PLoS ONE: Modstand mod Bleomycin i kræftceller er karakteriseret ved Langvarig fordoblingstid, Reduceret DNA Skader og Evasion af G2 /M Arrest og Apoptosis

Abstrakt

Baggrund

At etablere, karakterisere og belyse mulige mekanismer erhvervet bleomycin (BLM) modstand ved hjælp af menneskelige kræftceller. Syv BLM-resistente cellelinier blev etableret ved udsættelse for eskalerende BLM koncentrationer over en periode på 16-24 måneder. IC

50 værdier og celle fordoblingstider blev kvantificeret under anvendelse af et tidstro cytotoksicitet assay. Comet og γ-H2AX assays, cellecyklus analyser og apoptose vurdering undersøgt yderligere mekanismerne i BLM modstand i disse cellelinjer.

Resultater

I forhold til forældrenes cellelinjer, realtid cytotoksicitetsassays afslørede 7 til 49 gange stigninger i IC

50 og en gennemsnitlig fordoblingstid stigning på 147% (interval 64% -352 %) i BLM-resistente sub-kloner (p 0,05 for begge). Højere vedligeholdelse BLM koncentrationer blev forbundet med højere IC

50 og øget fordobling gange (p 0,05). Signifikant reduceret DNA-beskadigelse (Comet og γ-H2AX assays), G2 /M arrest, og apoptose (p 0,05 for hvert sæt af sammenligning) efter højdosis akut BLM eksponering blev observeret i resistente sub-kloner, sammenlignet med deres BLM- følsomme forældrenes modstykker. Tre uger af BLM-fri dyrkning resulterede i en delvis tilbagevenden til BLM følsomhed i 3/7 BLM-resistente sub-kloner (p 0,05).

Konklusion

Bleomycin resistens kan være forbundet med reduceret DNA-skader efter bleomycin eksponering, hvilket resulterer i reduceret G2 /M anholdelse, og reduceret apoptose

Henvisning:. Wang Q, Cui K, Espin-Garcia O, Cheng D, Qiu X, Chen Z, et al. (2013) Resistens mod Bleomycin i kræftceller er karakteriseret ved Langvarig fordoblingstid, Reduceret DNA Skader og Evasion af G2 /M og apoptose. PLoS ONE 8 (12): e82363. doi: 10,1371 /journal.pone.0082363

Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA

Modtaget: Juli 7, 2013; Accepteret: 23. oktober 2013; Udgivet: December 4, 2013 |

Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af prinsesse Margaret Hospital Foundation. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Bleomycin (BLM) er en glycopeptidantibiotikum isoleret fra

Streptomyces verticillis

[1,2]. Som et kemoterapeutisk middel, er det bruges til behandling af flere tumorer, herunder men ikke begrænset til testiklerne carcinomer, lymfomer og hoved og hals kræft [3,4]. Selv om den fulde pathway af lægemidlets virkningsmekanismen ikke er blevet belyst, er BLM binder til jern og oxygen til frembringelse af reaktive oxygenarter (ROS) [5], der inducerer single- og dobbelt-strengede DNA-brud, med sidstnævnte være hovedansvarlig for sine antitumorvirkninger [6,7]. Det medfører også lipidperoxidation og mitokondrie-DNA beskadigelse [8]. Udvidede celle-cellecyklusstandsnings /senescens, apoptose og mitotisk celledød er de mest almindelige cellulære reaktioner på BLM behandling [9].

BLM viste sig at fremkalde G2 /M cellecyklusstop i kræft cellelinjer [10,11]. Dette kan forklares med en G2 /M checkpoint respons på DNA beskadigelse. G2 /M checkpoint er vigtig for genomisk stabilitet, for det sikrer, at kromosomer er intakte og klar til separation før celler ind mitose [12]. I modsætning til G1 checkpoint, er G2 /M checkpoint-gener ofte ikke muteret i cancerceller [13].

Resistens mod BLM er en klinisk bekymring, og typisk forekommer under tilbagefald i kønscelletumorer, hvor BLM er mest almindeligt anvendt klinisk. Selv om mekanismen for BLM-resistens er uklar, har flere muligheder blevet foreslået, herunder: (a) ændret BLM indtag og efflux [14,15]; (B) forhøjet antioxidant niveau [5,11]; (C) forbedret reparation evne til BLM-induceret DNA-beskadigelse [14,16,17]; og (d) øget metabolisme (inaktivering) af BLM [17-19].

Udviklingen af ​​BLM resistens tjener som en vigtig mekanisme til unddragelse af kemoterapeutiske udryddelse i kræftceller. Men de mekanismer, der er ansvarlige for erhvervet BLM modstand i humane tumorceller er ikke blevet godt undersøgt. I denne undersøgelse har vi etableret BLM-resistens i syv humane cancercellelinier, herunder linjer af tumortyper i behandling med BLM og andre kendt for at være enten følsomme eller resistente over for BLM. Desuden har vi karakteriseret disse cellelinjer med hensyn til deres niveau af BLM-resistens, BLM-induceret DNA-skader, fordoblingstid, cellecyklusfordeling, og graden af ​​apoptose (før og efter BLM behandling) for at forbedre vores forståelse af de potentielle mekanismer modstand.

Materialer og metoder

Celler og cellekultur

Syv kommercielt tilgængelige humane cancer cellelinjer med store forskelle i medfødte følsomhed /resistens mod BLM (HOP62, ACHN, NT2 /D1, SF-295, NCCIT, NCI-H322M, og MBA-MB-231) blev valgt fra National Cancer Institute (NCI) eller American Type Culture Collection (ATCC) [20]. To (NT2 /D1, NCCIT) var testiklerne cellelinier (tabel 1).

Cell linje

forkortelse (Parental /Resistant)

Stammer fra hvilken kræfttype

Parental IC

50 (ug /m) *

ACHNACHN

0Renal celle carcinoma0.009ACHN

0.25HOP-62HOP

0Lung adenocarcinoma0.11HOP

0.05SF-295SF

0CNS glioblastom 0.14SF

0.4NT2 /D1NT2

0Germ celle carcinomaN /ANT2

0.1NCCITNCCIT

0Germ celle carcinomaN /ANCCIT

1.5NCI-H322MH322M

0Lung adenocarcinoma25.8H322M

2.5MDA-MB-231MB231

0Breast adenocarcinoma27.9MB231

3.0Table 1. Beskrivelse af cellelinier.

Bemærk: Cellelinjer med indeks “0” angiver forældrekontrol (kontrol) linjer (f.eks HOP

0). De resistente sub-kloner har en sænket identificere dens vedligeholdelse BLM koncentration i pg /ml (fx HOP

0,05). * Data fra NCI-60 narkotika screening panel [20]. CSV download CSV

NT2 /D1 blev opretholdt i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM). Andre linjer blev dyrket i RPMI 1640. Betingelserne var 10% føtalt bovint serum (FBS), 1% penicillin /streptomycin ved 37 ° C i 5% CO

2. Celler blev dyrket som monolag i 75 cm

2 celledyrkningskolber medmindre andet er angivet. Alle cellelinjer testet negativ for mycoplasma forurening med Polymer (PCR) metoder [21]. Cellelinjer blev autentificeret ved hjælp af Short Tandem Gentager (STR) test [22].

Etablering af bleomycin-resistente sub-kloner fra forældrenes (kontrol) cellelinjer

At udvikle BLM-modstand, celler blev konstant udsat for trinvise stigninger i koncentrationen af ​​BLM over en periode på 16 til 24 måneder. Kort fortalt blev cellerne podet ved en densitet på ~ 5 × 10

5 /ml i en T75 cellekultur kolbe med 10 ml komplet vækstmedium. Efter 4-6 timers inkubation, relativt lave koncentrationer af BLM (fra 0,01 til 0,1 pg /ml afhængigt af den medfødte BLM-følsomhed), opløst i phosphatbufret saltvand (PBS) uden Ca

2+ og Mg

2+, blev tilsat til mediet. Celler blev efterladt i BLM for 2 til 4 uger eller indtil en stabil celle re-population dannet. Regelmæssig medium genopfyldning blev udført i hele denne periode. BLM koncentration blev derefter forøget med 0,5 til 2 gange. Denne trinvise dosisøgning fortsættes i 16 til 24 måneder, indtil BLM koncentration opnået mindst ti gange udgangskoncentrationen. Derefter blev alle BLM-resistente cellelinier ( “BLM-resistente sub-kloner”) bibeholdes i deres højeste opnået BLM koncentration ( “vedligeholdelsesdosis”). Samtidig blev der regelmæssig passage af de parentale cellelinier udføres parallelt med BLM-resistens etablering proces.

BLM følsomhed test og fordoblingstid analyse

Forud for BLM modstand /følsomhed vurdering (cytotoksicitet assay), en celle proliferation assay blev udført på xCELLigence systemet (Roche, USA) for at identificere de optimale betingelser, hvorunder realtid cytotoksicitet assay skal køre. Specifikt blev proliferationsassayet udført: a) at identificere den optimale udsåningstæthed for cytotoksicitetsassayet for hver af cellelinierne; og b) at bestemme varigheden af ​​cytotoksicitetsassayet.

proliferationsassay blev udført ved podning forskellige antal celler i en 96-brønds plade (E-plade 96, Roche, USA) i fire eksemplarer, efterfulgt af tidstro overvågning af cellulær vækst i op til 7 dage . Fireogtyve timer efter podning blev halvdelen af ​​brøndene på pladen behandlet med BLM at bestemme den cellulære reaktion. Proliferationsassayet blev gentaget to gange på hver cellelinie. Optimale seeding tætheder for hver linje blev udvalgt på baggrund af dramatiske ændringer i spredning på 72-96 timer efter BLM behandling og små variationer på tværs replikatbrønde.

I cytotoksicitetsassays blev celletallet først udført, og cellerne blev derefter podet i tre fordybninger med 180μl af BLM-frit celledyrkningsmedium på en plade med 96 brønde. Fireogtyve timer efter indledende udpladning blev 20 pi cellekulturmedium indeholdende seriefortyndet BLM i området fra 0 til 800 ug /ml tilsat til hver brønd. Antallet af levedygtige levende celler blev overvåget hvert 15. minut, for i alt mindst 120 timer. IC

50 (integreret software, xCELLigence system) og fold forskelle i IC

50 mellem BLM-resistente og forældrekontrol (kontrol) cellelinier (IC

50 BLM-resistente /IC

50 kontrol) var efterfølgende beregnet. Den hurtigste vækstperiode observeret for hver af cellelinierne i proliferationsassay blev isoleret for fordoblingstid beslutning og om den procentvise ændring blev beregnet ved anvendelse xCELLigence systemsoftware.

Comet assay vurdering af BLM-induceret DNA-skader

BLM er kendt for at forårsage DNA-skader i celler [6,7]. For at bestemme de første (basislinje) og DNA-strengbrud efter højdosis BLM udsætte blev alkaliske Comet assays (encellede gelelektroforese) udført [23] for hver af de parentale og resistente sub-kloner. Olive Tail Moment (OTM) værdier på et hundrede celler blev scoret tilfældigt per dias ved hjælp af fluorescens-mikroskop med KOMET 5.0 software (Kinetic Imagine).

BLM-induceret γ-H2AX foci dannelse

DNA dobbelt-strenget pauser (DSBs) udløser den cellulære dannelse af γ-H2AX foci (phosphoryleret H2AX protein) [24]. For at bekræfte det cellulære DNA-skader reaktion på BLM gennem Comet assay blev kvantitativ analyse af γ-H2AX foci dannelse efter højdosis BLM eksponering udført på en delmængde af fire forældre /resistente par (HOP, ACHN, NCCIT, og H322M) [25 ] med phospho-histon H2AX pSer139 monoklonalt antistof og Alexa Flour 488-konjugeret anti-phospho-H2AX (BioLegend, San Diego, CA, USA). Mindst 10000 hændelser blev talt på flowcytometer for hver måling; intensiteten af ​​γ-H2AX, som direkte korrelerer med cytometri tæller, blev analyseret under anvendelse Cell Quest software (BD, USA).

cellecyklusfordeling analyse

cellecyklus fordelinger af hver af parret af syv forældre og resistente sub-kloner blev testet før og efter 24 timers høj dosis BLM eksponering ved ti gange de resistente sub-kloner ‘koncentration vedligeholdelse. Derefter blev celler i mono-dispergeret suspension fikseret med ethanol efterfulgt af propidiumiodid (PI) farvning (PI, Sigma, USA) og analyseret ved anvendelse af FACScalibur flowcytometer (BD, USA). Procenter af celler hviler i G1, S og G2 /M fase blev bestemt (CellQuest software, BD, USA og ModFit LT software, Verity Software House). Cellecyklusfordeling blev målt i hver parental /BLM-resistente par ved baseline og på forskellige tidspunkter op til 24 timer af BLM behandling. Korrelationer mellem cellecyklusfordeling, IC

50 værdier, og cellelinie fordoblingstider blev analyseret.

Annexin V /PI analyse for BLM-induceret apoptose

For at bestemme celle apoptose før og efter BLM behandling, en repræsentativ delmængde af fire forældre /resistente par (HOP, ACHN, NCCIT, og H322M) blev behandlet med 24 timers høj dosis BLM. Cellerne blev derefter farvet med Annexin V-FITC og PI, og vurderet for apoptose ved flowcytometri ifølge fabrikantens protokol (BD PharMingen, San Diego, CA, USA). Både tidligt (Annexin V-positive, PI-negativ) og sent apoptotiske celler (Annexin V-positive, PI-positive) blev talt som apoptotiske celler.

Statistisk analyse

For at vurdere behandlingen betydning eller forskel, parret t-test eller uparret t-test (afhængigt af de eksperimentelle specifikationer) blev udført med en to-sidet signifikansniveau på 0,05. Normalitet antagelser blev vurderet via Shapiro-Wilks test. Når normalitet antagelse ikke kunne holdes, parret eller uparrede Wilcoxon rank-sum test blev udført i stedet. For Comet assay vurdering mellem forældrenes og resistente sub-kloner efter højdosis BLM behandling blev p-værdier beregnet ved hjælp af en t-statistik for ikke-ens varianser, teste nulhypotesen om lighed på log nøgletal. Logistisk regression blev udført for at vurdere baseline G2 /M distributionssystemer forskelle mellem parentale og resistente sub-kloner. For at undersøge sammenhængen mellem forskellige foranstaltninger (IC

50 kontrol, IC

50 ændring efter højdosis BLM behandling, fordoblingstid, og cellecyklus distribution), blev lineære regressionsanalyser udført. Alle analyser blev udført ved hjælp af SAS-version 9.2 eller SPSS-version 13.0. Salg

Resultater

BLM-resistente cellelinier vedligeholdes på BLM stabilt viste højere IC

50 værdier og forlængede fordobling gange

Alle syv BLM-resistente sub-kloner viste større IC

50 end deres forældre modstykker (figur 1). Cytotoksicitetsassays viste mellem 7-49 gange stigninger i IC

50 i BLM-resistente sub-kloner. En positiv korrelation blev observeret mellem vedligeholdelse BLM koncentration og IC

50 værdier (p 0,001, R

2 = 0,58). Efter længere tids BLM eksponering, cellelinier med bedre forældrekontrol følsomhed til BLM (middel IC

50, 0,1 ug /ml) udviste en større stigning i resistens (gennemsnit af 48 gange) sammenlignet med parentale linier, der var mindre følsomme (gennemsnit IC

50, 9μg /ml, 15 fold; p 0,05 sammenligne forældrenes følsom over for mindre følsomme linjer).

Lineære regressionsmodeller fastslået, at højere værdier af IC

50 var forbundet med lavere værdier af fold ændring (logaritme skala hældning: -0,11 (standard fejl: 0,02), P 0,0001, R

2 = 0,58). Hver IC

50 værdi er gennemsnittet af forsøg udført tredobbelt.

Det blev observeret, at BLM-resistente sub-kloner voksede langsommere end deres forældre cellelinjer. To cellelinier, når det holdes i højere koncentrationer af BLM, såsom MB231

3,0 og H322M

2,5 (sænket betegne vedligeholdelse BLM koncentration), udviste også udvidet og udfladet cellemorfologi ligner den for celleældning forhold til deres parentale linier , men først efter mange generationer. I modsætning hertil akut udsættelse for høje doser af BLM ikke medføre morfologiske ændringer. Den langsommere cellevækst blev bekræftet ved celle fordoblingstid beregnet med xCELLigence systemet. Alle BLM-resistente sub-kloner viste statistisk signifikant fordoblingstid forlængelse med en gennemsnitlig fordoblingstid stigning på 147% (interval: 64% -352%) sammenlignet med deres parentale cellelinier (figur 2, s 0,05). Der var ingen sammenhæng mellem celle fordoblingstid og IC

50-værdier, og ingen mellem den procentvise stigning i fordoblingstid og fold stigning i IC

50.

Mean fordoblingstid ± standardfejl på middelværdien (SEM, n = 3) blev rapporteret. Den gennemsnitlige fordoblingstid (målt i timer) af de parentale linier var kortere end for BLM-resistente sub-kloner i alle syv cellelinier. * P 0,05 i forhold til forældrenes.

For at teste stabiliteten af ​​BLM modstand i BLM-resistente sub-kloner, sammenligninger i IC

50 værdier og en fordobling gange blev foretaget mellem normalt vedligeholdt BLM-resistente sub-kloner og samme resistente sub-kloner, som efterfølgende blev dyrket i BLM-frit medium i tre uger. Efter tre ugers BLM-fri dyrkning, tre af de oprindeligt resistente sub-kloner (herunder både testikulære cellelinier NT2

0,1, NCCIT

1.5 og lungekræft cellelinien HOP

0,05) udviste et signifikant IC

50 reduktion (figur 3) og fordoblingstid reduktion (figur 4), når der sammenlignes med vedligeholdes regelmæssigt BLM-resistente sub-kloner. Der var ingen statistisk signifikante ændringer i IC

50 og fordoblingstid i de resterende fire linjer.

Eksperimenter blev udført tre gange. Log IC

50 sammenligninger blev udført. Tre (HOP

0,05, NT2

0,1, og NCCIT

1.5) af de syv cellelinjer havde betydelige reduktioner i IC

50 værdier efter tre ugers BLM-fri vedligeholdelse. * P 0,05 for sammenligninger mellem BLM resistente sub-kloner og deres tilsvarende modparter med tre ugers behandling pause.

Eksperiment blev udført tre gange. Tre (HOP

0,05, NT2

0,1, NCCIT

1.5) af de syv celle BLM-resistente linjer udviste signifikant fald i fordoblingstid efter tre ugers BLM-fri behandling. * P. 0,05 sammenlignet med efter fjernelse BLM for 3 uger cellelinjer

BLM resistens kan være dosisafhængig

I betragtning af at der eksisterer en generel sammenhæng mellem IC

50 værdier og vedligeholdelse BLM koncentrationer tværs 7 cellelinjer (figur 1), blev muligheden for dosisafhængig BLM modstand testet. For den enkelte cellelinje ACHN, IC

50 værdier blev opnået fra ACHN

0 (parental linie), og dets to resistente sub-kloner, ACHN

0,1 og ACHN

0,25. En positiv korrelation blev fundet mellem vedligeholdelse BLM koncentrationer (0, 0,1 og 0.25μg /ml) og deres IC

50 værdier (0,01, 0,29, og 0.74μg /ml, p 0,05). Desuden blev en positiv korrelation også observeret mellem BLM koncentrationer vedligeholdelse og en fordobling gange (0μg /ml-12hrs, 0,1 ug /ml-16.5hrs, 0.25μg /ml-23.5hrs, p 0,05). Dette fund blev ikke testet eller bekræftet i nogen af ​​de andre cellelinjer.

BLM-resistente sub-kloner havde mindre BLM-induceret DNA-skader i Comet analyser

Kvantificering af DNA-skader i alle syv parentale /resistente par ved hjælp Comet assay (målt i OTM) viste, at forud for BLM behandling, seks af de syv resistente cellelinier havde højere basal DNA-skader i forhold til kontrol (undtagelsen var HOP

0,05, p 0,05). Denne generelt korreleret med forlænget basalcelle fordoblingstid observeret i disse resistente sub-kloner. Efter høje doser BLM behandling, fem af syv resistente sub-kloner (SF

0,4, HOP

0,1, NT2

0,1, NCCIT

1.5, og H322M

2.5) havde lavere DNA-skader end deres forældre linjer. Ingen stigning i DNA-skader efter BLM eksponering blev observeret i fem af syv resistente linjer (SF

0,4, NT2

0,1, NCCIT

1.5, H322M

2,5, og MB231

3.0). I modsætning hertil alle parentale cellelinjer havde større DNA-beskadigelse post- BLM end præ- BLM (p 0,05 for hver sammenligning, figur 5). Endvidere alle syv forældre linier vises signifikant større DNA-skader stigning post BLM behandling i forhold til deres resistente modstykker (p 0,05).

Forsøg blev kørt tredobbelt. Celler blev underkastet høj dosis BLM eksponering (svarende til ti gange deres respektive koncentrationer vedligeholdelse) i 24 timer. OTM blev anvendt til DNA-fragmentering (skade) kvantificering, og blev beregnet som: OTM = (Tail.mean – Head.mean) × (Tail% DNA) /100. Comet assay afslørede større stigning i DNA-fragmentering (udtrykt i OTM niveauer) efter BLM behandling i alle forælderlinjer * P. 0,05 for sammenligning mellem cellelinier før og efter høje doser BLM behandling. Alle forælderlinjer udviste signifikant stigning i DNA-beskadigelse. # P 0,05 for sammenligning mellem forældre og resistente cellelinier ved baseline (forbehandling). Alle BLM-resistente linjer undtagen HOP

0.05 udstillet øget DNA-skader ved baseline i forhold til deres forældre linjer. P 0,05 for sammenligning mellem resistente cellelinier og parentale cellelinje efter BLM behandling. Mindre DNA-skader (i forhold til deres forældre linjer) post- BLM behandling blev fundet i fem af syv BLM-resistente cellelinier (SF

0,4, HOP

0,1, NT2

0,1, NCCIT

1,5, og H322M

2.5).

BLM-resistente sub-kloner havde reduceret γ-H2AX niveauer i forhold til deres forældre linjer efter højdosis BLM behandling

Som en anden foranstaltning af cellulært respons på DNA skader, γ- H2AX blev også vurderet i en delmængde af fire cellelinier (HOP, ACHN, NCCIT og H322M). Efter 24 timers høj dosis BLM behandling, γ-H2AX intensiteter steg i alle parentale cellelinjer. I de resistente sub-kloner, øget γ-H2AX intensiteter kun blev observeret i to af fire linjer (ACHN

0,25 og HOP

0,05, figur 6). Dette er i overensstemmelse med de Comet analyser. Tre (HOP

0,05, NCCIT

1.5, og H322M

2.5) af de fire resistente sub-kloner udviser signifikant mindre ændring i γ-H2AX intensitet (γ-H2AX intensitet efterbehandling minus forbehandling) sammenlignet med deres forældre sub-kloner post- BLM behandling (p 0,05). Denne tendens var borderline signifikant i fjerde linie (H322M

2,5, p = 0,054).

Forsøg blev kørt i tre eksemplarer. Celler blev underkastet høj dosis BLM eksponering (svarende til ti gange deres respektive koncentrationer vedligeholdelse) i 24 timer. Flowcytometrisk påvisning af BLM-induceret γ-H2AX foci dannelse blev derefter opnået i en delmængde af fire cellelinier (ACHN, hop, NCCIT og H322M). * P 0,05 for sammenligning mellem cellelinier forudgående og efter høje doser BLM behandling. Alle forælderlinjer udviste signifikant stigning i dannelse af γ-H2AX. # P 0,05 for sammenligning mellem forældre og resistente cellelinier ved baseline (forbehandling). En af fire BLM-resistente cellelinier (NCCIT

1.5) havde større γ-H2AX dannelse end forældrenes modstykke ved baseline. P 0,05 for sammenligning mellem resistente og forældrenes cellelinier efter BLM behandling. To af fire BLM-resistente cellelinier (HOP

0,1 og NCCIT1.

5.) Viste signifikant mindre γ-H2AX dannelse end deres forældres kolleger skrive BLM behandling, med en tredje linje (H322M

2.5) er borderline signifikant (p = 0,054).

BLM-resistente cellelinier havde en lavere procentdel af G2 /M anholdelse efter højdosis BLM eksponering

Da cellecyklusstop ved G2 /M fase var en karakteristisk generel cellerespons på BLM eksponering, evne til BLM-resistente sub-kloner til at undertrykke BLM-induceret G2 /M arrest blev evalueret. Som vist i figur 7, tre af syv BLM-resistente sub-kloner (HOP

0,05, NCCIT

1.5, og H322M

2.5) udviste større G2 /M fase fordeling ved baseline, sammenlignet med deres forældre linier (p 0,05). Tilsvarende for de andre fire cellelinier, de resistente sub-kloner udviste også større G2 /M-fase-fordelingen ved baseline, selvom ikke-signifikant. Efter 24 timers høj dosis BLM eksponering, fem (SF

0,4, NT2

0,1, NCCIT

1.5, H322M

2,5, og MB231

3,0) af syv BLM-resistente sub-kloner udstillet en lavere G2 /M distributionen end deres tilsvarende forælderlinjer (p 0,05). Sammenligning af% G2 /M fordeling før og efter 24 timers høj dosis BLM behandling, alle parentale cellelinjer udviste stigninger i G2 /M fordeling efter behandlingen (p 0,05) .Den samme tendens blev set i alle resistente sub-kloner, selv om to (NT2

0,1 og MB231

3.0) var ikke-signifikant. Omfanget af% G2 /M distributionen stigning (beregnet som% G2 /M

efterbehandling minus% G2 /M

forbehandling) var mindre for alle resistente sub-kloner end deres tilsvarende forældrenes linjer (p 0,05).

Høj dosis BLM behandling svarer til ti gange den tilsvarende koncentration for hver cellelinie vedligeholdelse. Middelværdi ± SEM (n = 3) værdier er rapporteret. * P 0,05 til sammenligning mellem cellelinier før og efter højdosis BLM behandling. Alle forælderlinjer udviste signifikante stigninger i G2 /M cellecyklusfordeling. # P 0,05 for sammenligning mellem forældre og resistente cellelinier ved baseline (forbehandling). Tre af syv BLM-resistente cellelinier (HOP

0,05, NCCIT

1.5, og H322M

2.5) udviste forøget% G2 /M fordeling ved baseline i forhold til deres forældre cellelinjer. P 0,05 for sammenligning af% G2 /M fordeling mellem forældrenes og resistente cellelinier efter BLM behandling. Mindre% G2 /M fordeling end forældrenes linjer blev fundet i fem ud af syv BLM-resistente cellelinier (SF

0,4, NT2

0,1, NCCIT

1.5, H322M

2,5, og MB231

3,0) efter BLM behandling.

G2 /M anholdelse bliver fremtrædende efter 8 timers høj dosis BLM behandling

For at vurdere timingen af ​​G2 /M anholdelse efter højdosis BLM eksponering, fire cellelinjer (den medfødt BLM følsomme HOP og ACHN linjer, den NCCIT testikel linje og medfødt BLM resistente H322M, de samme linjer evalueret for γ-H2AX eksperiment) gennemgik et tidsforløb analyse. Selv om der var stigende G2 /M anholdelse i både forældre og BLM-resistente sub-kloner (figur 8), blev denne arrestation mest fremtrædende set mellem 8 og 12 timer efter BLM behandling i forældrenes celler.

Eksperimenter blev kørt i tre eksemplarer. G2 /M fordeling blev fundet at være højere i forældrelinjer (sammenlignet med resistente sub-kloner) 8 timer efter BLM behandling.

Reduceret apoptose blev fundet i BLM-resistente sub-kloner

Brug de samme fire parrede sub-kloner, vi undersøgt, om celler undergik apoptose efter høje doser BLM behandling. Efter 24 timers BLM behandling, var procentdelen af ​​apoptotiske celler steg i alle fire testede forældrelinjer (figur 9). I modsætning hertil ingen resistente sub-kloner udviste statistisk signifikante stigninger i apoptose efter BLM behandling. Dette var i overensstemmelse med Comet assay (DNA-skader) analyse. Desuden tre af fire resistente sub-kloner (HOP

0,05, NCCIT

1.5, og H322M

2.5) udviste betydeligt mindre stigning i apoptose (% apoptose efter minus% apoptose før BLM behandling) i forhold til deres forældres linjer efter BLM behandling (p 0,05). Dette generelt korreleret med reduceret DNA-skader og G2 /M cellecyklusstop i BLM-resistente sub-kloner (sammenlignet med forældrenes linjer, efter behandling) som observeret tidligere.

* P 0,05 for sammenligning mellem cellelinier før og efter højdosis BLM behandling. Alle forælderlinjer men ingen resistente linjer udviste betydelige stigninger i apoptose post BLM behandling. P 0,05 for sammenligning mellem resistente og forældreorlov cellelinje efter BLM behandling. Mindre celle apoptose blev fundet i tre (HOP

0,05, NCCIT

1.5, og H322M

2.5) af fire BLM-resistente linjer, i forhold til deres forældre linjer.

diskussion

i denne undersøgelse har vi med succes etableret syv BLM-resistente humane cancercellelinier fra kommercielt tilgængelige cancer cellelinjer af forskellige organsystemer oprindelser (lunge, testikel, bryst, nyrer, samt centralnervesystemet). Efter pludselig akut, kortvarig udsættelse for BLM, disse BLM-resistente sub-kloner udstillet mindre DNA-skader, havde længere fordobling gange, havde en lavere andel af celler i G2 /M anholdelse, og havde reduceret apoptose, i forhold til deres mere BLM-sensitive forældre cellelinjer. BLM-resistente cellelinier blev udviklet ved gradvist at forøge inkubering BLM koncentration over en længere periode på 16-24 måneder. Tidligere undersøgelser har måske brugt lignende metoder i at dyrke BLM resistente sub-kloner. Imidlertid er få af dem nåede det høje BLM-resistens observeret i denne undersøgelse (som var 7-49 gange stigning i IC

50 mellem resistente og parentale subkloner, når der sammenlignes med en 3-20 gange stigning i en anden undersøgelse [15]). Desuden gennem analyser af BLM-induceret DNA-skader, cellecyklusfordeling, og procentdele af apoptose, flere formodede mekanismer BLM modstand /følsomhed blev evalueret.

BLM er kendt for at forårsage forlænget G2 /M anholdelse og /eller celle apoptose [9] i BLM sensitive celler. Dette kan være medieret af ATM /ATR [26,27], opstrøms proteiner af en DNA-reparation og signalvejen, der udløser G2 /M anholdelse eller celle apoptose via en række efterfølgende genprodukter såsom chk1 /2, CDC-25 [28 ], p53, og p21

WAF1 /CIP1, hvor de to sidstnævnte er afgørende for at opretholde G2 /M cyklus anholdelse [29]. Desuden blev histon H2AX fundet nødvendigt for aktiveringen af ​​G2 /M check point [30].

Comet og y-H2AX resultater afslørede mindre BLM-induceret DNA-skader i de resistente linjer, hvilket antyder, at de resistente sub-kloner, kan have en forøget evne til at forebygge og /eller reducere DNA-skader forårsaget af BLM. Dette kan skyldes reduceret cellulær optagelse af BLM, og /eller forstærket BLM elimination /afgiftning, medieret af celleoverfladereceptorer eller transportører [31], antioxidant molekyler /enzymer, der reducerer BLM-genereret ROS [11,32]; eller enzymer, som inaktiverer BLM [33,34]. Fremtidige undersøgelser nødt til yderligere at studere disse mekanismer.

I denne undersøgelse BLM modstand resulterede også i mindre G2 /M anholdelse og celle apoptose, i overensstemmelse med resultaterne fra en tidligere undersøgelse på en enkelt BLM-resistent linje [11] . Den lille stigning i G2 /M standsning ved baseline (før højdosis BLM behandling) for disse BLM resistente sub-kloner kunne forklares ved kronisk eksponering for BLM. Det faktum, at BLM-resistente celler var i stand til at formere sig ved en BLM koncentration, der ikke var levedygtige i deres forældrelinjer antyder, at unddragelse af cellecyklus blokering kunne være en anden mekanisme af resistens. Tilsammen tyder vore resultater, at BLM resistente celler kan have opnået forøget evne til at forebygge /reducere DNA-skader forårsaget af BLM. Dette vil til gengæld kan have ført til den reducerede G2 /M og apoptose.

En trinvis dosis eskalerende metode til BLM resistensudvikling kan resultere i en dosis-respons forholdet mellem BLM koncentrationer vedligeholdelse, IC

50 værdier og fordobling gange observeret i ACHN

0, AHCN

0.1 og AHCN

0,25 celler. Men indtil disse resultater bekræftes i andre sæt af sub-kloner, vil dette være et interessant fund med behov for validering.

Efter at have fjernet vedligeholdelse BLM koncentrationer fra alle syv resistente sub-kloner, der var delvis tilbageførsel af IC

50 værdier, og fordoblingstid i tre af syv cellelinjer. Fraværet af reversibilitet i de andre fire cellelinier kunne være resultatet af individuelle cellelinje forskelle, eller måske Disse cellelinier nødvendige længere pauser fra BLM eksponering at udvikle BLM følsomhed igen. Så vidt vi ved, har litteraturen om reversering BLM-resistens i cancercellelinier været yderst begrænset.