PLoS ONE: Beyond Cell Død – antiapoptotisk Bcl-2 Proteiner Regulere Migration og invasion af tyk- og endetarmskræft celler in vitro

Abstrakte

Migration og invasion af maligne celler er en forudsætning for kræft progression og metastase. Bcl-2-familien af ​​proteiner består af omkring 25 medlemmer og er blevet grundigt undersøgt i forbindelse med apoptose. På trods af, at små molekyler rettet Bcl-2-proteiner allerede har indtastet kliniske forsøg, meget få undersøgelser undersøgt en rolle antiapoptotiske Bcl-2-proteiner ved siden celledød i forbindelse med metastase. Formålet med denne undersøgelse var at dissekere en mulig rolle antiapoptotiske Bcl-2-proteiner MCL-1, bcl-2 og Bcl-x

L om migration og invasion af colorektale cancerceller uanset deres celledød kontrolfunktion. Vi anvendte migration og invasion-assays samt tredimensionelle cellekulturer til analyse kolorektale cancercellelinjer (HT29 og SW480) efter siRNA-medieret knockdown eller overekspression af Mcl-1, Bcl-2 eller Bcl-x

L. Vi observerede ingen spontan celledød induktion eller forringet proliferation af celler, der mangler Mcl-1, Bcl-2 eller Bcl-x

L. I modsætning hertil knockdown af Mcl-1 ført til øget spredning. Påfaldende, demonstrerer vi en dyb forringelse af både, migration og invasion, af kolorektal cancer celler efter Mcl-1, Bcl-2 eller Bcl-x

L knockdown. Denne fænotype blev fuldstændig revideret i celler, der overudtrykker Mcl-1, Bcl-2 eller Bcl-x

L. observeredes den mest udtalt virkning blandt de undersøgte proteiner for Bcl-2. De viste data indikerer en central rolle Mcl-1, Bcl-2 og Bd-x

L for migration og invasion af kolorektal cancer celler uafhængigt af deres kendte antiapoptotiske effekter. Således er vores undersøgelse illustrerer hidtil ukendte antitumorale mekanismer Bcl-2-protein målretning

Henvisning:. Koehler BC, Scherr A-L, Lorenz S, Urbanik T, Kautz N, Elssner C, et al. (2013) Beyond Cell Død – antiapoptotisk Bcl-2 Proteiner Regulere Migration og invasion af tyk- og endetarmskræft Cells

In Vitro

. PLoS ONE 8 (10): e76446. doi: 10,1371 /journal.pone.0076446

Redaktør: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, Kina

Modtaget: Juni 14, 2013; Accepteret: August 23, 2013; Udgivet: 3 oktober 2013

Copyright: © 2013 Koehler et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev understøttet af en postdoc-Fellowship givet til BCK fra det medicinske fakultet ved universitetet i Heidelberg, Tyskland (https://www.medizinische-fakultaet-hd.uni-heidelberg.de), og tilskud til HSB fra den tyske Research Foundation (Deutsche Forschungsgemeinschaft, https://www.dfg.de/, DFG Schu 1443 /4-1) og fra Merck Serono GmbH (Darmstadt, Tyskland). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Henning Schulze-Bergkamen modtaget forskningsbevillinger samt refusion af konference- rejseudgifter og honorarer fra Merck Serono GmbH. Ingen af ​​forfatterne er relateret til Merck Serono ved beskæftigelse, rådgivning, patenter og produkter i udviklings- eller markedsføre produkter. Intet produkt af Merck Serono har været brugt eller undersøgt i manuskriptet. Merck Serono GmbH var ikke involveret i forsøgene eller forberedelse af manuskriptet. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Kolorektal karcinom (CRC) er den anden mest almindelige malignitet hos kvinder, og den tredje i mænd over hele verden med en stigende forekomst. Desuden CRC er den fjerde dødsårsag af kræft. Selv hvis fremskridt inden for lægemiddeludvikling og kirurgi ført til en øget samlet overlevelse, er prognosen for patienter med metastaseret CRC (stadie UICC IV) stadig begrænset [1], [2]. Metastasation er en væsentlig dødsårsag hos cancerpatienter og involverer en flertrins proces med enorme kompleksitet. Trods vores voksende forståelse af de underliggende veje, mange aspekter af metastaser uløste [3], [4].

B-celle lymfom-2 (Bcl-2) familie af proteiner består af omkring 25 medlemmer og er blevet grundigt undersøgt med hensyn til apoptose signalering. Den hårfine balance af Bel-2 proteiner regulerer cellens skæbne på mitokondrie overflade. De proapoptotiske Bcl-2-proteiner (dvs. Bax og Bak) er bundet af deres antiapoptotiske slægtninge (dvs. Mcl-1, Bcl-2 og Bcl-x

L). I tilfælde af en forskydning af denne balance mod døden er de proapoptotiske Bcl-2-proteiner frigivet af deres antiapoptotiske modstykker. Når de proapoptotiske Bcl-2-proteiner er sat fri, mitokondrier bliver aktiveret og celledød indtræder [5]. Desuden et bidrag på antiapoptotiske proteiner til nekrose og autofagi har vist, [6], [7]. I autophagy, antiapoptotiske Bcl-2 proteiner virker ved sekvestrering proautophagic proteiner såsom Beclin1 [8], [9].

De antiapoptotiske Bcl-2 proteiner er almindeligt overudtrykt i humane kræftformer, herunder CRC. For eksempel kan en forøget ekspression af Bcl-x

L og Mcl-1 er blevet vist for CRCs og korrelerer med dårlig differentiering, højere tumor stadium og dårlig prognose af patienterne [10] – [12]. I modsætning hertil en anden undersøgelse præsenterer data korrelerer en høj Bcl-2-ekspression med god kliniske forløb hos patienter med CRC [13]. Disse modstridende rapporter peger på ikke-redundante funktioner antiapoptotiske Bcl-2 proteiner og belyse nødvendigheden af ​​en dybere undersøgelse af engagement og relevansen af ​​disse proteiner i CRC.

Der er voksende beviser for en rolle antiapoptotiske proteiner ud over celledød regulering. For eksempel har Mcl-1 og dets splejsningsvarianter blevet vist at interagere med den respiratoriske kæde og den oxidative metabolisme [14]. Bcl-x

L og Bcl-2 har været knyttet til signalering involveret i reaktive oxygenarter (ROS) produktion [15], [16]. Virkningerne af Bcl-2 proteiner på spredning stadig afklares. Der er nogle beviser for antiproliferative virkninger af Bcl-2, Bcl-x

L og Mcl-1 i det fysiologiske omgivelser [17]. I dette tilfælde er en overlevelse af celler mindre tilbøjelige til apoptose opretholdes i det mindste delvis på bekostning af spredning. Det er imidlertid vigtigt at behandle spørgsmålet, om de lovgivningsmæssige virkninger af Bcl-2 proteiner på cellecyklus og celledød er uafhængige fænomener. Indtil videre kun få viden om en potentiel forpligtelse antiapoptotiske Bcl-2 proteiner på migration og invasivitet af kræftceller. Bcl-x

L har vist sig at være involveret i brystcancer metastasation og CRC migration, men rollen som bcl-2 og Mcl-1 til tumorspredning forbliver uløst [18], [19]. I vores undersøgelse, vi sigter mod at undersøge celledød induktion, proliferation, migration og invasion af CRC celler efter sletning af Bd-2, Bcl-x

L eller Mcl-1-ekspression. Vigtigere er det, en knockdown af antiapoptotiske Bcl-2 proteiner direkte hæmmede migration og invasion af CRC celler uafhængigt af celledød induktion eller virkninger på proliferation. Sammenfattende vores undersøgelse giver nye indsigter i antitumor virkninger af Bcl-2 protein hæmning i kolorektal cancer uden celledød signalering og cellecyklus regulering.

Materialer og metoder

Reagenser og cellelinier

CRC cellelinjer HT29, SW480, Caco2 og Colo205 blev købt fra ATCC. Celler blev dyrket i en fugtig atmosfære (37 ° C, 5% CO

2) i RPMI + GlutaMAX ™ (Gibco, Karlsruhe, Tyskland) suppleret med 10% FCS (PAA Laboratories, Cölbe, Tyskland), 1% Pen /Strep (PAA Laboratories), 1% HEPES (Gibco) og 1% ikke-essentielle aminosyrer (NEAA, Gibco). Alle cellelinjer blev regelmæssigt screenet for forureninger og ikke oversteg en passage af 10. Kemoterapeutiske reagenser 5-fluorouracil, Oxaliplatin og irinotecan blev købt fra Sigma-Aldrich (Hamborg, Tyskland).

rentabilitetsprøve

Celler podedes på plader med 12 brønde og 24 timer efter podning transficeres eller behandles som anført. Cellelevedygtighed blev bestemt under anvendelse af et kolorimetrisk 3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2, 5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) assay som tidligere beskrevet [20]. Absorbans blev målt ved 550 nm under anvendelse af en mikropladelæser (Infinite 200 pro; Tecan, Männedorf, Schweiz).

RNAi, plasmider og transfektion

Små interfererende RNA (siRNA) målretning Bcl-x

L, Bcl-2, Mcl-1 mRNA eller plasmid-DNA blev administreret på dag 1 efter podning af cellerne i 12 eller 6 brønd plader med et sammenløb på 70-80% på tidspunktet for transfektion. Følgende siRNA sekvenser blev anvendt (MWG Biotech, Ebersberg, Tyskland): Bd-x

L 5′-gcuuggauaaagaugcaaTT-3 ‘(sense) og 5′-uugcaucuuaucccaagcAG-3′ (antisense), Mcl-1 5’ aaguaucacagacguucucTT-3 ‘(sense) og 5′-gagaacgucugugauacuuTT-3′ (antisense), Bcl-2 5’-uaauaacgugccucaugaaTT-3 ‘(sense) og 5′-uucaugaggcacguuauuaTT-3′ (antisense). siRNA mod GFP blev anvendt som kontrol: GFP 5’-ggcuscguccaggagcgcaccTT-3 ‘(sense) og 5′-ggugcgcuccuggacgguagccTT-3’ (antisense). Små bogstaver repræsenterer ribonukleotider og hovedstæder deoxyribonucleotider. Celler blev transficeret i OptiMEM® (Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland) uden eventuelle tillæg vha RNAiMAX ™ (Invitrogen) ifølge producentens protokol.

Plasmid transfektion blev udført under anvendelse Lipofectamine® LTX (Invitrogen) i OptiMEM® for SW480 celler eller peqFECT DNA (Peqlab, Erlangen, Tyskland) i komplet RPMI for HT29 celler ifølge fabrikantens protokol. Følgende plasmider blev anvendt: human Mcl-1 blev klonet i en pEF4 vektor. Human Bcl-2 og Bcl-x

L blev klonet i en pcDNA3 vektor. pcDNA3-hBCL-2 var en slags gave fra W. Roth (Patologisk Institut, Heidelberg). pcDNA3-hBCL-x

L blev venligst stillet til rådighed af M. Li-Weber og P.H. Krammer (tysk Cancer Research Center, Heidelberg, Tyskland). Tilsvarende tomme vektorer blev anvendt som kontroller. Parallelt blev transfektionseffektivitet valideret ved anvendelse GFP transfektion ved flowcytometri. Transfektion effektivitet var mindst 70% i alle eksperimenter (data ikke vist) og yderligere evalueret ved Western blotting 24, 48 og 72 timer efter transfektion.

Påvisning af spredning og celledød

Efter behandling , supernatanten blev overført til FACS rør og cellerne blev forsigtigt løsnede hjælp Accutase ™ (PAA) og poolet med den tilsvarende supernatant. Efter centrifugering blev celler resuspenderet i en hypotonisk puffer indeholdende 0,1% (w /v) natriumcitrat, 0,1% (volumen /volumen) Triton X-100 og 50 ug /ml propidiumiodid (Sigma-Aldrich). Efter 1 time inkubation ved 4 ° C samlede DNA-indhold af celler blev målt i henhold til protokollen af ​​Nicoletti

et al.

[21] ved hjælp af en CANTO II flowcytometer (Becton Dickinson [BD], Franklin Lakes, NJ USA). Cell cyklus analyse blev udført ved hjælp af FACS Diva 6 (BD) og FlowJo 7.6.5. (Tree stjerne Inc., Ashland, OR USA). Celler repræsenterer subG1 fraktion blev afbildet som apoptotiske.

For yderligere at specificere celledød induktion og proliferation blev celler fikseret og permeabiliseret under anvendelse cellecyklus og proliferation kit til flowcytometri (BD) ifølge fabrikantens protokol. Kort fortalt blev celler pulseret i 1 time med 20 uM bromdeoxyuridin (BrdU) for at diskriminere hvile fra prolifererende celler. Herefter blev cellerne høstet, fikseret, permeabiliseret og derefter refixed efterfulgt af farvning med fluorochrom koblede antistoffer mod spaltet PARP (Asp214, koblet til PE) som indikator for apoptose, BrdU (koblet til PerCP-Cy ™ 5.5) til proliferation og phosphorylated- H2AX (pS139, koblet til Alexa Fluor® 647) for DNA-skader, hhv. Celler blev derefter analyseret ved flowcytometri.

Cell Lysis, SDS-PAGE og Western Blotting

Celler blev podet i plader med 12 brønde, dyrket i 24 timer og behandles som anført. Cellelyse, SDS-PAGE og Western blotting blev udført. Følgende antistoffer blev anvendt til immunodetektion: anti-Mcl-1 (Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Tyskland), anti-Bcl-x

L (Cell Signaling, Boston, MA USA), anti-Bcl-2 (Abcam, Cambridge, UK), anti-αTubulin (Sigma), anti-spaltet PARP (ASP214, Cell Signaling).

celletælling

Celler blev podet i plader med 6 brønde og transficeret specifikke siRNA efter 24 timer. Celler blev høstet, resuspenderet og derefter talt ved anvendelse af et Neubauer kammer 24, 48 og 72 timer efter transfektion. Trypane blå farvning blev anvendt til at udelukke døde og fragmenterede celler under tælle procedure.

Migration Analyser

2 × 10

6-celler blev podet i 12 brønds plader, vokset til et sammenløb af omkring 70-80% og transficeret som angivet. 24 timer efter transfektion cellemonolaget blev ridset under anvendelse af en steril pipettespids. Celler blev derefter vasket med medium og billeder blev straks taget med et omvendt mikroskop (CKX41, Olympus Inc., Hamborg, Tyskland) udstyret med et digitalt farvekamera (XC30, Olympus Inc.). Den nøjagtige placering af billedet i monolag blev markeret for at identificere den samme hul i de næste 72 timer. Kløften lukning blev målt hver 24 timer som følger ved hjælp CellSense® imaging software (Olympus Inc.): Gap afstande på bunden mellem den ene side og den anden blev målt ved bestemte intervaller langs kanten af ​​den genererede scratch (hver 200 pm). Gennemsnittet af de målte afstande blev derefter beregnet og sammenlignet med middelafstand af hullet på starttidspunktet punkt i forsøget [22].

Invasion Assay

BioCoat ™ MatrigelTM Invasion Chambers (8 mikron porestørrelse, BD) blev anvendt til at undersøge invasion af SW480-celler. Matrigel ™ invasion kamre blev hydratiseret i FCS frit RPMI i en fugtig atmosfære i 2 timer. Herefter blev invasion kamre overført i companion brønde (BD) indeholdende 750 pi RPMI suppleret med 10% FCS. FCS tjener som en kemoattraktant for invasive celler. Celler blev podet i plader med 12 brønde og transficeret som beskrevet. 24 timer efter transfektion blev cellerne høstet under anvendelse af Accutase ™ (PAA), samlet og talt. 3 × 10

5-celler blev derefter resuspenderet i 500 pi FCS frit RPMI og overført til den øvre del af invasionen kammeret. Efter 72 timer blev den øvre overflade af invasionen kammeret skrubbes at fjerne ikke-invaderende celler under anvendelse en bomuld tippes svaber. Invaderet celler på den nedre overflade af indsatsen blev fikseret med 80% EtOH i 30 minutter efterfulgt af farvning af kerner under anvendelse Hoechst 33342 (Invitrogen) i 15 min. Inserts blev derefter vasket i PBS. Fem billeder af hver insert blev udtaget og antallet af besatte celler blev talt med det blotte øje.

3D Cell Culture

Vi bruges Alvetex® Stilladser fremstillet af et inert, stærkt porøse og tvær- forbundet polystyren stillads, opdelt i en 200 um tyk membran for at udføre egnede tredimensionelle cellekultur eksperimenter. Alvetex® Stilladser blev brugt i 12 brønde format (Reinnervate AVP002, Sedgefield, UK) under sterile forhold. Skeletter blev inkuberet med sterilfiltreret EtOH (80%) i 5 minutter som en forbehandling, vasket to gange med medium og efterlades på mediet. Celler blev transficeret og høstet ved anvendelse af Accutase ™ som beskrevet, talt og resuspenderet i komplet RPMI. 1 × 10

6 celler blev derefter podet på toppen af ​​indsatsen disken i et samlet volumen på 200 pi medium. 3 timer efter podning, blev stilladser oversvømmet forsigtigt nedefra, indtil fuldstændig dækning var nået. Medium blev ændret hver 48 h.

Skæring og Immunhistokemi af 3D-Stilladser

Efter 72 timer blev stilladser vasket to gange i PBS, skåret i skiver og straks overført i Cryomolds® indeholdende oktober monteringsmedium (Science Services, München, Tyskland) og gradvist frosset i gasfasen af ​​flydende nitrogen. Efter 24 timer ved -80 ° C blev stilladser cryosectioned (Kryostat, Thermo) og monteret på HistoBond® lysbilleder. Sektioner (9 um tykkelse) blev fikseret i 4% PFA og farvet med hæmatoxylin og eosin for morfologiske undersøgelser, samlet celletal og måling af invasion dybde. Desuden blev immunhistochemistry udført under anvendelse NovoLink Polymer Detection System (Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland) ifølge producentens instruktioner efter PFA-fiksering og varme epitopgenfinding (HIER) i citratbuffer (pH 6). Antistoffer mod Ki67 (Abcam), og Bcl-x

L (Cell Signaling) blev anvendt, og objektglas blev inkuberet ved stuetemperatur i 30 minutter. Billeder blev taget med et inverteret mikroskop. Billeder blev analyseret ved hjælp CellSense® og ImageJ software.

Statistisk analyse

Data fra invasion og 3D-stillads eksperimenter blev analyseret ved hjælp af t-test (parret, tosidet) baseret på normal data distribution. For Migration Analyser, forholdet mellem gapclosure som respons, og tid og behandling som forklarende variabler blev undersøgt ved en variansanalyse (ANOVA). Analysen af ​​samspillet mellem tid og behandling var ikke et mål for den foreliggende undersøgelse, og det var ikke inkluderet i variansen model. SPSS 20 statistik (IBM, NY USA) software blev anvendt til alle statistik analyser. En værdi på P 0,05 blev anset for at være betydelige

Resultater

Mcl-1, Bcl-2 og Bd-XL Expression i Human Colorectal kræftcellelinjer

for at undersøge ekspressionen af ​​de anti-apoptotiske Bcl-2-proteiner MCL-1, bcl-2 og Bcl-x

L i humane CRC cellelinier, målte vi proteinniveauer i fire kolorektale cancercellelinjer. Caco2, Colo205, HT29 og SW480 celler er meget udbredt og godt karakteriseret [23], [24]. CaCo2 celler vides at være dårligt tumorigen i mus. SW480 og Colo205 celler er lokalt invasive i ortotopisk tumormodeller. HT29-celler metastaserer i lever og lunge, når det injiceres i underhuden [24]. MCL-1, Bcl-2 og Bcl-x

L-ekspression var påviselig i CRC cellelinier (fig. 1A). CaCo2 celler viste betydelige mængder Mcl-1, Bcl-2 og Bcl-x

L, med den højeste ekspressionsniveau for Bcl-2. Colo205 celler havde en nedsat mængde Bcl-x

L. SW480-celler havde en omtrent lige beløb for alle Bcl-2 proteiner. HT29-celler viste en dominerende ekspression af Bcl-2 og et lavt niveau af Bcl-x

L. Tilsammen disse resultater viser, at udtrykket mønster af antiapoptotiske proteiner varierede i CRC-cellelinjer, der anvendes i vores undersøgelse. Der var ingen korrelation mellem tumorgenicitet af en cellelinje og en vis ekspressionsmønster (fig. 1A). Vi besluttede at fokusere på SW480-celler og HT29 til yderligere forsøg med Bcl-2 knockdown, fordi begge cellelinier deler evnen til at invadere og formen metastase i musemodeller.

(A) Western blot-analyser af kolorektal cancer cellelinier Caco2, Colo205, SW480 og HT29. Basale ekspressionsniveauer af Bcl-x

L, Mcl-1 og Bcl-2. Tubulin tjente som lastning kontrol. Celler er anbragt med stigende tumorigenicitet fra venstre mod højre. Her, tumorigenicitet angiver evnen af ​​en cellelinje til at metastasere i mus. Den laveste tumorigenicitet står for lokal tumorvækst mangler invasivitet; den højeste tumorigenicitet indikerer dannelsen af ​​fjernt organ metastase (lever og /eller lunge). (B) Western blot-analyser af HT29 (venstre) og SW480 (højre) celler efter siRNA-medieret knockdown af Mcl-1, Bcl-2 og Bcl-x

L 24, 48 og 72 timer efter transfektion. Tubulin tjente som lastning kontrol. De vestlige blots præsenterede er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

Knockdown af antiapoptotisk bcl-2 Proteiner inducerer ikke Spontan Apoptose men sensibiliserer CRC Celler til kemoterapi

Vi først bestemmes effekten af specifikke siRNA targeting Bcl-2, Bcl-x

L eller Mcl-1 over et tidsrum på 72 timer i HT29 og SW480 celler. Her nedregulering af antiapoptotiske proteiner var effektiv i mindst 72 timer som observeret ved Western blot-analyse (fig. 1 B). For at analysere virkningerne af en nedregulering af Bd-2, Bcl-x

L eller Mcl-1 på celleviabilitet vi udførte MTT assays 48 timer efter transfektion. Resultaterne viser ingen effekt af faldet antiapoptotiske Bcl-2 protein niveauer på cellelevedygtighed i HT29 og SW480 celler (Fig. 2 A).

(A) MTT-analyse af SW480 og HT29-celler efter knockdown af Mcl- 1, Bcl-2 og Bcl-x

L. (B) Flowcytometrisk analyse og tilsvarende Western blots til spaltning af PARP 48 timer efter knockdown af Mcl-1, Bcl-2 og Bcl-x

L i HT29 (venstre) og SW480-celler (højre). (C) Flowcytometrisk analyse af HT29 (venstre) og SW480-celler (højre) for pH2AX 48 timer efter knockdown af Mcl-1, Bcl-2 og Bcl-x

L. 24 h Staurosporin behandling (1 uM) fungerede som en positiv kontrol for celledød induktion. (D) Flowcytometrisk analyse for DNA-fragmentering af HT29-celler efter knockdown af Mcl-1, Bcl-2 og Bcl-x

L efterfulgt af 48 h behandling med 30 pM oxaliplatin og 0,2% DMSO som et køretøj. Flowcytometri analyse blev udført i triplikater. Søjler repræsenterer middelværdi ± SD. Assays er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg. (Oxa = oxaliplatin).

For det andet, vi undersøgt om spontan celledød induktion indtraf i transfekterede HT29 og SW480 celler. Derfor analyserede vi celler for spaltet poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) 48 timer efter transfektion ved flowcytometri og ved Western blotting. Da PARP er et mål af aktiveret Caspase 3 dets spaltning indikerer en effektiv udførelse af apoptose [25]. Vi har ikke registrerer en stigning i kløvet (cl.) PARP niveauer, efterfølgende til Mcl-1 knockdown (fig. 2 B). For Bcl-2 og Bd-x

L knockdown, vi registreret en meget lille stigning i cl. PARP niveauer ved FACS, men kunne ikke finde en rimelig mængde spaltet protein i Western blots (Fig. 2 B). Desuden kontrolleres vi for DNA-skader som et adelsmærke for celledød. Derfor har vi farvede celler 48 timer efter transfektion med fluorochrom koblet antistof rettet mod phosphoryleret histon H2AX [26]. Phosphorylering af H2AX forekommer som respons på DNA dobbelt-strengbrud. Der var ingen betydelig mængde phosphoryleret H2AX påvises i transficerede celler og kontroller (Fig. 2 C). Staurosporin (STS) behandling af HT29 og SW480 celler tjente som en positiv kontrol for celledød induktion (fig. 2 B og C).

For det tredje, vi havde til formål at undersøge potentialet i antiapoptotisk Bcl-2 protein knockdown til sensibilisere HT29-celler til klinisk relevante og hyppigt anvendte kemoterapeutika. For 5-FU og irinotecan var der ingen signifikante sensibiliserende virkning af siRNA-medieret knockdown af antiapoptotiske proteiner, som vurderet ved FACS-analyse af DNA fragmentation (data ikke vist). I slående kontrast, observerede vi en dyb og meget signifikant sensibilisering til oxaliplatin efter knockdown af de antiapoptotiske proteiner bcl-2, Bcl-x

L og Mcl-1 (fig. 2D).

Tilsammen disse resultater, at en knockdown af Bcl-2, Bcl-x

L eller Mcl-1 førte ikke til spontan celledød og var tilsyneladende godt kompenseret i CRC-celler. Blandt de kemoterapeutiske anvendes i CRC behandling blev kun effekten af ​​oxaliplatin markant forstærket af knockdown af antiapoptotiske proteiner.

Knockdown af antiapoptotisk bcl-2-Proteiner Udøver ingen Antiproliferative Virkninger på CRC Celler

Efter udelukkelse af spontan celledød induktion efter Bcl-2, Bcl-x

L eller Mcl-1 knockdown Derefter undersøgte vi, proliferation af CRC-celler. En høj andel af ubehandlede HT29-celler (38,6%) blev prolifererende som bedømt ved BrdU-inkorporering (fig. 3 A og B). Forholdet mellem prolifererende celler var ikke signifikant forskellig efter Bcl-2 og Bcl-x

L knockdown (siBcl-2:37,3%; siBcl-x

L: 37,4%). I modsætning hertil knockdown af Mcl-1 førte til en betydelig stigning i BrdU inkorporering i sammenligning med kontroller (47,5 vs. 38,6%, p 0,05, figur 3 A og B).. For SW480 celler, observerede vi en lavere basalniveau af proliferation (21,1% BrdU-positive celler). Resultaterne for celler transficeret med siRNA mod Mcl-1, Bcl-2 og Bd-x

L var i overensstemmelse med dem, der opnås for HT29-celler. Igen, kun Mcl-1 knockdown ført til en betydelig stigning i BrdU positivitet, mens Bcl-2 og Bd-x

L knockdown viste ingen signifikante effekter (MCL-1:25,6% vs. 21,1%, p 0,05

Knockdown af antiapoptotisk Bcl-2 Proteiner massivt forringer Migration af CRC Celler

Dernæst vi havde til formål at undersøge effekten af ​​Mcl-1, Bcl-2 og Bd-x

L sletning for migration af CRC celler. For at visualisere cellemigrering, udførte vi scratch assays på monolag af transficerede HT29 og SW480 celler. Gap afstand blev målt hver 24 timer efter knockdown af Mcl-1, Bcl-2 og Bd-x

L efterfulgt af beregning af udbedring. Gap lukning var signifikant langsommere i både HT29 og SW480 celler efter knockdown af Mcl-1, Bcl-2 og Bd-x

L (p-værdier for HT29: siMcl-1: 0001; siBcl-2: 0001; siBcl-x

L: = 0002 P-værdier for SW480: siMcl-1:. = 0,0011; siBcl-2:. = 0,0005; siBcl-x

L: = 0004) (fig. 4 B og C, til venstre). I HT29 og SW480 celler, blev det mest slående virkning observeret efter knockdown af Bcl-2. Her blev migration afstand faldet til 56% i SW480 og 36% i HT29 efter 72 timer i forhold til kontrolgruppen (figur 4 A,.. Figur 4 B og C, til venstre). Tilsammen viser vi negative virkninger af en Mcl-1, Bcl-x

L og Bcl-2 knockdown på CRC migration uafhængig af celledød induktion og antiproliferative virkninger.

SW480 og HT29-celler blev transficeret med siRNA mod Mcl-1, Bcl-2 og Bcl-x

L og dyrket som et monolag. Gap afstand blev målt hver 200 um langs kanten af ​​hullet og udbedring beregnet 24, 48 og 72 timer efter transfektion. (A) Repræsentative billeder fanget efter knockdown af Bel-2 i HT29-celler (skala bar angiver forstørrelsen for alle paneler). (B) Gap lukning kinetik HT29-celler efter knockdown af Mcl-1, Bcl-2 og Bd-x

L (venstre) og tilsvarende Western blots (til højre). (C) Gap lukning kinetik SW480 celler efter knockdown af Mcl-1, Bcl-2 og Bd-x

L (venstre) og tilsvarende Western blots (til højre). Assays er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg. Værdier er udtrykt som middelværdi ± SD. (p-værdier for HT29: siMcl-1: 0001; siBcl-2: 0001; siBcl-x

L:. = 0002 P-værdier for SW480: siMcl-1: = 0,0011; siBcl -2: = 0,0005; siBcl-x

L:. = 0004)

Overekspression af antiapoptotisk Bcl-2 Proteiner Accelererer Migration af CRC Cells

Ud over, testede vi, om forøget ekspression af Mcl-1, Bcl-2 og Bcl-x

L i HT29 og SW480 celler påvirker migration og potentielt vender fænotypen af ​​de knockdown eksperimenter. Igen, udførte vi scratch assays og brugte celler transficeret med tilsvarende ekspressionsplasmider af Bcl-2-proteiner. Påfaldende, observerede vi en markant accelereret migration af SW480 celler, der overudtrykker Bcl-x

og Bcl-2 (p 0001, figur 5 B, til venstre.). Celler som overudtrykker Bcl-2 næsten fordoblet migrerede afstand efter 72 h (999 um vs. 526 um i kontrol, fig. 5 A). For Mcl-1 overekspression SW480-celler observerede vi en lavere, men signifikant stigning i migration (p. 0,01, figur 5 B, til venstre). Disse observationer blev også foretaget for HT29-celler med overekspression af Mcl-1, Bcl-2 eller Bcl-XL

L (data ikke vist). Endvidere var der ingen øget proliferation påvises i celler, der overudtrykker Mcl-1, Bcl-2 eller Bcl-x

L (data ikke vist). Sammenfattende viser vi, at anti-apoptotiske Bcl-2-proteiner er i stand til at udløse migreringen af ​​CRC-celler.

SW480-celler blev transficeret med plasmider, der udtrykker human Mcl-1, Bcl-2 eller Bcl-x

L og dyrket som et monolag. Huller blev genereret og udbedring målt som beskrevet. (A) Repræsentative billeder til SW480 celler, der overudtrykker Bcl-2 (skala bar angiver forstørrelsen for alle paneler). (B) Gap lukning kinetik SW480 celler overudtrykker Mcl-1, Bcl-2 og Bd-x

L (venstre) og tilsvarende Western blots (til højre). Assays er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg. Værdier er udtrykt som middelværdi ± SD. p-værdier: MCL-1: = 0,0006; Bcl-2: = 0,0002; Bd-x

L:. 0,0001

Knockdown af antiapoptotisk bcl-2-Proteiner Regulere invasiv af CRC Celler

For yderligere at undersøge regulatoriske effekter af Mcl-1 , Bcl-x

L og Bcl-2 på processer er relevante for CRC metastase, vi også vurderet invasion af CRC-celler efter manipulation af Bcl-2-proteiner. Celler med slettede Bcl-x

L viste væsentligt forringet invasive egenskaber i Boydenkammer invasion analyser i forhold til håne transfekterede celler (70% sammenlignet med kontrolgruppen, p 0,05;. Figur 6 A og B). Mest slående, en knockdown af Bcl-2 næsten fuldstændigt ophævet evne SW480 celler at invadere (38% sammenlignet med kontroller, p 0,001). Desuden Mcl-1 knockdown også forårsaget en gennemgående sænkning af invasion (37% sammenlignet med kontroller, p 0,001;. Figur 6 A og B). Disse observationer understreger den rolle, som anti-apoptotiske Bcl-2-proteiner til migration og invasion af CRC-celler og identificere en fremtrædende rolle Bcl-2 i forbindelse med invasivitet.

SW480-celler blev podet på plader med 6 brønde og transficeret som beskrevet. 24 × 10

5-celler blev podet ind i det øvre kammer i et Transwell. 48 timer efter podning blev kerner på den nedre overflade visualiseret ved Hoechst-farvning. (A) Repræsentative billeder af lavere insert overflade efter Hoechst farvning (skala bar angiver forstørrelsen for alle paneler). (B) Fem synsfelter pr insert blev talt. n = 5 pr gruppe. Værdier er udtrykt som middelværdi ± SD. Assays er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg. ** P 0,01.