PLoS ONE: BART Forhindrer kræft i bugspytkirtlen Cell Invasion af PKCa Inaktivering gennem Binding til ANX7

Abstrakt

En roman funktion for bindemidlet af Arl to (BART) molekyle i bugspytkirtelkræftceller rapporteres. BART hæmmer invasivitet af bugspytkirtelkræftceller gennem binding til en Ca

2 + -afhængig, phosphoryleret, guanosin triphosphatase (GTPase) membranfusionsprotein, annexin7 (ANX7). En tumor suppressor funktion for ANX7 blev tidligere rapporteret baseret på dens prognostisk rolle i humane cancere og kræft-tilbøjelige mus fænotype

ANX7

(+/-). Yderligere undersøgelser viste, at BART-ANX7 kompleks transporteres mod celle fremspring i migrerende celler, når BART understøtter binding af ANX7 til protein kinase C (PKC) isoformen PKCa. De seneste oplysninger har foreslået, at phosphorylering af ANX7 af PKC væsentligt potenserer ANX7-induceret fusion af phospholipidvesikler; Men de aktuelle data tyder på, at BART-ANX7 kompleks reducerer PKCa aktivitet. Knocking ned endogene BART og ANX7 øger aktiviteten af ​​PKCa, og specifikke inhibitorer af PKCa væsentligt ophæver invasionsevne fremkaldt af BART og ANX7 knockdown. Disse resultater indebærer, at BART bidrager til at regulere PKCa aktivitet ved binding til ANX7 og dermed påvirke invasiv af bugspytkirtelkræftceller. Således er det muligt, at BART og ANX7 tydeligt kan regulere nedstrøms signalering af PKCa der er potentielt relevant for celleinvasion ved at fungere som anti-invasive molekyler

Henvisning:. Taniuchi K, Yokotani K, Saibara T (2012 ) BART Hæmmer kræft i bugspytkirtlen Cell invasion af PKCa Inaktivering gennem Binding til ANX7. PLoS ONE 7 (4): e35674. doi: 10,1371 /journal.pone.0035674

Redaktør: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, USA

Modtaget: Januar 29, 2012; Accepteret: 19 Marts 2012; Udgivet: 19 april, 2012 |

Copyright: © 2012 Taniuchi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev understøttet af en Grant-in-Aid fra Ministeriet for sundhed, arbejde og velfærd i Japan. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

bindemiddel af Arl to (BART) molekyle er et opløseligt 19 kDa proteinet oprindeligt oprenset fra bovin hjerne og identificeret som en bindingspartner af ADP-ribosylering faktor-lignende 2 (ARL2) [1]. Bindingen af ​​BART til ARL2 er af høj affinitet og afhængig af bindingen af ​​GTP til ARL2 [1]. Særskilte funktioner er blevet udledes konstateringer, ARLs mangler de biokemiske eller genetiske aktiviteter karakteristiske for ADP ribosylering faktorer (ARF’er), på trods af aminosyresekvensidentitet 40% til 60% mellem ARF’er og ARLs [2]. ARL2 er blevet impliceret som en regulator af mikrotubulusdynamik og folde [3], men dets funktion forbliver stort set ukendt. Vi har tidligere rapporteret, at reguleringen af ​​BART post-transkriptionel modifikation

via

intracellulære CD24 binding til G3BP i stress granulat bidrager til hæmning af invasion og metastase af pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC) celler [4]. N-terminal G3BP bidrager til post-transkriptionel regulering af BART [5]. Yderligere undersøgelser viste, at BART nedsætter invasivitet af PDAC celler ved at hæmme ARL2-medieret fald i aktiviteten af ​​Rho GTPase-protein RhoA [6]. Disse data antyder, at BART spiller en rolle i inhibering af PDAC invasionsevne.

ANX7 er et medlem af annexin-familien af ​​calcium-afhængige phospholipid-bindende proteiner og koder for et Ca

2 + -aktiverede GTPase.

ANX7 Hotel (+/-) knockout mus har Ca

2 + -afhængige endokrine sekretoriske defekter [7]. ANX7 phosphoryleres af PKC, som væsentligt forøger binding af ANX7 til kondenserede phospholipidvesikler i chromaffinceller [8]. Aktiveret PKC’er inducere sekretion af MMP-9, føre til aktivering af MMP-2, nedregulerer TIMP-1 og TIMP-2 sekretion, og øge MT1-MMP på celleoverfladen [9]. Således kan ANX7 være en af ​​de faktorer, der er forbundet med PKC-afhængige sekretion kaskade. Endvidere ANX7 er et nyligt beskrevet tumorsuppressorgen for prostatakræft, som vist ved tab af heterozygositet og reduceret ANX7 proteinekspression i en stor del af arkiverede metastatiske tumorer [10]. ANX7 udstiller mange biologiske og genetiske egenskaber af et tumorsuppressorgen og er også impliceret i carcinogenese gennem diskrete signalveje involverer andre tumorsuppressorer, DNA-reparation og apoptose-relaterede gener [10], [11]. Disse rapporter har antydet, at ANX7 spiller flere forskellige roller, der er involveret i exocytose, tumor undertrykkelse og carcinogenese.

PKC er en familie af serin /threonin-kinaser er involveret i transduktion af signaler, herunder Ras-signalet, for celledeling og differentiering [12], [13]. PKC-familien består af mindst 12 isoformer med forskellige væv ekspressionsmønstre, substratspecificiteter og subcellulære lokaliseringer, der er relateret til specialiserede cellefunktioner, herunder celle proliferation, differentiering og apoptose [14]. De ‘klassiske’ PKC’er (α, β1, β2, og y) binder phorbolestere og er Ca

2+ afhængige. De ‘nye’ PKC’er (δ, ε, η, og θ) ikke afhænger af Ca

2+, men binder phorbolestere. Den tredje underfamilie omfatter »atypiske« PKC’er (ξ, ι, λ, og μ), der ikke binder til enten Ca

2+ eller phorbolester [14], [15]. Konstitutivt aktiverede celleoverfladereceptorer, såsom EGF-receptoren eller PDGF-receptoren [16], eller Ras [17], årsag hyperaktivering af PKC samt mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) cascade. Overekspression af PKCδ inducerer en mere ondartet kræft i bugspytkirtlen-fænotype

in vivo

gennem modulation af celledeling og overlevelse [18]. En anden undersøgelse viste, at aktiveret PKC inducerer lamellipodia dannelse og efterfølgende forøget vandrende aktivitet af subkonjunktivale fibroblaster [19]. Således er det blevet foreslået, at PKC’er inducerer celleproliferation /overlevelse, invasion og metastase.

I denne undersøgelse ANX7 blev identificeret som en ny bindingspartner Bart, og Bart viste sig at være forbundet med ANX7-PKC kompleksdannelse i PDAC celler. Desuden de nuværende resultater viste, at vælte BART inducerer celle invasion ved at øge PKCa aktivitet gennem tabet af ANX7-PKCa kompleksdannelse. Således faldt aktiv PKCa

via

både BART og ANX7 bidrager til hæmning af PDAC invasiv.

Resultater

BART binder sig til ANX7 i PDAC celler

BART knockdown stigninger retroperitoneal invasion og PDAC celle metastase til leveren i en ortotopisk xenograftmodel, som beskrevet i en tidligere rapport [4]. For at undersøge den mekanisme, hvormed BART undertrykker invasionsevne og metastase, immunpræcipitering (IP) eksperimenter blev udført i den humane PDAC cellelinie S2-013 anvendelse af et specifikt antistof til BART, at detektere komplekser af BART med andre proteiner. S2-013 er et klonet sublinie af en PDAC cellelinie (SUIT-2) afledt af en levermetastase [20], og blev opnået fra Dr. T. Iwamura (Miyazaki Medical College, Miyazaki, Japan). Sølvfarvet immunopræcipiterede fraktioner separeret på SDS-PAGE geler afslørede en 50-kDa bånd, der ikke var set i de isotypekontrol immunpræcipitater (pil i fig. 1A). Bandet blev skåret ud og analyseret af Q-TOF-MS efter i-gel trypsin fordøjelse, og identificeret som ANX7. Peptidsekvensen dækning var 15% (fig. 1B). Denne specifikke binding af ANX7 til BART blev påvist ved co-IP fra S2-013 celler (Fig. 1C) og subcellulære colokalisering blev analyseret ved immunfarvning af S2-013 celler (fig. 1D). BART og ANX7 coimmunoprecipitated og blev colocalized i cytoplasmaet. Af note er, at BART og ANX7 akkumuleret i lamellipodial-lignende fremspring, der er afgørende for celle migration (pile i fig. 1E).

A. Immunopræcipitater fra S2-013 celler ved hjælp af normal kanin IgG (kontrol) og anti-BART antistof blev undersøgt af sølvplet analyse. Q-TOF-MS-analyse undersøgt en fremtrædende band i BART immunpræcipitater (pil). B. Den procentvise dækning for ANX7 er repræsenteret ved de identificerede peptider i det totale proteinsekvens (accession nummer NM_004034). C. immunfældet endogene BART eller ANX7 fra S2-013 blev undersøgt ved Western blotting hjælp anti-BART og anti-ANX7 antistoffer. Normalt kanin eller muse-IgG blev anvendt som en isotypekontrol til BART og ANX7 hhv. D. immuncytokemisk farvning af S2-013 celler under anvendelse af anti-BART (grøn) og anti-ANX7 (rød) antistoffer. Blå, DAPI-farvning. Bar, 10 um. E. Pile angiver, BART (grøn) og ANX7 (rød) colocalize ved lamellipodial-lignende fremspring S2-013 celler. Blå, DAPI-farvning. Bar, 10 um.

ANX7 hæmmer PDAC celleinvasion

Tidligere celle kloner blev genereret hvor BART var stabilt undertrykt af vektor-baserede specifikke kort hårnål lille interfererende RNA (siRNA) i S2-013 celler, som tidligere udtrykte høje niveauer af BART [4]. For at bestemme funktionen af ​​BART-ANX7 komplekser blev en sårhelende immunfarvning assay anvendes til at observere lokaliseringen af ​​BART og ANX7 i polariserede migrerende celler (Fig. 2A). Både BART og ANX7 blev rekrutteret til forkanterne under sårheling af kontrol S2-013 celler (pile i fig. 2A). Udtømning af BART hæmmede ANX7 ophobning på forkanterne (lavere paneler i fig. 2A). Kombineret med resultatet af fig. 1E viser disse resultater, at BART og ANX7 interdependently lokalisere på forkanterne og i de lamellipodial-lignende fremspring forbundet med cellemigrering.

A. Negativ scrambled kontrol (Scr-1) og BART RNAi (siBART-1) S2-013 celler i sammenflydende kulturer blev såret. Efter 4 timer blev cellerne immunfarvet under anvendelse af anti-BART (grøn) og anti-ANX7 (rød) antistoffer. Blå, DAPI-farvning. Pile, colocalized BART og ANX7 på forkant af kontrol celler. Barer, 10 um. B. siRNA oligonukleotider målrettet ANX7 (siANX7) og negative scrambled kontrol blev forbigående transficeret ind S2-013 og PANC-1-celler. Western blotting valideret ANX7 knockdown i begge cellelinier. C. Transwell motilitet assay af celler behandlet som i (B). Migrerede celler i fire felter per gruppe blev talt. Data er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

Kolonner

, middelværdi;

barer

, SD. *

s

0,005 sammenlignet med kontrol celler. D. Kvantificering af de to-kammer invasion assay af celler behandlet som i (B). Invaderede celler i fire felter per gruppe blev talt. Data er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

Kolonner

, middelværdi;

barer

, SD. *

s

. 0,001 sammenlignet med kontrol celler

In vitro

analyser blev anvendt til at undersøge effekten af ​​ANX7 på celle motilitet og invasion. Som vist ved Western blot analyse blev ANX7 ekspression markant reduceret i S2-013 og en PDAC cellelinie, PANC-1, 72 timer efter transfektion med ANX7-targeting siRNA oligonukleotider, i modsætning til celler transficeret med scrambled siRNA-oligonukleotider (fig . 2B). Undertrykkelse af ANX7 forbedret motilitet i Transwell motilitet assays af S2-013 og PANC-1 sammenlignet med kontrolceller (fig. 2C). I to-kammer invasion assays, ANX7 RNAi-celler var signifikant mere invasiv end kontrollen S2-013 og PANC-1-celler (fig. 2D). Disse resultater tyder på en vigtig rolle for binding af BART og ANX7 i hæmning af celle migration.

Binding af ANX7 og phosphoryleret PKC er forbundet med at hæmme invasiv af PDAC celler

Co-IP af ANX7 og PKC-komplekset blev udført ved anvendelse af anti-ANX7 eller anti-PKC-antistof (10800) omsætning med PKCa, p1, p2, A, e og η isoformer i S2-013 celler. Immunoblotting af immunpræcipitaterne afslørede, at ANX7 co-immunpræcipiteret med PKC (fig. 3A). PKC udtryk var ikke særlig høj, men der var betydelige beløb i ANX7-immunpræcipiteret komplekser uden PKC antidiabetica. Virkningerne af vælte ANX7 om regulering PKC-aktivitet blev undersøgt ved anvendelse af Western blotting under anvendelse af et anti-phospho-PKC-antistof (9379), som detekterer de klassiske PKC’er (α, β1, β2 og γ) og hidtil ukendte PKC’er (δ, ε, η og θ) når phosphoryleret ved en rest homolog med Thr514 af PKCy (fig. 3B). ANX7 knockdown induceret phosphorylering af PKC i S2-013 celler, hvilket indikerer, at ANX7 spiller en rolle i faldende phosphoryleret PKC. For at undersøge den subcellulære colokalisering af ANX7 og phosphoryleret PKC blev S2-013 celler immunfarvet. ANX7 og phosphoryleret PKC blev colocalized i lamellipodial-lignende fremspring (pile i fig. 3C). Interessant ANX7 og phosphoryleret PKC blev rekrutteret og colocalized til forkanterne under sårheling af S2-013 celler (pile i fig. 3D), hvilket indikerer, at phosphoryleret PKC er associeret med anti-invasiv funktion af ANX7. Da ANX7 kunne fungere i faldende PKC-aktivitet (fig. 3B), ANX7-afhængig inhibering af celleinvasion sandsynligvis være forbundet med nedsat aktivitet af de specifikke klassiske eller nye PKC-isoformer. Således blev yderligere eksperimenter til analyse af BART-ANX7-associeret hæmning af celle invasion fokus på de klassiske og nye PKC isoformer, som anti-phospho-PKC-antistof (9379) reagerede.

A. Immunopræcipitation af endogent ANX7 eller PKC fra S2-013 celler. Immunpræcipitater blev undersøgt ved Western blotting under anvendelse af anti-ANX7 og anti-PKC-antistoffer. Normal mus eller kanin-IgG blev anvendt som isotypekontrol til ANX7 eller PKC, henholdsvis. B. Western blot med anti-PKC og anti-phospho-PKC antistoffer viser S2-013 celler transient transficeret med siRNA for ANX7 sammenlignet med celler transficeret med scrambled kontrol. C. immuncytokemisk farvning i S2-013 celler, som bestemt med anti-ANX7 (grøn) og anti-phospho-PKC (rød) antistoffer. Blå, DAPI-farvning. Pile, colocalized ANX7 og phosphoryleret PKC på lamellipodial-lignende fremspring. Bar, 10 um. D. Sammenflydende S2-013 celler blev såret. Efter 4 timer blev cellerne immunfarvet under anvendelse af anti-ANX7 (grøn) og anti-phospho-PKC (rød) antistoffer. Blå, DAPI-farvning. Pile, colocalized ANX7 og phosphoryleret PKC på forkant. Bar, 10 um.

Phosphoryleret PKC inducerer celle invasion af PDAC celler

En PKC stimulator, phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA) er et potent tumor promotor [21] som inducerer migration af subkonjunktivale fibroblaster [19] og glioblastomaceller [9]. PMA interagerer med og aktiverer både klassiske og nye PKC isoformer [21]. Derfor blev effekten af ​​PMA på celle invasion af S2-013 og PANC-1 undersøgt. Immunoblotting under anvendelse af anti-phospho-PKC-antistof (9379) viste, at behandling med PMA øgede den aktive PKC’er (fig. 4A). PMA stimuleret betydeligt celle invasion af S2-013 og PANC-1 i

in vitro

invasion assays (fig. 4B), hvilket indikerer, at PMA-følsomme PKC isoformer bidrager til invasiv af PDAC celler. For at bekræfte, at PMA-induceret invasion var afhængig af aktive PKC’er blev celler indledningsvis behandlet med en PKC-inhibitor (calphostin C, en inhibitor af både klassiske og nye PKC’er) og derefter behandlet med PMA. Indledende behandling med PKC-inhibitoren forhindrede PMA-inducerede stigning i PKC-aktivitet (fig. 4A) og inhiberede PMA-medieret celle invasion af S2-013 og PANC-1 (fig. 4B). Disse resultater indikerer, at specifikke isoformer af klassiske og hidtil ukendte PKC’er kunne inducere PDAC celleinvasion.

A. S2-013 og Panc-1-celler forbehandlet med eller uden calphostin C blev behandlet med PMA, og PKC-aktivitet blev bedømt ved Western blotting med et anti-phospho-PKC-antistof. B. S2-013 og PANC-1 celler behandlet som i (A) blev udpladet på Matrigel invasion kamre. Invaderede celler i fire felter per gruppe blev talt. Data er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

Kolonner

, middelværdi;

barer

, SD. *

s

0,001; **

s

0,003 sammenlignet med ikke-behandlede kontrol celler. C. S2-013 celler blev behandlet med eller uden PMA, og immuncytokemisk farvning blev udført under anvendelse af anti-E-cadherin og anti-p-catenin antistoffer (grøn). Blå, DAPI farvning; barer, kan 10 um.

Cell-celleadhæsion også påvirke motilitet [22]. Ved dannelsen af ​​celle-celle kontakter, celler reducere deres migration sats og celle-overflade fremspring aktivitet, og sænke deres mikrotubuli og actin-endeløse dynamik [23]. For at bestemme virkningen af ​​de klassiske og hidtil ukendte PKC’er på celle-celle-kontakt, blev S2-013 celler inkuberet med PMA og immunofluorescens blev udført ved anvendelse af anti-E-cadherin og anti-β-catenin antistoffer (fig. 4C). PMA reduceret betydeligt junction proteiner ved områder af celle-celle-kontakt, hvilket indikerer nedsat perifer lokalisering af junction-proteiner, hvilket resulterer i compliance junctions med nedsat stabilitet. Disse resultater antyder, at PMA-følsomme PKC’er spiller en rolle i faldende stabilitet celle-celle-kontakter og til gengæld inducere celleinvasion.

BART understøtter bindingen af ​​ANX7 til aktiv PKC og funktioner i faldende aktiv PKC

for at bestemme virkningen af ​​de BART-ANX7 komplekser om regulering aktivitet af PKC, blev virkningerne af BART knockdown på ANX7 affinitet for konstitutivt aktiverede PKC’er ved behandling med PMA undersøgt (fig. 5A). PMA stimulation forårsaget betydelige stigninger i mængden af ​​ANX7-PKC komplekser i kontrol- celler, mens der ikke var nogen forskel i BART RNAi S2-013 celler. Endvidere om binding kunne inhiberes af PKC-inhibitorer forud for stimulering af kontrolceller med PMA blev vurderet. Calphostin C og chelerythrinchlorid (en hæmmer af PKCa, β, γ og δ) markant nedsat ANX7-PKC interaktion i PMA-stimulerede kontrolceller (fig. 5A). Desuden BART immunpræcipiteret med forøgede mængder af ANX7 når S2-013 celler blev behandlet med PMA, og præinkubering med calphostin C inhiberede stigningen i binding (fig. 5B). Immuncytokemisk analyse blev udført for at undersøge den intracellulære lokalisering af PMA-induceret ANX7-PKC komplekser i kontrol og BART RNAi S2-013 celler (Fig. 5C). ANX7 colocalized med PMA-stimulerede PKC’er i kontrol-celler (pile i figur 5C.); dog BART knockdown forhindret binding af ANX7 og PMA-stimulerede PKC’er (pilespidser i fig. 5C). Desuden IP forsøg med anti-phosphoryleret PKC-antistof (9379) bekræftede, at vælte BART hæmmede binding af ANX7 og phosphoryleret PKC (fig. 5D, E).

A. Immunopræcipitation af PKC fra kontrol og Bart RNAi S2-013 celler stimuleret af PMA med eller uden forbehandling af calphostin C eller chelerythrinchlorid blev undersøgt ved Western blotting under anvendelse af anti-ANX7 og anti-PKC-antistoffer. *, Co-immunpræcipiteret ANX7 med PKC i BART RNAi S2-013 celler. B. Immunpræcipitation af BART fra S2-013 celler behandlet som i (A) blev undersøgt ved Western blotting hjælp anti-ANX7 og anti-BART-antistoffer. C. immuncytokemisk farvning af kontrol (øvre paneler) og Bart RNAi (lavere paneler) S2-013 celler stimuleret med PMA anvendelse af anti-PKC (grøn) og anti-ANX7 (rød) antistoffer. Blå, DAPI-farvning. Pile, ANX7 colocalized med PMA-følsomme PKC’er i kontrol- celler; pilespidser, PMA-følsomme PKC’er ikke colocalized med ANX7 i BART RNAi celler. Barer, 10 um. D. Immunpræcipitation af phosphoryleret PKC fra kontrol og BART RNAi S2-013 celler blev undersøgt ved Western blotting hjælp anti-ANX7 og anti-phospho-PKC antistoffer. E. Densitometrisk analyse af resultaterne i figur 5D. Niveauet af ANX7 i præcipitaterne blev vurderet efter normalisering ANX7 signaler til phospho-PKC signaler af cellelysater. F. Western blot med anti-BART og anti-phospho-PKC-antistoffer viser to S2-013 kloner transficeret med siRNA for BART (siBART-1 og 2) i sammenligning med mock (Neo-1) og krypteret (Scr-1) kontrol kloner.

BART RNAi S2-013 celler havde forhøjede aktive PKC niveauer og uændrede steady state niveauer af PKC’er (fig. 5F). Dette resultat indikerer, BART kan være forbundet med nedsat mængde aktiv PKC. Vi hypotesen, at BART regulerer samspillet mellem ANX7 og aktive former af mål PKC’er som et stillads molekyle og /eller en last protein ANX7, tillader ANX7 at mindske målet PKC aktivitet, og til gengæld, hæmmer celle invasion.

PKC aktivitet er ikke direkte reguleret af ANX7

for at undersøge betydningen af ​​PKC i reguleringen fosforylering af ANX7, som tidligere rapporteret i chromaffinceller [8], blev S2-013 og PANC-1 celler metabolisk mærket med [

32P] -orthophosphoric syre, og derefter stimuleret med PMA. Det radioaktivt mærkede-ANX7 blev immunfældet med anti-ANX7 monoklonalt antistof og blev analyseret ved fosfor billeddannelse (fig. 6A). Hvis ANX7 er et substrat af specifikke PKC’er, bør niveauet for ANX7 fosforylering resultere i væsentligt forøgede ændringer i respons på PMA. Men PMA-stimulering ikke øge niveauerne af ANX7 phosphorylering i begge cellelinie. Dernæst

in vitro

phosphoryleringsassays assays blev anvendt til at bestemme, om PKC-aktivitet blev reguleret direkte af ANX7 (fig. 6B). Oprenset rottehjerne, med en renhed på 95% og indeholdende klassiske og nye PKC-isoformer, blev inkuberet med rekombinant ANX7 protein med eller uden rekombinant BART protein. ANX7 ændrede ikke aktiviteten af ​​PKC’er og tilføje BART protein blev ikke forbundet med at regulere PKC aktivitet. Disse resultater antyder, ANX7 ikke er et substrat for PKC, og at ANX7 ændrer ikke phosphoryleringsniveauerne af target PKC’er direkte.

A. S2-013 og PANC-1 celler blev prelabeled med [

32p] -orthophosphoric syre og stimuleret eller ikke med PMA. ANX7 blev immunpræcipiteret, adskilt ved SDS-PAGE og analyseret ved autoradiografi. Et immunoblot blev udført på cellelysatet som en loading kontrol. B.

In vitro

phosphoryleringsbegivenheder analyser for at undersøge effekten af ​​BART og ANX7 på PKC-phosphorylering. Oprenset rottehjerne blev inkuberet med rekombinant ANX7 med eller uden rekombinant BART. Reaktionsprodukterne blev analyseret ved et ELISA-assay. ABS på

Y

aksen betyder absorbans ved 492 nm som reference målt med en mikropladelæser.

PKCa er forbundet med BART-ANX7 komplekser

For at identificere specifikke isoformer af PKC, som binder til ANX7 i dette system blev et præcist udtryk profil af klassiske og hidtil ukendte PKC’er genereret ved Western blotting under anvendelse af individuelle anti-phospho-PKC-antistoffer i BART RNAi celler afledt fra S2-013 (fig. 7A). Da phosphoryleringsniveauerne af mål-PKC’er blev forhøjet i BART RNAi celler (Fig. 5F), opreguleres phospho-PKC’er i BART RNAi celler blev selekteret til yderligere analyse. Blandt disse blev PKCa signifikant aktiveret af BART knockdown i S2-013. Desuden PKCa var rigeligt phosphoryleret i ANX7 RNAi celler af S2-013 og PANC-1 (fig. 7B). Dernæst binding af ANX7 med phosphoryleret PKCa blev vist ved immunopræcipitation og western blotting-analyse i S2-013 celler (Fig. 8A). Phospho-PKCη ikke immunpræcipiteret med ANX7. For at undersøge den subcellulære colokalisering af phosphoryleret PKCa blev S2-013 celler immunfarvet. Phosphoryleret PKCa blev lokaliseret i lamellipodial-lignende fremspring (pile i fig. 8B). Derudover ANX7 og fosforylerede PKCa blev rekrutteret til forkanterne under sårheling af kontrol S2-013 celler (øvre paneler i fig. 8C). Udtømning af BART inducerede ikke ophobning af ANX7 på forkanterne og efterfølgende colokalisering med phosphoryleret PKCa (lavere paneler i fig. 8C). Disse resultater indikerer, at PKCa interdependently er forbundet med BART og ANX7 modulering PDAC cellemigrering.

A. Western blot med antistoffer mod de klassiske og nye PKC isoformer viser to S2-013 kloner transficeret med siRNA til BART i forhold til mock og krypterede kontrol kloner. B. siRNA oligonukleotider målrettet ANX7 og negativ scrambled kontrol blev forbigående transficeret ind S2-013 og PANC-1-celler. Western blot med antistoffer mod de klassiske og nye PKC isoformer blev udført.

A. Immunopræcipitering af ANX7 (venstre paneler) eller phospho-PKCa (højre paneler) fra S2-013 celler blev undersøgt ved Western blotting hjælp antistoffer mod ANX7, phospho-PKCa og phospho-PKCη. B. immuncytokemisk farvning i S2-013 celler, som bestemt med anti-phospho-PKC-antistof (grøn). Blå, DAPI-farvning. Pile, phosphoryleret PKC på lamellipodial-lignende fremspring. Bar, 10 um. C. Konfluente kulturer af kontrol og BART RNAi S2-013 celler blev såret. Efter 4 timer blev cellerne immunfarvet under anvendelse af anti-ANX7 (grøn) og anti-phospho-PKCa (rød) antistoffer. Blå, DAPI-farvning. Barer, 10 um.

Specifikke inhibitorer af PKCa hæmmer øget celle migration ved knockdown af BART og ANX7

For at undersøge, om PKCa signalering er involveret i øget migration ved BART eller ANX7 knockdown i S2-013, en PKCa /β1-inhibitor Ro-32-0432 og en specifik PKCa inhibitor safingol blev anvendt i

in vitro

invasion assays. Som vist i fig. 9A og 9B, blev phosphoryleret PKCa specifikt faldt med Ro-32-0432 og safingol behandling, men udtryk for phospho-PKCη blev ikke ændret. Den største migration af S2-013 celler skete efter vælte BART eller ANX7; dog var den øgede migration hæmmes af præinkubering med Ro-32-0432 (fig. 9C) og safingol (fig. 9D). Øget invasionsevne af BART eller ANX7 knockdown blev ikke forhindret en inkubation med en myristoyleret pseudosubstrate PKCη inhibitor (figur 9E.) Og en PKCδ inhibitor (rottlerin; data ikke vist). Disse resultater antyder, at aktivering af PKCa er påkrævet for PDAC cellemigrering induceret af Bart eller ANX7 knockdown.

A. BART RNAi S2-013 celler og S2-013 celler forbigående transficeret med ANX7-siRNA blev forbehandlet med eller uden Ro-32-0432. Aktiviteten af ​​PKCa og η blev bedømt ved Western blotting. B. Celler, der er vist i (A) blev forbehandlet med eller uden safingol. Aktiviteten af ​​PKCa og PKCη blev bedømt ved Western blotting. C. Virkningen af ​​Ro-32-0432 om celleinvasion blev undersøgt under anvendelse af transwell invasion assay. Migrerede celler i fire felter per gruppe blev talt. Data er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

Kolonner

, middelværdi;

barer

, SD. *

s

0,001 sammenlignet med ikke-behandlede celler. D. Virkningen af ​​safingol på celleinvasion blev undersøgt under anvendelse af transwell invasion assay. Data er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

Kolonner

, middelværdi;

barer

, SD. *

s

0,001; **

s

0,003 sammenlignet med ikke-behandlede celler. E. Virkningen af ​​rottlerin og pseudosubstrate PKCη inhibitor på celleinvasion blev undersøgt under anvendelse af transwell invasion assay. Data er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

Kolonner

, middelværdi;

barer

, SD.

Diskussion

PDAC er en af ​​de dødeligste kræftformer på grund af sin evne til udstrakt invadere omkringliggende væv og metastaserer på et tidligt tidspunkt [24 ]. Omfattende lokal infiltration og metastase er de vigtigste dødsårsager i PDAC [25]. I lyset af den rolle, BART hæmme PDAC celle invasion, blev denne undersøgelse designet til at identificere BART bindende proteiner associeret med PDAC celle invasiv. De vigtigste træk ved denne rapport er som følger:.

BART og ANX7 kan fungere sammen i komplekse til at hæmme celle migration

BART og ANX7 kan hæmme celle invasion ved at nedsætte aktiv PKC på forkanter.

Phosphoryleret PKCa er ansvarlig for den øgede invasionsevne af PDAC celler ses med BART eller ANX7 knockdown. PKCa er interdependently forbundet med BART og ANX7 i modulering invasivitet af PDAC celler.

Hyppig tab af ANX7 ekspression blev observeret i prostatacancer, især i metastase og lokalt recidiv af hormon refraktær sygdom [7]. Ud fra følgende betragtninger null

ANX7

– /- musene dør under embryogenese, ANX7 heterozygote mus (

ANX7

+/-) udvikle, moden, og alder normalt, og mere interessant, har en kræft-tilbøjelige fænotype [10]. En bred vifte af spontane tumorer er blevet påvist i

ANX7

+/- mus, herunder i lever, prostata, endometrium, spytkirtel, og thymus [11]. Hos mus, vises haploinsufficiency af ANX7 ekspression til drev progression til kræft på grund af genomisk ustabilitet via diskret signalvej involverer andre tumorsuppressorgener, DNA-reparation gener og apoptose-relaterede gener. Vore data antyder, at BART og ANX7 spille en rolle i faldende phosphoryleringsniveauet af PKCa i PDAC celler.

In vitro

eksperimenter ikke godtgjort, at ANX7 direkte nedsat aktivitet af PKC (Fig 6B.); dog fig. 6A viser endeligt, at ANX7 ikke var et substrat for PKC i PDAC celler. Selvom den mekanisme, hvormed ANX7 regulerer PKC-aktivitet forbliver ukendt, er det bemærkelsesværdigt, at BART og ANX7 kunne fungere sammen for at nedsætte aktiviteten af ​​PKCa isoform og til gengæld undertrykke invasionsevne af PDAC celler. Denne undersøgelse aktiveret evaluering af et cellulært signalvej reguleret af

ANX7

tumorsuppressorgen i PDAC. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at afgøre, hvilke molekyler direkte undertrykke PKCa, og identificere præcise substrater af PKCa, for at forstå de mekanismer, der er involveret i BART-ANX7-medieret hæmning af celle invasion.

rolle PKCa i PDAC cellemigrering er ikke blevet grundigt undersøgt. Flere linjer af beviser tyder på, at PKCa spiller kritiske roller i celledeling /migrering /invasion, herunder menneske dårligt differentieret hepatisk kræft [26], endometriecancer [27] og gastrisk kræft [28]. Celle signalveje, der omfatter PKC familien initieres ved binding af en ligand, såsom en vækstfaktor, til dens respektive celleoverfladereceptor, hvilket udløser den fordeling af phospholipider ved phospholipaser C og D og produktion af diacylglycerol (DAG). DAG binder til og aktiverer fleste PKC-isoformer, som derefter translokerer til specifikke subcellulære afsnit, der varierer afhængigt af PKC isoform og celletype. I sidste ende MAPK’er, herunder det ekstracellulære-signal-reguleret protein kinase (ERK), c-jun N-terminal kinase (JNK), og p38MAPK, spiller en afgørende rolle i cellemigrering medieret af PMA-aktiverede PKC’er [19], [29 ]. At BART og ANX7 ophæver fosforylering af ERK i PDAC celler er blevet påvist (data ikke vist), hvilket antyder, at PKCa kan være forbundet med at modulere ERK aktivitet muligvis associeret med BART-ANX7-relateret hæmning af invasiv. Endvidere er det muligt, at PKCa-induceret exocytose modulerer cellemigrering. Således er de fremtidige studier af PKCa berettiget til yderligere at karakterisere sin exocitic funktion og belyse dens potentielle bidrag til celle migration.

Sammenfattende resultaterne præsenteres i denne undersøgelse er positive over for afgørende roller i BART i den koordinerede regulering af PKCa aktivitet

via

binding med ANX7.