PLoS ONE: Prognostisk Betydningen af ​​miR-181b og miR-21 i mavekræft Patienter behandlet med S-1 /Oxaliplatin eller doxifluridin /Oxaliplatin

Abstrakt

Baggrund

Målet med denne undersøgelse er at vurdere effektiviteten af ​​S-1 /Oxaliplatin vs. doxifluridin /Oxaliplatin regime og identificere miRNA som potentielle prognostiske biomarkører i gastrisk kræftpatienter. Udtrykket af kandidat miRNA blev kvantificeret 50-5 sen fase gastrisk kræft FFPE prøver

Eksperimentel Design

mavekræft patienter med KPS . 70 blev rekrutteret til forsøget. Kontrolgruppen blev behandlet med 400 mg /to gange /dag doxifluridin plus

i.v..

Med Oxaliplatin ved 130 mg /m

2 /første dag /4 ugers cyklus. Afprøvningen blev behandlet med S-1 ved 40 mg /to gange /dag /4 ugers cyklus plus

i.v..

Med Oxaliplatin ved 130 mg /m

2 /første dag /4 ugers cyklus. Totale RNA’er blev ekstraheret fra normale og gastriske tumorprøver. Niveauerne af miRNA blev kvantificeret ved hjælp af real time QRT-PCR ekspressionsanalyse.

Resultater

Den overordnede objektive responsrate (CR + PR) af patienterne behandlet med S-1 /Oxaliplatin var 33,3% (CR + PR)

vs.

17,6% (CR + PR) med doxifluridin /oxaliplatin for fremskreden gastrisk kræftpatienter. Den gennemsnitlige samlede overlevelse for patienter behandlet med S-1 /Oxaliplatin var 7,80 måneder vs. 7,30 måneder med patienter behandlet med doxifluridin /Oxaliplatin. Udtrykket af miR-181b (

P

= 0,022) og miR-21 (

P

= 0,0029) var signifikant overudtrykt i gastriske tumorer sammenlignet med normale gastriske væv. Kaplan-Meier overlevelse analyse viste, at lave niveauer af MIR-21-ekspression (log rank test, hazard ratio: 0,17, CI = 0,06-0,45;

P

= 0,0004) og MIR-181b (log rank test, hazard ratio:. 0,37, CI = 0,16-0,87;

P

= 0,018) er tæt forbundet med en bedre patientens samlede overlevelse for både s-1 og doxifluridin baserede regimer

Konklusion

Patienter behandlet med S-1 /Oxaliplatin havde et bedre svar end dem behandlet med doxifluridin /Oxaliplatin. miR-21 og miR-181b holde stort potentiale som prognostiske biomarkører i sent stadium mavekræft

Henvisning:. Jiang J, Zheng X, Xu X, Zhou Q, Yan H, Zhang X, et al. (2011) Prognostisk Betydningen af ​​miR-181b og miR-21 i mavekræft Patienter behandlet med S-1 /Oxaliplatin eller doxifluridin /Oxaliplatin. PLoS ONE 6 (8): e23271. doi: 10,1371 /journal.pone.0023271

Redaktør: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, USA

Modtaget: 19 Maj 2011; Accepteret: 10. juli 2011; Udgivet: 18 August, 2011

Copyright: © 2011 Jiang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning projektet blev støttet af National Natural Science Foundation of China (30950022 og 30972703) og samfund udarbejde planer, Institut for Videnskab og Teknologi Changzhou (BS20092019). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft er stadig en af ​​de mest almindelige former for kræft på verdensplan med omkring 870.000 nye tilfælde og 650.000 dødsfald om året. Mavekræft er en af ​​de mest almindelige årsager til kræft dødsfald i Kina [1]. Den tidlige kliniske påvisning af mavekræft var mindre end 15%, og omkring 85% tilfælde blev fremført mavekræft [2]. Den gennemsnitlige dødelighed af gastrisk cancer i Kina er over 26% for mænd og 15% for kvinder. Gastrisk cancer er en temmelig kompleks og gådefulde uorden og mange faktorer sandsynligt føre til udviklingen af ​​sygdommen. Epigenetik spiller central rolle i gastrisk udvikling af kræft og montering beviser viste, at ikke-kodende miRNA er en af ​​de største bidragydere til mavekræft.

miRNA er en klasse af små ikke-kodende RNA af 20-22 nukleotider i længden, hvilket behandles fra større pre-miRNA ved RNase III-enzymet Dicer (DICER1) i miRNA dobbelthuse [3]. Én streng af denne duplex forbinder med RNA-induceret silencing kompleks (RISC), hvorimod den anden streng generelt nedbrydes af cellulære nukleaser [3]. MiRNA-RISC-komplekset binder til specifikke mRNA-mål, hvilket fører til translationel undertrykkelse eller spaltning af disse mRNA’er. Således miRNA modulerer proteinekspression ved at fremme RNA-nedbrydning, inhibering mRNA-translation, og i nogle tilfælde, som påvirker transskription. Selvom miRNA-medieret mRNA nedbrydning forekommer i pattedyr, er de fleste mammale miRNA menes at undertrykke målgenekspression på det translationelle niveau [4], [5], [6] via ufuldkommen baseparring til 3′-utranslaterede regioner (3 ‘ -UTRs) af deres mål mRNA’er. Denne form for translationel regulering giver cellen med en mere præcis, umiddelbar og energieffektiv måde at kontrollere ekspressionen af ​​et givet protein [7], da det får hurtige ændringer i proteinsyntese uden overskydende transkriptionel aktivering og efterfølgende trin i mRNA behandling. Derudover translationel kontrol af genekspression har den fordel, at let reversibel, hvilket giver cellen med stor fleksibilitet til at reagere på forskellige belastninger.

fluoropyrimidin kemoterapi (f.eks S-1 /Oxaliplatin og doxifluridin /Oxaliplatin) forbliver som en stor mulighed for avancerede mavecancerpatienter behandling. Tidligere undersøgelser har opdaget en række miRNA forbundet med kemoresistens til 5-FU og S1 baseret behandling af colorectal cancer [8], [9], [10], [11], [12], [13]. S-1 er en hidtil ukendt oral dihydropyrimidindehydrogenase (DPD) hæmmende fluoropyrimidin (DIF) baseret på en biokemisk modulering af 5-fluoruracil (5-FU); S-1 indeholder tegafur (FF) og to typer af enzym-inhibitor, 5-chlor-2,4-dihydroxypyridin (CDHP) og kaliumoxonat (oxo) i et molforhold på 1:0.4:1. Doxifluridin er fluoropyrimidin-derivat og aktiveres til 5-fluoruracil af uridinphosphorylase, hvilket er mere stærkt udtrykt i maligne celler. En række rapporter har vist, hvor vigtigt det miRNA i gastrisk kræft [14], [15], [16], [17]. Men i øjeblikket er der ingen undersøgelse af miRNA relateret til flupyrimidine kemoterapi behandling. Der er et presserende behov for at opdage prognostiske biomarkører til at hjælpe den kliniske behandling af fremskreden mavekræft, da dette vil bidrage til at vælge patienter, der vil have overlevelse gavn af behandlingen, undgå toksicitet over for ikke-respondenter, og reducere sundhedspleje omkostninger for patienterne.

Selv om flere miRNA profilering undersøgelser er blevet rapporteret til at afsløre betydningen af ​​miRNA i mavekræft med indvirkning på cellecyklus kontrol, apoptose, tumor invasion og metastase [14], [17], i øjeblikket er der ingen rapport link miRNA med kemoterapeutiske behandlinger med S-1 /Oxaliplatin og doxifluridin /Oxaliplatin. I denne undersøgelse, vi systematisk undersøge forholdet af udvalgte kandidat miRNA (f.eks miR-21, miR-181b, miR-192, miR-140, lad-7g) i form af deres kliniske anvendelighed i mavekræft hjælp arkivering gastrisk kræft FFPE prøver . Disse miRNA har været tidligere rapporteret at være forbundet med fluoropyrimidin baseret kemoresistens i kolorektal cancer [9], [10], [11], [12], [13]. Pre-kemoterapi prøver blev udvalgt fra S-1 /Oxaliplatin og doxifluridin /Oxaliplatin i fremskreden mavekræft. Vi har tidligere vist, at miRNA er ret stabil i FFPE prøver, og det er ideelt til biomarkør opdagelse [18]. Patienter behandlet med S-1 /Oxaliplatin havde et bedre svar end doxifluridin /Oxaliplatin. Der er imidlertid ingen forskel i den samlede patients overlevelse. Vi opdagede, at miR-21 og miR-181b er signifikant associeret med mavekræft resultat med S-1 /Oxaliplatin kemoterapi. Til vores bedste viden, dette er den første rapport til at demonstrere den prognostiske betydning af miRNA i gastrisk cancer relateret til S-1 /Oxaliplatin og doxifluridin /Oxaliplatin behandling. miR-21 og miR-181b holde stort potentiale som prognostiske biomarkører i sent stadium mavekræft.

Metoder

Patienter og prøver

Klinisk prøve kohorter, der anvendes til dette studie blev godkendt af institutionen Review Board of Third Tilknyttede Hospital i Soochow University. Paraffin blokke med formalin-fikserede prøver af væv (FFPE) er erhvervet fra arkivers samlinger af Patologisk Institut, og anvendes til efterfølgende RNA ekstraktion. Kendetegnene for disse patienter er vist i tabel 1.

RNA Isolation

Brug arkivering FFPE væv blev særskilte områder i solid tumor og normal gastrisk epitel identificeret ved hjælp af den tilsvarende Hematoxylin og eosin farvede sektioner og kerner, der måler 1,5 mm i diameter og 2 mm i længden (ca. 0,005 g) blev udvundet. Efterfølgende blev prøverne behandlet med afparaffinering, hydrering, proteinase K, og i sidste ende totale RNA’er blev isoleret ved anvendelse af TRIZOL-reagens (Invitrogen, CA, USA) [18].

Real time QRT-PCR-analyse af miRNA udtryk

mIR-21, miR-140, blev lad-7g, miR-181b, miR-200C, miR-192 specifikke primere og den interne kontrol RNU44 gen købt fra Applied Biosystems (CA, USA). cDNA-syntese blev udført af High Capacity cDNA Synthesis Kit (Applied Biosystems) med miRNA specifikke primere. Real time kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR) blev udført på et Applied Biosystems 7500 Real time-system (ABI 7500HT instrument) med miRNA specifikke primere ved TaqMan Gene Expression analysen. Ekspression af miRNA-værdier blev normaliseret i henhold til den interne RNU44 kontrol, og de relative udtryk værdier blev afbildet.

Statistisk analyse

Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af GraphPad Prism-software 5.0. Genekspression ACt værdier af miRNA fra hver prøve blev beregnet ved at normalisere efter intern kontrol RNU44 udtryk, og relative kvantificering værdier blev plottet. Forskellene mellem tumor og normale væv blev analyseret ved Wilcoxon matchede-par test. En Kaplan-Meier overlevelseskurve blev dannet ved udførelse af en Cox proportionel risiko regressions analyse for at evaluere ekspressionsniveauet af MIR-21 og MIR-181b med overlevelsesrate. Statistisk signifikans blev oprettet for at

P

. 0,05 i hver test

Resultater og Diskussion

Enorm mængde af indsatsen har været fokuseret på at opdage forudsigelige og prognostiske biomarkører for gastrisk cancer [19]. På grund af sygdommen medvirken af ​​gastrisk kræft, stadig det en stor udfordring at identificere kliniske nyttige biomarkører. Med anerkendelsen af ​​den brede betydning af miRNA på multi mål og veje, er det af vores interesse for at identificere en ny klasse af prædiktive og prognostiske biomarkører i gastrisk kræft baseret på miRNA. Der er flere fordele ved at bruge miRNA som biomarkør i forhold til mRNA som miRNA har bred regulerende funktion, relativt små tal og bedre stabilitet i arkivering FFPE prøver [18]. Vi rapporterer her, at ekspressionsniveauer af miR-181b og miR-21 udgør stærke prognostiske faktorer i avancerede gastrisk kræftpatienter på både S-1 /oxaliplatin og doxifluridin /oxaliplatin regimer. De kliniske og patologiske parametre for mavecancerpatienter behandlet med doxifluridin /Oxaliplatin eller S-1 /Oxaliplatin blev anført i tabel 1.

Differentiel udtryk for miRNA i mavekræft

Vi har nøje udvalgt en række miRNA kandidater, der har været tidligere rapporteret at være forbundet med fluoropyrimidin baseret kemoresistens i kolorektal cancer [9], [10], [11], [12], [13]. Ekspressionsniveauerne af miRNA blev kvantificeret via realtid QRT-PCR-analyse under anvendelse af totalt RNA ekstraheret fra gastriske cancer FFPE prøver og normale gastriske væv som kontroller. De miRNA Ekspressionsniveauerne blev yderligere normaliseres ved hjælp af intern kontrol RNU44. De fleste af de miRNA (fx MIR-140, MIR-200C) har vi kvantificeres vist differentiel ekspression mellem normale og tumorvæv (figur 1). Udtrykket af en vigtig miRNA, miR-200C, blev signifikant reduceret i mavekræft. MIR-200C er blevet rapporteret til direkte forbundet med cheomosensitivity og epithelial-til-mesenchymal overgang (EMT) [20]. Udtrykket af miR-181b (

P

= 0,022) og miR-21 (

P

= 0,0029) var mest markant overudtrykt i gastriske tumorer sammenlignet med normale gastrisk væv (Figur 2). Vores resultater er i overensstemmelse med tidligere rapporter, at disse miRNA blev liberaliseret i gastrisk kræft [21].

Foreningen af ​​miR-21 og miR-181b med respons på S-1 /oxaliplatin og doxifluridin /Oxaliplatin behandlingsregime

Den overordnede objektive responsrate (CR + PR) af patienterne behandlet med S-1 /Oxaliplatin var 33,3% (CR + PR)

vs.

17,6% (CR + PR) med doxifluridin /oxaliplatin til fase III og IV gastrisk kræftpatienter. Vi har udvalgt en række miRNA, der har vist sig at være forbundet med fluoropyrimidin baseret kemoresistens i tyktarmskræft [9], [10], [11], [12], [13] og systematisk evalueret deres potentielle forbindelse med doxifluridin /oxaliplatin og S -1 /Oxaliplatin i mavekræft. Den lave udtryk for miR-21 (

P

= 0,001) og miR-181b (

P

= 0,001) var signifikant associeret med S-1 /oxaliplatin respondenter (tabel 2). Dette er meget i overensstemmelse med foregående rapport, at miR-181b udtryk var forbundet med S1 behandling i kolorektal cancer [8]. Det er blevet rapporteret, at MIR-181b var forbundet med multi lægemiddelresistens (MDR) ved at målrette BCL2 [22]. Med hensyn til miR-21, vores resultater var i overensstemmelse med en nylig rapport, at undertrykkelse af miR-21 ved anti-miR sensibiliserer bugspytkirtelkræft cellelinier til Gemcitabin (fluoropyrimidin analog) behandling [23]. Men den positive respons ikke påvirke patientens samlede overlevelse som den gennemsnitlige samlede overlevelse for patienter behandlet med S-1 /Oxaliplatin (7,80 måneder) var ens med patienter behandlet med doxifluridin /Oxaliplatin (7,30 måneder). Dette er ikke overraskende så ofte tid positivt svar ikke oversætte til overlevelse.

miR-21 og miR-181b var signifikant associeret med patientens overlevelse

For at afgøre, om nogle af disse miRNA har potentiale som prognostisk biomarkør i mavekræft, vi udførte patientens overlevelse analyse ved hjælp Kaplan-Meier overlevelse kurven ved Multi variant Cox regressionsanalyse. Kaplan-Meier overlevelsesanalyse af Cox regression viste, at lave niveauer af miR-21-ekspression (Log rank test, hazard ratio: 0,17, CI = 0,06-0,45;

P

= 0,0004) og miR-181b (Log rang test, hazard ratio: 0,37, CI = 0,16-0,87;

P

= 0,018) er tæt forbundet med en bedre patientens samlede overlevelse for både s-1 og doxifluridin baserede regimer (figur 3). Betydningen af ​​miR-21 og miR-181b i mavekræft blev kraftigt støttet af en nylig rapport, at de udtryk for miR-21 og miR-181b blev aktiveret af STAT3 medieret af IL-6. miR-21 og miR-181b fungerer som en epigenetisk switch til at hæmme PTEN og CYLD tumorsuppressorer, hvilket fører til øget NF-kB-aktivitet kræves for at opretholde den transformerede tilstand [24]. Vi viste også, at ekspressionen af ​​både miR-21 og miR-181b er positivt associeret med hensyn til udtryk værdi baseret på den statistiske analyse (Pearson korrelation r = 0,38,

P

= 0,018; Spearman korrelation r

s = 0,38,

P

= 0,018). Det er ganske tænkeligt, at miR-21 og miR-181b fungerer som en epigenetisk skifte i gastrisk udvikling af kræft og bidrage til kemoresistens ved at modulere de vigtigste mål tumorsuppressorgener såsom PDCD4, ANP32A og SMARCA4 gener [25]. Forhøjet MIR-21 ekspression er blevet rapporteret i mange tumortyper, hvilket tyder på vigtigheden af ​​MIR-21 som en bona fide-onkogen. Det er blevet rapporteret MIR-21 var forbundet med

H. pylori

infektion og gastrisk cancerudvikling, hvilket antyder, at MIR-21 kunne være det potentielle epigenetisk link af betændelse i

H. pylori

infektion og tumor initiering af mavekræft [26].

Som konklusion, rapporterer vi her for første gang, at ekspressionen af ​​miR-181b og miR-21 var forbundet med S- 1 /Oxaliplatin og doxifluridin /Oxaliplatin behandling og patientens overlevelse. Det understøtter endvidere forestillingen for den potentielle betydning af miR-181b og miR-21 i gastrisk udvikling kræftsygdom. Den etablerer et fundament til yderligere at udforske understreger molekylære mekanisme af gastrisk udvikling kræft involveret med miR-181b og miR-21, og til fuldt ud at validere vores resultater til de store kohorte, multi-center klinisk forsøg patienter. miR-181b og miR-21 kan også have potentiale til at blive som nye terapeutiske mål i mavekræft.

Tak

Haifeng Deng, Mingyang Lu, Bin Xu, Min Li, Jian Liu, Zhengguang Li og Hongbing Shi leverede fremragende teknisk bistand.