Kim et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde er blevet støttet af Grant K15280 tildelt Sydkorea Institut for orientalsk medicin (kiom) fra Ministeriet for Videnskab, IKT og fremtidig planlægning (MSIP), Republikken Korea

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

i de senere år har traditionel kinesisk medicin (TCM) fået stigende opmærksomhed som en ressource for lægemiddelforskning. Fordi TCM-baserede urteekstrakter er generelt lav i omkostninger og udviser lidt toksicitet eller bivirkninger i klinisk praksis, er de blevet anvendt som alternativ medicin til at behandle en bred vifte af menneskelige sygdomme, herunder kræft, i Kina, Japan, Korea og andre asiatiske lande [1-4]. I TCM, er urter anvendes i kombination som formler, der antages at forbedre deres terapeutiske effektivitet og reducere bivirkninger samtidigt. For eksempel Ka-mi-KAE-kyuk-tang (KMKKT), en formel af 10 orientalske urter, har anti-angiogen, anti-metastatisk og anti-cancer aktiviteterne

in vivo

uden tydelige bivirkninger [5]. Endvidere KMKKT stimulerer knoglemarven stamcelle hæmatopoiese og lindrer anti-cancer drug leukopeni bivirkninger hos mus [6,7]. Desuden Bojungbangdocktang (BJBDT), som er blevet anvendt til forebyggelse eller behandling af cancere i Korea, fungerer ved at blokere VEGF /VEGFR-aktivitet til inhibering af angiogenese i humane umbilical vene endotelceller (HUVEC’er) [8]. Det forhindrer også cisplatin-induceret toksicitet og apoptose i MCF-10A normale humane bryst epitelceller, men ikke i brystcancerceller [9]. Disse resultater antyder kraftigt, at naturmedicin har potentielt gavnlige virkninger på kræft progression og forbedre konventionel kemo- eller strålebehandling-induceret komplikationer.

fermentering af lægeurter, en nedbrydning proces medieret af mikrober eller svamp, menes at udøve gunstige virkninger på absorption, biotilgængelighed, og farmakologiske aktivitet af urteekstrakter ved at fremskynde produktionen eller ombygning af aktive komponenter i deres metabolitter eller ved at skabe lavmolekylære stoffer som aglycon fra glycosid [10,11]. Desuden har flere undersøgelser vist, at fermenteringen af ​​lægemidler urteekstrakter forbedrer deres terapeutiske virkninger. For eksempel, fermentering af

Anoectochilus formosanus

bruge

Lactobacillus acidophilus

forbedret sin anti-oxidant aktivitet ved at øge mængden af ​​den samlede phenol [12]. For nylig, vores gruppe rapporterede gavnlige virkninger af

Lactobacillus

gæring, hvor hwangryunhaedoktang (HR) og oyaksungisan (OY) udviste forbedrede anti-inflammatoriske virkninger i LPS-stimulerede RAW 264.7 celler efter fermentering [13,14]. Desuden administrationen af ​​fermenteret HR havde større inhiberende virkning på knogletab hos ovariektomerede (OVA) rotter ved at forbedre knoglemineraldensitet og knogle mikrostruktur sammenlignet med ikke-fermenteret HR [15].

Jaeumgangwha-tang ( JGT,

Zi-yin-jiang-Huo-tang

i kinesisk,

jiin-Koka-til

på japansk) er en orientalsk traditionelle plantelægemidler formel, og har længe været anvendt i Kina, Japan og Korea at nære yin og direkte ild nedad som følge af manglen på nyre vand. JGT er blevet beskrevet i Dongui Bogam, at en koreansk bog overholdt ved Heo juni (1539-1615), har farmakologiske virkninger til behandling af respiratoriske og nyresygdomme, nattesved, hoste, feber om eftermiddagen, kraftig slim, hæmoptyse, tab af appetit, spytte blod, forstoppelse, og rødmen i ansigtet. Nylige undersøgelser viste, at JGT inhiberede allergiske reaktioner, inflammation, smerte og kramper, og potenseret immunresponset [16]. Desuden JGT inhiberede udviklingen af ​​testosteron propionat (TP) -induceret benign prostatahyperplasi (BPH) dramatisk i en rottemodel [17]. JGT består af 12 lægeurter, herunder

Paeoniae Radix

,

Angelicae Gigantis Radix

,

Rehmanniae Radix Preparata

,

Atractylodis Rhizoma Alba

,

Liriopis Tuber

,

Rehmanniae Radix Crudus

,

citri Unshius Pericarpium

,

Anemarrhenae rhizoma

,

Phellodendri Cortex

,

Glycyrrhizae Radix et rhizoma

,

Zingiberis rhizoma Crudus

, og

Zizyphi Fructus

. Flere enlige urter i JGT, herunder

Angelicae Gigantis Radix

,

Asparagi Tuber

,

Anemarrhenae Rhizoma

, og

Paeoniae Radix

, fremkalde anti-cancer effekter ved at inducere apoptose [18]. Imidlertid har ingen undersøgelser endnu rapporteret anti-cancer effekter af JGT.

I denne undersøgelse undersøgte vi anti-cancer effekt af JGT i form af at fremkalde celledød og hæmme tumorvækst

in vivo

ved hjælp af meget tumorgene HT1080 humane fibrosarcomceller og belyst den detaljerede virkningsmekanisme bag sin kemoterapeutiske aktivitet. Desuden undersøgte vi, om

Lactobacillus

gæring forbedret anti-cancer effekter af JGT bruge en

in vivo

tumor xenograftmodel.

Materialer og metoder

cellelinjer

humane fibrosarcoma HT1080 celler (KCLB nr. 10121), humane prostata adenocarcinom PC-3-celler (KCLB nr. 21435), og den menneskelige gastrisk karcinom AGS celler (KCLB nr. 21739) blev opnået fra den koreanske cellelinie Bank (Seoul, Korea) og dyrket i RPMI 1640 (Cellgro, Manassas, VA, USA) suppleret med 10% (vol /vol) varmeinaktiveret kalvefosterserum (Cellgro) og penicillin (100 U /ml) /streptomycin (100 ug /ml) (Cellgro) ved 37 ° C i en fugtig 5% CO

2 incubator. Murine hepatocytter blev isoleret under anvendelse af et perfusionssystem med nogle ændringer og inkuberet som beskrevet tidligere [19].

Dyr

Fem uger gamle BALB /c nøgne mus blev købt hos Nara Biotech ( Seoul, Korea) og opstaldet under SPF-facilitet under konstante betingelser (12 timers lys-mørke cyklus ved 22 ± 1 ° C og 55 ± 5% fugtighed). Alle dyreforsøg blev godkendt af Animal Care og brug Udvalg Sydkorea Institut for orientalsk medicin (kiom, Daejeon, Sydkorea) med referencenummer # 14-040 og udføres i henhold til retningslinjerne i Animal Care og brug Udvalg på kiom.

Kemikalier og antistoffer

rhodamin 123, propidiumiodid (PI), 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI), og 3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl ) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) blev erhvervet fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). SP600125, SB203580, og PD98059 blev opnået fra Calbiochem (San Diego, CA). Antistoffer mod p21, p27, cyclin B, cyclin D, cyclin E, cyclin-afhængig kinase (CDK) 2, CDK4, CDK6, Bcl-2, XIAP, Bad, p-Bad, Bax, Bim, Bok, caspase-3, spaltet caspase-7, caspase-8, caspase-9, poly ADP ribose polymerase (PARP), p38, p-p38 (Thr180 /Tyr182), ekstracellulær reguleret kinase (ERK) 1/2, p-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204), c-Jun N-terminal kinase (JNK) og p-JNK (Thr183 /Tyr185) blev indkøbt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Anti-α-tubulin blev opnået fra Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA). Til højtydende væskekromatografi (HPLC), blev acetonitril af HPLC-kvalitet opnået fra J. T. Bakers (Philipsburg, NJ, USA) og trifluoreddikesyre (TFA) og 5-Hydroxymethylfurfural (5-HMF) blev opnået fra Sigma. Paeoniflorin og glycyrrhizin blev indkøbt fra Tokyo Chemical Industry Co. (Tokyo, Japan). Nodakenin, nodakenetin, Berberin, og palmatine blev opnået fra Faces Biokemisk Co. (Wuhan, Kina), og hesperidin blev opnået fra Korea Food and Drug Administration (KFDA, Osong, Korea).

Udarbejdelse af JGT, aJGT og fJGT162

Urter til et afkog af JGT blev købt fra Yeongcheon Oriental Herbal marked (Yeongcheon, Korea), og mængden af ​​hver urt blev opført i tabel 1. ægtheden af ​​de plantearter blev valideret af Prof. Ki Hwan Bae (Chungnam National University, Daejeon, Sydkorea), og alle kupon prøver blev deponeret i urte bank i kiom. I alt 1874,5 g hakket JGT formel var gennemvædet med 18,745 L destilleret vand, kogt i 3 timer ved hjælp af Herb Extractor (Cosmos-600 Extractor, Gyungseo Co., Korea), og derefter filtreret gennem standard test sigter (150 um, Retsch, Haan , Tyskland). Før fermentering blev afkog JGT indstillet til pH 7,0 ved anvendelse af 1 M NaOH og derefter steriliseret ved autoklavering i 15 minutter ved 121 ° C. En ren kultur af

Lactobacillus acidophilus

(KFRI162) blev opnået fra Korea Food Research Institute (KFRI) og inkuberet i MRS-medium i 24 timer ved 37 ° C som tidligere [20] beskrevne. For at forberede fJGT162, autoklaveret JGT (aJGT) tilsat med 1 × 10

8 CFU /mL

L

.

acidophilus

, og fermenteret ved 37 ° C i 48 timer. Den endelige pH af vildtype JGT, aJGT, og fJGT162 var 7,00 ± 0,00, 5,45 ± 0,01, og 3,80 ± 0,01 hhv. JGT, aJGT, og fJGT162 blev ført gennem en 60-um nylon net filter (Millipore, Bedford, MA, USA), frysetørret og opbevaret i en ekssikkator ved 4 ° C. For

in vitro

eksperimenter, det frysetørrede pulver blev opløst i 10% (v /v) DMSO i destilleret vand (DW) til en slutkoncentration på 50 mg /ml og centrifugeret ved 14.000 rpm i 10 min ; supernatanten blev derefter filtreret (0,22 um, porestørrelse).

Cell proliferationsassay og DAPI-farvning

cellerne udpladet i 96-brønds dyrkningsplader (5 × 10

3 /brønd) blev behandlet med de angivne koncentrationer i 48 timer, og MTT-assays blev udført som tidligere [21] beskrevne. For DAPI-farvning, celler dyrket og behandlet med JGT i 35 mm glasbund retter blev fikseret med 4% paraformaldehyd i 10 minutter, permeabiliseret med 0,1% Triton X-100 i 10 minutter, farvet med DAPI (0,5 ug /ml) i 10 min, og observeret under et konfokal laser scanning mikroskop (FV10i-W; Olympus Optical Co. Ltd., Tokyo, Japan).

Cell cyklus analyse

Celler i den eksponentielle vækstfase blev behandlet med 1000 ug /ml JGT for 12, 24 og 48 timer. Efter høst blev cellerne vasket to gange med iskold PBS og fikseret i iskold 70% ethanol ved -20 ° C i mindst 24 timer. De fikserede celler blev vasket to gange med iskold PBS, og intracellulært DNA blev farvet ved anvendelse PI-opløsning (0,1% Triton X-100, 0,1 mM EDTA, 50 ug /ml RNase A, 50 ug /ml PI i PBS) ved 4 ° C i 30 minutter i mørke. Fordelingen cellecyklus blev analyseret ved anvendelse FACSCalibur flowcytometri (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) og WinMDI 2.8 software (J. Trotter, Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USA).

Måling mitokondrie membranpotentiale (MMP, ΔΨ

m)

efter behandling med JGT (500 og 1000 ug /ml) i 24 og 48 timer blev cellerne vasket to gange med PBS og derefter inkuberet med rhodamin 123 fluorescens farvestof på en slutkoncentration på 5 uM ved 37 ° C i 30 minutter. Fluorescensen af ​​rhodamin 123 blev analyseret under anvendelse af et FACSCalibur flowcytometer og observeret under et fluorescensmikroskop (Olympus TH4-200; Olympus Optical Co. Ltd.). For JC-1-farvning, celler dyrket og behandlet med JGT i 35 mm glasbund retter blev farvet med JC-1 (5 ug /ml) i mørke i 10 minutter ved 37 ° C, vasket med dyrkningsmedium, og observeret under et konfokalt laserscanningsmikroskop.

Western blot-analyse

Celler blev vasket to gange med PBS og hele cellelysater blev opnået under anvendelse af M-PER pattedyrprotein Extraction Reagent (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA). Proteinkoncentrationer blev bestemt under anvendelse af bicinchoninsyre-kit (Sigma). En lige mængde protein elektroforese, immunoblottedes, og påvist som tidligere rapporteret [21].

In vivo

tumor xenograftmodel

BALB /c nøgne mus ved 6 -Uge-alder (n = 15) injiceret subkutant i maveregionen med HT1080-celler (2 x 10

6 /mus). På dag 7 efter podning med tumoren, når tumorerne nåede til et rumfang på ~ 100 mm

3, blev musene tilfældigt inddelt i tre grupper (n = 5 pr gruppe), og dagligt administreret med saltvand (kontrol), aJGT (120 mg /kg), eller fJGT162 (120 mg /kg) i et volumen på 100 pi i 14 dage. Den indgivne dosis for mus blev beregnet ud fra den anvendte mængde i humane voksne (37,49 g /60 kg legemsvægt /dag), og udbyttet af pulveriseret ekstrakt (39.74% i aJGT og 39.53% i fJGT162). Musene blev observeret for grov udseende og opførsel, og deres kropsvægte blev målt dagligt. På dag 21 blev mus aflivet ved intraperitoneal injektion af en blanding af Zoletil (Virbac, Magny-en-Vexin, Frankrig) og Rompun (Bayer, Seoul, Korea) (2: 1, 200 pi), og derefter tumorer blev udskåret for måling af deres vægt.

Sikkerhedsvurdering af aJGT og fJGT162

for at evaluere sikkerheden af ​​aJGT og fJGT162, 6 uger gamle BALB /c nøgne mus (n = 3 pr gruppe) blev fodret køretøj (saltvand), aJGT (120 mg /kg), eller fJGT162 (120 mg /kg) dagligt i 14 dage forsøgsperioden. Gross udseende og opførsel af mus blev dagligt kontrolleret og deres legemsvægt blev målt hver anden dag. På dag 14 blev musene aflivet, og vægte af større organer blev målt. Samlede fuldblod og serumprøver blev analyseret for hæmatologiske og serologiske parametre ved hjælp ADVIA 2120i hæmatologi-system (Siemens Healthcare Diagnostics, Tarrytown, NY) og XL 200 (Erba Diagnostics Mannheim, Tyskland), henholdsvis.

Chromatografisk analyse af JGT , aJGT, og fJGT162

for at sammenligne de fytokemiske profiler af JGT, aJGT, og fJGT162, blev HPLC udført med en HPLC-DAD maskine (LaChrom Elite, Hitach High-Technologies Co, Tokyo, Japan) som beskrevet tidligere med visse ændringer [22]. Kromatografisk separation blev opnået ved anvendelse af en Phenomenex Luca C

18 søjle (4,6 mm x 250 mm, 5 um). En gradienteluering ved anvendelse af 0,1% TFA i deioniseret vand (A) og acetonitril (B) blev udført som følger: 0-5 min med 5% B, 5-15 min med 5-12% B, 15-25 min med 12% B, 25-65 min med 12-50% B, og 65-70 min med 50-50% B. strømningshastigheden og injektionsvolumen blev 1 ml /min og 10 pi henholdsvis og HPLC-kromatogrammer blev opnået ved anvendelse UV ved 190-400 nm. Standard (5-125 pg /ml) og prøveopløsninger (20 mg /ml) blev opløst og fortyndet i methanol.

Statistisk analyse

Data er præsenteret som middelværdi ± standardafvigelse (SD) . Forskelle mellem grupper blev analyseret under anvendelse af Students

t

-test med SigmaPlot 8.0 software (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). En

s

-værdi 0,05 blev anset for at indikere en signifikant forskel.

Resultater

JGT formindsker levedygtighed og inducerer G

1 cellecyklusstop i HT1080 celler

For at undersøge anti-cancer effekt af JGT og belyse de detaljerede mekanismer i sin kemoterapeutiske aktivitet, brugte vi meget tumorigen HT1080 human fibrosarkom cellelinje. Vi først undersøgt virkningerne af JGT på cellevækst ved hjælp MTT-assays efter behandling med 25-1000 pg /mL JGT i 48 timer. Som vist i figur 1A, behandling med 500 og 1000 mikrogram /ml JGT nedsat levedygtighed HT1080 celle markant og induceret fleste celler til at skrumpe og runde op, hvilket er et typisk træk ved apoptose. Desuden JGT reducerede levedygtigheden af ​​humane gastriske carcinoma AGS og humant prostatacarcinom PC-3-celler på en dosis-afhængig måde, hvorimod en sammenlignelig koncentration af DMSO op til 0,2% havde ringe indflydelse på celleproliferation (S1 Fig). I modsætning hertil blev den normale hepatocytter ikke påvirkes af JGT behandling, selv efter 48 timer med 1000 ug /ml, i form af celleproliferation eller morfologisk udseende, hvilket antyder, at JGT ikke hepatotoksiske (Fig 1B). Analyse af cellecyklusprogression hjælp PI-farvning viste, at JGT behandling i 12 og 24 timer forøgede andelen af ​​celler i G

1 fase til 38.49 og 44.71%, sammenlignet med ubehandlede kontrolceller (33,22%). Antallet af apoptotiske celler i subG

0 /G

1 fase blev betydeligt forøget med JGT til 4,99 og 9,49% efter behandling i 24 og 48 timer, sammenlignet med ubehandlede kontrolceller (1,13%), hvilket tyder at JGT-medieret G

1 cellecyklusstandsning retarderet celleproliferation og derfor induceret celledød (fig 2A) som inkubationsperiode var forlænget. I overensstemmelse med dette viste Western blotting at JGT øgede niveauer af CDK-inhibitorer p21 og p27 og nedsatte niveauer af cyclin B, cyclin D, cyclin E, CDK2, CDK4 og CDK6 i HT1080 celler signifikant sammenlignet med ubehandlede kontrolceller (fig 2B ).

Humane fibrosarcoma HT1080-celler (A) og murine hepatocytter (B) blev behandlet med de angivne doser af JGT i 48 timer, og cellelevedygtighed blev bestemt under anvendelse MTT-assays. JGT-behandlede celler blev observeret under et omvendt mikroskop (40 ganges forstørrelse). Data er repræsentative for tre uafhængige forsøg udført in triplo og er udtrykt som middelværdier ± SD. *

s

0,05 over ubehandlet kontrol.

(A) HT1080-celler blev inkuberet med 1000 ug /ml JGT i 12, 24 og 48 timer, og cellecyklusfordeling blev analyseret efter PI-farvning. (B) Niveauerne af cellecyklus-relaterede proteiner i JGT-behandlede celler blev bestemt ved Western blotting. De båndintensiteter forhold til dem for ubehandlede celler blev beregnet under anvendelse ImageJ software efter normalisering til tubulin ekspression. Data er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

JGT forårsager caspase-afhængig apoptotisk celledød i HT1080 celler ved at inducere skade på mitokondrier

For at tydeliggøre apoptotisk celledød forårsaget af JGT, vi først vurderede niveauer af apoptose-relaterede proteiner under anvendelse af Western blotting. Som vist i fig 3A, JGT reducerede ekspressionen af ​​de anti-apoptotiske proteiner bcl-2 og XIAP betydeligt, øgede niveauer af pro-apoptotisk Bad, Bax, Bim, og Bok, og induceret spaltning af caspase-3, -7, -8, -9, og PARP. Svarende til observationer i HT1080 celler, JGT reguleret cellecyklus-relateret, anti-apoptotisk, og pro-apoptotiske proteiner og forøget PARP-spaltning i PC-3-celler (S2 Fig). DAPI-farvning bekræftede, at JGT øgede antallet af apoptotiske kerner viser chromatinkondensation og DNA-fragmentering (Fig 3B). I den indre apoptose pathway, afbrydelse af mitokondrie membran potentiale (MMP,

m) er en irreversibel punkt i død kaskade, og styres af pro- og anti-apoptotiske medlemmer af Bcl-2-familien. Specifikt pro-apoptotisk Bax favoriserer lækage af apoptotiske faktorer fra mitokondrierne, hvorimod anti-apoptotiske Bcl-2 inhiberer denne lækage [23-25]. Måling MMP (ΔΨ

m) ved hjælp af rhodamin 123 fluorescens farvestof afslørede, at JGT behandling induceret tab af MMP (ΔΨ

m) betydeligt i dosis- og tidsafhængige manerer. Behandling med 500 og 1000 ug /mL JGT i 48 timer faldt procentdelen af ​​celler med en høj MMP (ΔΨ

m) til 82.15% og 58,20%, sammenlignet med ubehandlede kontrolceller (94,38%) (Fig 4A) . Fluorescens mikroskopi bekræftet dette fald i MMP (ΔΨ

m, Fig 4B). Endvidere blev tabet af MMP (ΔΨ

m) induceret af JGT bekræftet under anvendelse af det fluorescerende farvestof JC-1, som udviser en potentiel-afhængig akkumulering i mitokondrier. Ved en høj MMP (ΔΨ

m), JC-1 forbliver i aggregeret form og observeres som røde punktformig farvning, mens det ser ud som grøn diffus monomer farvning på et lavt MMP. Som vist i fig 4C, JGT inducerede en bemærkelsesværdig dosisafhængig tab af MMP (ΔΨ

m) 48 timer efter behandling.

(A) HT1080-celler blev behandlet med 500 og 1000 ug /ml JGT i 24 og 48 timer, og niveauet af celledød-relaterede proteiner blev undersøgt ved Western blotting. Bandet intensiteter i forhold til ubehandlede celler blev beregnet ved hjælp af ImageJ software efter normalisering til tubulin udtryk. (B) Til påvisning af apoptotiske kerner, celler behandlet med 500 og 1000 ug /mL JGT i 48 timer blev farvet med DAPI og observeret under et konfokalt mikroskop. Data er repræsentative for tre uafhængige forsøg, og udtrykt som middelværdi ± SD af 5 tilfældige felter pr prøve. *

s

0.05 vs. ubehandlet kontrol.

(A) Depolarisering af mitochondriemembranpotential (MMP, ΔΨ

m) blev undersøgt i kontrol- og JGT-behandlede HT1080 celler efter farvning med rhodamin 123. procentdelen af ​​celler med en høj MMP (ΔΨ

m) sammenlignet med ubehandlede kontrolceller blev beregnet under anvendelse WinMDI 2.8. (B) Rhodamin 123-farvede celler blev observeret under et fluorescensmikroskop (40 × og 200 × forstørrelse). (C) Tabet af MMP (ΔΨ

m) blev undersøgt under anvendelse JC-1-farvning efter behandling med JGT i 48 timer (200 × og 600 × forstørrelse). Data er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

JGT inducerer celledød ved at aktivere p38 og ERK

Tidligere undersøgelser viste, at MAPK signalveje kunne inducere enten celleproliferation eller celledød afhængigt af celletype og stimulus [26,27]. Behandling med 1000 mg /ml JGT forhøjede niveauer af phosphoryleret p38 og ERK betydeligt, men havde ringe indflydelse på JNK fosforylering i HT1080 celler (Fig 5A) og PC-3 celler (S3 Fig). For at belyse den rolle, p38 og ERK-aktivering i JGT-medieret celledød, blev farmakologiske inhibitorer af p38 (SB203580), ERK (PD98059), og JNK (SP600125) anvendes. Præ-inkubation med SB203580 og PD98059 beskyttet JGT-behandlede celler fra døden effektivt, mens SP600125 haft ringe effekt. Desuden forinkubering med pan-caspaseinhibitor z-VAD-FMK inhiberede JGT-medieret celledød næsten fuldstændigt (fig 5B og 5C). Kollektivt antyder disse data, at JGT-medieret celledød udøves via p38 og ERK-aktivering efterfulgt af caspaseaktivering.

(A) Celler blev behandlet med 1000 ug /ml JGT for 1, 6, 12 og 24 t, og niveauerne af totale og fosforylerede MAPK’er blev målt ved Western blotting. Bandet intensiteter i forhold til ubehandlede celler blev beregnet efter normalisering til tubulin udtryk. Data er repræsentative for tre uafhængige forsøg. (B) Efter forbehandling med eller uden specifikke inhibitorer (10 uM) blev celler behandlet med 500 og 1000 ug /mL JGT i 48 timer, og observeret under et omvendt mikroskop. (C) Cellernes levedygtighed i (B) blev bestemt ved anvendelse MTT-assays. Data er repræsentative for tre uafhængige forsøg udført in triplo og er udtrykt som middelværdier ± SD. *

s

0,05 vs. ubehandlet kontrol, #

s.

0,05 vs. ingen inhibitor

Fermentering af JGT forbedrer sin hæmmende effekt på

in vitro

celledeling og

in vivo

tumorvækst med ingen bivirkninger

for at undersøge effekten af ​​bakteriel fermentering af JGT, vi sammenlignede anti-proliferative og celle Død, inducerende effekter af vildtype-JGT, autoklaveres /ikke-fermenteret JGT (aJGT), og autoklaveres /fermenteret JGT (fJGT162) i HT1080 celler. Som vist i figur 6A, aJGT og fJGT162 reducerede antallet af levedygtige celler på en dosis-afhængig måde, der ligner de observerede med JGT i figur 1A effekter. Imidlertid fJGT162 udviste en større inhiberende virkning på celleproliferation end gjorde den ikke-fermenterede JGT og aJGT, og de apoptotiske morfologiske ændringer i fJGT162-behandlede celler var mere alvorlige end i aJGT-behandlede celler. I PC-3-celler og AGS celler, havde fJGT162 forbedret aktivitet på inhiberingen af ​​celleproliferation og induktion af celledød i forhold til JGT og aJGT (S4 Fig). Desuden afslørede Western blotting, at både aJGT og fJGT162 øgede niveauer af p21, p27, Bax, og PARP-spaltning, og faldt niveauerne af cyclin B, cyclin D, cyclin E, CDK2, CDK4, CDK6, og XIAP væsentligt i forhold til ubehandlede kontrolceller (fig 6b). Desuden er både aJGT og fJGT162 aktiveret p38 og ERK betydeligt, men havde ringe effekt på JNK aktivering (Fig 6C), i overensstemmelse med virkningerne af JGT behandling. For at vurdere, om de anti-cancer effekter af JGT blev forstærket af gæring,

in vivo

tumor væksthæmmende effekter af aJGT- og fJGT162 blev sammenlignet. HT1080-celler blev subkutant inokuleret i maveregionen af ​​BALB /c nøgne mus, og 7 dage senere, musene (n = 5) med målbare tumor (~ 100 mm

3) blev dagligt behandlet med saltvand, aJGT eller fJGT162 i 14 dage. Som vist i fig 7A, behandling med 120 mg /kg aJGT undertrykte tumorvækst med succes sammenlignet med saltvandsbehandlede kontrolmus, mens fJGT162 udviste en mere potent inhibitorisk virkning på

in vivo

tumorvækst end gjorde aJGT. Kontrolmus havde en gennemsnitlig tumorvægt på 3,95 ± 0,50 g, hvorimod mus behandlet med aJGT og fJGT162 havde tumorvægte af 1,26 ± 0,56 g og 0,54 ± 0,38 g, hvilket afspejler et fald på 68,1% og 86,3%, henholdsvis (fig 7B). Disse resultater antyder, at JGT er et potent anti-cancer formulering, og at fermenteringen forbedrer

in vivo

anti-cancer effekter af JGT bemærkelsesværdigt. Desuden blev signifikant vægttab i aJGT- og fJGT162-indgivne mus ikke observeret hele behandlingen, hvilket indikerer aJGT og fJGT162 udløste ikke alvorlige toksiske virkninger (Fig 7C). For at vurdere, om den daglige administration af aJGT og fJGT162 forårsager alvorlige toksicitet, vi sammenlignet kropsvægt, orgel vægt og hæmatologiske /serologiske parametre i mus behandlet med vehikel (saltvand), aJGT eller fJGT162. Administrationen af ​​aJGT og fJGT162 i en dosis på 120 mg /kg i 14 dage påvirkede ikke krops- og organvægt (S1 og S2 Tables). Desuden værdierne af GOT, GPT, BUN, CRE, og hæmatologiske parametre var ikke signifikant forskellig mellem aJGT-, fJGT162-, og saltvandsbehandlede mus (S3 og S4 Tables). Disse data indikerer, at gentagen administration af aJGT og fJGT162 ved en dosis på 120 mg /kg har ingen bivirkninger.

(A) HT1080-celler blev behandlet med de angivne koncentrationer af aJGT eller fJGT162 i 48 timer, og cellelevedygtighed blev evalueret under anvendelse MTT-assays og blev observeret cellemorfologi under et omvendt mikroskop. Data er repræsentative for tre uafhængige forsøg udført in triplo og er udtrykt som middelværdier ± SD. *

s

0,05 vs. ubehandlet kontrol, #

s

0,05 vs. JGT eller aJGT. (B) Niveauerne af celle cycle- og celledød-relaterede proteiner i aJGT- eller fJGT162-behandlede HT1080 celler blev undersøgt ved Western blotting 48 timer efter behandlingen. (C) Aktiveringen af ​​MAPK’er blev analyseret ved Western blotting efter aJGT eller fJGT162 behandling i 1, 6 og 18 timer. De båndintensiteter forhold til dem for ubehandlede celler blev beregnet efter normalisering til tubulin ekspression.

(A) HT1080 celler (2 x 10

6 /mus i 200 pi PBS) blev inokuleret subkutant i BALB /c nøgne mus. Efter 7 dage blev musene behandlet dagligt med saltvand (kontrol), 120 mg /kg aJGT, eller 120 mg /kg fJGT162 i 14 dage. På dag 21 efter podning med tumoren, blev tumorerne fjernet og fotograferet. (B) Den endelige tumorvægt ved slutningen af ​​eksperimentet blev målt. (C) Kropsvægt blev målt under eksperimentet. Dataene er middel ± SD.

Identifikation af hovedkomponenterne i JGT, aJGT, og fJGT162 hjælp af HPLC-DAD

At analysere aktive ingredienser i JGT, aJGT, og fJGT162, valgte vi 8 markør forbindelser: 5-HMF (

Rehmanniae Radix Preparata

), paeoniflorin (

Paeoniae Radix)

, glycyrrhizin (

Glycyrrhizae Radix et rhizoma

), nodakenin og nodakenetin (

Angelicae Gigantis Radix

), Berberin og palmatine (

Phellodendri Cortex

), og hesperidin (

citri Unshius Pericarpium

). En gradienteluering af vand og acetonitril blev påført erhverve optimal separation, og TFA blev anvendt til at øge topform og inhibere peak haledannelse. UV bølgelængder de otte forbindelser blev justeret baseret på den maksimale UV-absorption af hver komponent. Hver forbindelse i prøverne blev identificeret ved at sammenligne retentionstiderne (

t

R

) og UV-spektre af kemisk definerede standard forbindelser. Som vist i figur 8 og S5 Fig, 5-HMF (1,

t

R

: 9,3 min), paeoniflorin (2,

t

R

: 32,6 min), nodakenin (3,

t

R

: 40,7 min), hesperidin (4,

t

R

: 43,3 min), nodakenetin (5,

t

R

: 48,2 min), Berberin (6,

t

R

: 51,2 min), palmatine (7,

t

R

: 51,7 min), og glycyrrhizin (8,