PLoS ONE: Ingen Association of xenotropisk Murin Leukæmi Virus-beslægtede vira med prostatakræft

Abstrakt

Baggrund

Foreningen af ​​xenotropisk murine leukæmi virus-relaterede virus (XMRV) med prostatakræft fortsætter med at modtage øget opmærksomhed som undersøgelser rapporterer afvigende XMRV prævalens spænder fra nul op til 23%. Det er uklart, om forskelle i den diagnostiske test, sygdommens sværhedsgrad, geografi eller andre faktorer tegner sig for de uoverensstemmende resultater. Vi rapporterer her forekomsten af ​​XMRV i en population med veldefinerede prostatakræft og RNase L polymorfi. Vi brugte bredt reaktive PCR og Western blot (WB) assays til at påvise infektion med XMRV og relaterede murine leukæmi virus (MLV).

Metodologi /vigtigste resultater

Vi studerede prøver fra 162 amerikanske patienter diagnosticeret med prostatakræft med en mellemliggende til avanceret stadie (Gleason Score af 5-10; moderat (46%) dårligt differentierede tumorer (54%)). Prostatavæv DNA blev testet ved PCR-assays, der registrerer XMRV og MLV-varianter. At udelukke kontaminering med muse-DNA, vi også designet og anvendt et muse-specifik DNA PCR-test. Detaljeret fylogenetisk analyse blev anvendt til at udlede evolutionære relationer. RNase L typning viste, at 9,3% var homozygote (QQ) til R462Q RNase L mutation, mens 45,6% og 45,1% var homozygote eller heterozygote hhv. Serologisk testning blev udført af en WB test. Tre af 162 (1,9%) prostata væv DNA var PCR-positive for XMRV og havde målbart mus DNA. Ingen var homozygot for QQ mutation. Plasma fra alle tre personer var negativ for viral RNA ved RT-PCR. Alle 162 patienter var WB negative. Fylogenetisk analyse udledes en klar XMRV.

Konklusioner og deres betydning

Vi fandt en meget lav forekomst af XMRV i patienter med prostatacancer. Infektion bekræftedes ved fylogenetisk analyse og fravær af kontaminerende muse-DNA. Fundet af målbart antistoffer og viræmi i alle tre patienter kan afspejle latent infektion. Vores resultater støtter ikke en sammenslutning af XMRV eller MLV varianter med prostatakræft

Henvisning:. Switzer WM, Jia H, Zheng H, Tang S, Heneine W (2011) Nr Association of xenotropisk Murin Leukæmi Virus-relaterede Vira med prostatakræft. PLoS ONE 6 (5): e19065. doi: 10,1371 /journal.pone.0019065

Redaktør: Paul Dent, Virginia Commonwealth University, USA

Modtaget: Februar 3, 2011; Accepteret: 15. marts 2011; Udgivet: 4. maj 2011

Dette er en åben-adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Finansiering:. Finansiering af undersøgelsen blev leveret af Centers for Disease Control og Forebyggelse pr årlige bevillinger i De Forenede Staters regering. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft er en af ​​de mest hyppige, langsomt voksende, noncutaneous maligniteter af mænd i udviklingslandene [1]. For eksempel anslås det, at mere end 192.000 mænd i USA, for det meste af afrikansk-amerikansk afstamning, vil blive diagnosticeret med prostatakræft i år [2], [3]. Selvom den naturlige historie af prostatakræft er i øjeblikket ukendt, har flere ætiologier været en hypotese, herunder genetiske defekter [4], [5], [6]. I 2006 ved hjælp microarray og RT-PCR-analyse xenotropisk murin leukæmivirus (MLV) relateret virus (XMRV) blev først identificeret i omkring 40% af familiære prostatacancerpatienter indeholdende R462Q mutation i RNase L-genet, en komponent af den antivirale medfødte immunitet [7]. MLV’er er endogene gammaretroviruses der har integreret i musegenomet og kan forårsage kræft, neurologisk sygdom, og immundefektlidelser i mus og er klassificeret i tre grupper baseret på deres værtstropismen [8]. Xenotropisk MLV (XMLV) replikere kun i ikke-museceller. Derimod ecotropisk MLV (EMLV) replikerer kun i mus, mens polytrop MLV (pMLV) har en bredere tropisme og kan replikere i mus og ikke-mus værter [8]. XMRV aktier omkring 93% og 89% nukleotididentitet med XMLV og pMLV tværs genomet [7]. Identificering af eventuelt viral årsag til prostatakræft er meget signifikant, fordi det kunne lette behandling og forebyggelse af denne invaliderende sygdom.

Yderligere evidens for XMRV infektion af personer med prostatacancer er blevet rapporteret i en amerikansk undersøgelse, der viser en højere forekomsten af ​​XMRV DNA-detektion ved PCR (6%) og virale proteiner ved immunhistokemi (IHC) (23%) i prostatavæv fra 334 prostatacancerpatienter sammenlignet med 101 benigne kontroller (1,9% ved PCR og 3,9% ved IHC) [9] . Denne undersøgelse rapporteret også finde XMRV oftere hos patienter med en højere prostata tumor kvalitet tyder en årsagssammenhæng mellem virus og sygdom. En lignende tendens blev rapporteret i en anden undersøgelse, som rapporterede en 22% XMRV prævalens i patienter med prostatacancer fra Texas, men fundet virus i både tumor og ikke-tumorvæv [9], [10]. XMRV neutraliserende antistoffer blev identificeret for nylig i 11 af 40 (27,5%) amerikanske prostatakræft patienter og XMRV sekvenser blev bekræftet i fem af disse 11 personer ved hjælp af indlejrede DNA PCR og fluorescens in situ hybridisering (FISH) [11].

i modsætning hertil studier i Europa og to fra USA rapporterede lidt eller ingen XMRV infektion [12], [13], [14], [15], [16]. En undersøgelse af tyske patienter prostatakræft og en i Holland fandt en meget lavere XMRV prævalens (1/87, 1,2% og 3/74 = 4%, henholdsvis) kun bruger RT-PCR og XMRV-specifikke primere [12]. En anden større undersøgelse i Tyskland under anvendelse af en kombination af DNA og RNA PCR fandt ingen tegn på XMRV infektion i 589 patienter [14]. Desuden sera fra yderligere 146 prostatacancerpatienter var alle negative ved at teste med en ELISA inkorporerer rekombinant XMRV kuvert (Env) og gag proteiner og ved indirekte immunofluorescens assays udtrykker XMRV [14]. XMRV blev heller ikke fundet i DNA fra væv fra 161 og 200 patienter med prostatacancer fra to amerikanske populationer henholdsvis [13], [15]. Undersøgelsen fra Aloia

et al.

Også ikke opdage XMRV proteiner i væv fra 596 prostata adenokarcinomer og 452 godartede prostata vævsprøver hjælp IHC [13].

Årsagerne til de inkongruente XMRV resultater er ikke kendt, men kan være relateret til tekniske forskelle i XMRV prøvning eller til faktorer relateret til de patientpopulationer, herunder sygdomsstadie, genetiske faktorer, eller geografisk klyngedannelse. Tilsvarende uoverensstemmende resultater er også rapporteret for nylig for XMRV hos personer med kronisk træthedssyndrom (CFS) [17], [18], [19], [20], [21], [22], [23], herunder en undersøgelse af Lo

et. al

rapportering pMLV-lignende sekvenser blandt amerikanske patienter med CFS [24]. Størstedelen af ​​undersøgelserne prostatacancer anvendes PCR med XMRV-specifikke primere, som ikke kan være meget følsomme for andre MLV-lignende varianter [7], [9], [10], [11], [12], [15], [16]. Desuden har de fleste undersøgelser ikke udføre serologisk test for antistoffer, som er kendetegnende for retrovirusinfektioner og kan dermed give yderligere tegn på infektion, der ikke er vævsspecifikke.

Vi rapporterer her XMRV afprøvning af en vel- karakteriseret kohorte af 162 patienter med prostatacancer fra USA ved hjælp af en kombination af serologiske og PCR-assays kan spore XMRV og pMLV. Vi målte også fordelingen af ​​RNase L QQ mutation til at evaluere associering XMRV med denne mutant allel [7]. Vi har også anvendt en følsom PCR test til påvisning kontaminering med murine DNA og udelukke falsk positive PCR-resultater. Vores resultater viser, at XMRV er sjælden i denne patientpopulation og understøtter ikke en sammenslutning af denne virus med prostatakræft.

Resultater

Sjældne XMRV sekvenser i tumorvæv fra patienter med prostatacancer

ß-actin sekvenser blev påvist ved PCR i DNA ekstrakter fra alle prostatavæv bekræfter deres integritet til PCR-analyse. DNA fra kun to (5956 og 6203) af 162 patienter (1,23%) testet positive for XMRV sekvenser i den indledende screening (Fig. 1, tabel 1). Af de 77 DNA enheder, som supplerende afprøves in triplo af

pol

PCR assay blev kun en patient (5935) (1,3%) fundet positive. Denne prøve var positiv i kun én af tre gentagelser. Således er den samlede PCR prævalensen var 3/162 eller 1,85%. Patient 5956 var positiv for

gag

pol

sekvenser i 3/5 og 4/6 gentagne prøver, henholdsvis og

env

sekvenser blev også påvist i 1/3 gentagne prøver (tabel 2). Prøve 5956 var også positiv i alle tre gentagne

pol

PCR-test. Kun XMRV

pol

og

env

sekvenser blev påvist i patient 6203 prostata væv DNA i 1/4 og 1/1 gentagne prøver, hhv. Yderligere test af DNA ekstraheret fra en anden prostata væv afsnit af 6203 var gentagne gange negativ, sandsynligvis afspejler en ulige fordeling af lav kopi XMRV i dette væv. DNA fra alle tre patienter gentagne gange testet negative for murine mtDNA dokumentere fravær af kontaminerende muse-DNA’er. For at teste for viræmi vi analyserede RNA ekstrakter fra plasma prøver fra alle tre patienter. Alle prøver havde målbart sekvenser fra de QRT-PCR og nRT-PCR-test.

Repræsentant indlejrede

pol

PCR resultater ved hjælp af prostata tumor-DNA. Banerne 1-24, prostata cancer patienter, herunder patienter 5956 (bane 8) og 6203 (bane 19); bane 25, negativ humane PBMC DNA-kontrol; banerne 26 og 27, kun vand styrer for primære og indlejrede PCR-test, henholdsvis; banerne 28 og 29, analysesensitivitet kontrol, der består af 10 og 10

3 eksemplarer af XMRV VP62 plasmid-DNA fortyndet i en baggrund af en ug humant PBMC DNA henholdsvis. Vejviser

Identifikation af XMRV mangfoldighed i prostata cancer patienter

Sekvensanalyse viste, at patienter 5935, 5956 og 6203 er smittet med variant XMRV stammer. Den 168-bp

pol

sekvenser fra alle tre patienter viste 90,5-100% nukleotididentitet til hinanden, 94-100% til XMRV, 91,7-98,8% til XMLV, 94-100% til pMLV, og 91 -100% til ecotrop MLV (EMLV) i denne korte region. 164-bp

env

sekvenser fra personer 5956 og 6203 var identiske med hinanden og delte den højeste nukleotididentitet (94,9-100%) til XMRV og andre xenotrope MLV-stammer, henholdsvis [25].

env

sekvenser fra både personer var meget divergerende fra EMLVs deler kun omkring 46% nukleotid identitet. 413-bp

gag

sekvenser blev kun forstærket fra prostata væv DNA person 5956 og havde omkring 98% nukleotid identitet til XMRV men var identisk med en xenotropisk Merv fundet på mus kromosom 8 (GenBank # AC127575).

fylogenetisk analyse af

env

sekvenser udledt tre forskellige klynger med stærk bootstrap støtte baseret på viral tropisme som forventet, eftersom denne region indbefatter en del af det virale overflademembranen involveret i cellulær tropisme (fig . 2a).

env

sekvenser fra både patienter grupperet med XMLV sekvenser men var forskellig fra tidligere rapporteret XMRV og prototypiske pMLV (fig. 2a). I modsætning hertil udledte phylogenetiske relationer

pol

sekvenser fra alle MLV grupper viste, at denne region ikke klynge af vært interval (fig. 2b). De tre

pol

sekvenser fra kræftpatienter prostata dannet et godt understøttet afstamning indeholdende en neuropathogenic Moloney MLV rekombinant (stamme tf-1-92b, GenBank accession # AF462057) (fig. 2b). XMRV

pol

sekvenser fra tidligere rapporterede patienter med prostatacancer (kodet med VP), undtagen to (VP29 og VP184, venligst stillet til rådighed af Joe DeRisi), grupperet med dem fra personer med CFS (kodet med WPI) med betydelig bootstrap støtte. VP29 og VP184

pol

sekvenser var identiske med hinanden, men 1,2% afvigende fra andre XMRV og dannede en svagt understøttet klynge indeholdende en blanding af EMLV og pMLV (fig. 2b). Disse resultater viser en bredere mangfoldighed af XMRV i denne region end tidligere set, men er i overensstemmelse med rekombination med Moloney MLV som rapporteret for nylig [7], [25]. VP29, VP79, VP86, VP88, VP90, og VP184 er prostata cancer patienter rapporteret i Urismann

et al.

Papir, men hvor XMRV

pol

sekvenser er endnu ikke tilgængelige på GenBank [ ,,,0],7]. Nyligt rapporterede

gag

pol

sekvenser findes i human tumorcellelinje DNA var placeret uden for de regioner, der anvendes i vores undersøgelse, og dermed ikke var medtaget i analyserne [25].

A. kuvert (

env

), B. polymerase (

pol

), og C.

gag

. Stabilitet af træet topologi blev testet under anvendelse 1000 bootstrap replikerer i både nabo sammenføjning (NJ) og maksimal sandsynlighed (ML) metoder. Bootstrap værdier 60 er vist ved større knudepunkter (NJ /ML). Nye sekvenser fra den aktuelle undersøgelse er indrammet. Tiltrædelsespartnerskaber numre til prototypiske MLV-sekvenser til rådighed på GenBank er XMRV VP35 = DQ241301, XMRV VP62 = DQ399707, XMRV VP42 = DQ241302, XMRV WPI-1106 = GQ497344, XMRV WPI-1178 = GC497343, XMRV PCA1-PCA17 = GU812341-GU812357, MLV DG -75 = AF221065, MLV MTCR = NC_001702, MLV AKV ​​= J01998, MLV BM5eco = AY252102.1, Moloney MLV = J02255, Moloney neuropthogenic MLV variant ts1-92b = AF462057, Rauscher MLV = NC_001819, Friend MLV = X02794, Merv Chr 7 = AC167978, Merv Chr 7 = AC127565, Merv Chr 8 = AC127575, Merv Chr 12 = AC153658, Merv Chr 9 = AC121813, Merv Chr 4 = AL627077, Merv Chr 1 = AC083892), XMLV A2780 = FR670594, XMLV BHY = FR670595, XMLV Daudi = FR670596, XMLV EKVX = FR670597, XMLV IMR-5 = FR670598, XMLV MUTZ-1 = FR670599, XMLV S-117 = FR670600, XMLV TYK-nu = FR670601. Sekvenser betegnet RAW er fra polytropisk MLV isoleret i HeLa-celler, der anvendes til at udvikle den interne WB test. Sekvenser kodet som XMRV VP og PCA og WPI er fra prostatakræft og CFS patienter. Yderligere prostatacancer patient VP

gag

pol

sekvenser blev venligst stillet til rådighed af Drs. Robert Silverman og Joe Derisi. Viral tropisme, som bestemmes ved analyse af

env

sekvenser, er angivet med blå (xenotropisk), lilla (polytrope), og gul (ecotrope) kugler.

gag

sekvens fra patient 5956 grupperet med XMRV sekvenser fra en prostatacancerpatient (VP88), en xenotropisk MERV fundet på musekromosom 8 og en pMLV sekvens identificeret i en bloddonor (BD-28) ved Lo

et al.

(fig. 2c) [24]. Denne slægt var mellem clader indeholder XMRV fra prostatakræft og CFS patienter og de fleste PMLVs og de resterende MLV’erne fundet i Lo

et al.

Studere [24]. En prototypisk pMLV (MCF1233) grupperet med alle EMLVs og to XMRVs, tyder det er et rekombinant i denne region (fig. 2c).

Disse fylogenetiske resultater tyder også kort region af

env

målrettet efter vores nye PCR-analysen er nyttig til bestemmelse af viral tropisme for at skrive MLV-relaterede sekvenser. Disse oplysninger kan være nyttige i at forstå oprindelsen af ​​de sekvenser identificeret i PCR-positive mennesker. I modsætning hertil

gag

og

pol

regioner viste mindre gruppering af tropisme angiver viral rekombination i disse regioner. For eksempel

gag

sekvenser af prototypiske XMLVs (MTCR), EMLVs (AKV, BM5eco), og PMLVs (MCF1233) grupperet sammen med særdeles signifikant bootstrap support (fig. 2a).

næsten identiske fylogenetiske træ topologier for hvert gen region blev opnået med både NJ og ML metoder. De XMRV sekvenser fra begge prostatacancerpatienter var også forskellig fra de pMLV sekvenser amplificeret fra den murine cellelinie (RAW) anvendes til fremstilling af WB antigener demonstrerer yderligere, at disse ikke laboratorie kontaminanter (fig. 2). Disse resultater bekræfter tilstedeværelsen af ​​XMRV i både patienter og viser, at XMRV mangfoldighed er større end i øjeblikket værdsat.

De XMRV sekvenser præsenteret i det aktuelle dokument findes på GenBank med tallene tiltrædelse HM003608-HM003612, og HQ116790. Sekvenser fra andre studier med XMRV-positive patienter med prostatacancer var ikke tilgængelig på GenBank til optagelse i vores analyser [9], [11], [12], [16].

Fravær af antistoffer i plasma fra prostata kræftpatienter

Alle 162 prostatakræft patient plasmaprøver blev fundet negativ for antistoffer mod XMRV /MLV i WB-test, herunder plasma fra personer 5935, 5956, og 6203 (fig. 3). I de fleste plasmaprøver vis grad af ikke-specifik reaktivitet blev observeret, at den ikke-inficerede antigen, men uden tegn på specifik reaktivitet til Gag og /eller env-proteiner i inficerede antigen blot (fig. 3).

Molekylvægtmarkører (kD ) er tilvejebragt på den venstre af de WBS i de øvre paneler. Forventede størrelser af viral Gag (p30, capsid (CA)), pr65, og Konvolut (Env, gp69 /71) proteiner Samtlige WB i de øverste paneler. Repræsentative WB resultater for elleve patienter med prostatacancer, herunder patienter 5956 og 6203 (angivet med asterisk). Bestemmelse af MLV specifik reaktivitet bestemmes ved sammenligning af seroreaktivitet til xenotropisk MLV-inficerede HeLa-antigener og ikke inficerede HeLa-antigener i øvre og nedre paneler, hhv. Ra, Rauscher MLV hel virus ged polyklonale antisera; Fr, Friend MLV Konvolut (gp69 /71) ged polyklonale antisera; præ-immune, gedesera før immunisering.

RNase L R462Q allel fordeling i undersøgelsen befolkning og kliniske karakteristika af de tre XMRV-smittede personer

15 af de 162 personer ( 9,3%) blev bestemt til at være homozygote (QQ) for R462Q RNase L mutation, 74 (45,6%) havde den homozygote RR allel, og 73 (45,1%) var heterozygote (RQ) for mutationen (tabel 1).

Patient 5935 er den heterozygote RQ RNase L genotype. Han har en dårligt differentieret adenocarcinom med en Gleason score på 6, T2C patologisk stadium PSA-niveau på 4,6 ng /ml. Patient 5956 er vildtype homozygot RR RNase L genotype. Han havde en dårligt differentieret adenocarcinom med en Gleason score på 7, T3A patologisk stadium, en 12,4 ng /mL PSA-niveau. Patient 6203 er den heterozygote RQ RNase L genotype, og havde en moderat differentieret adenocarcinom med en Gleason score på 6, T2C patologisk stadium og et 7,1 ng /ml PSA-niveau. Således var vi i stand til at bekræfte en sammenslutning af XMRV infektion med homozygot QQ RNase L allel. I betragtning af lav forekomst af XMRV, havde vi ikke den statistiske styrke til at afgøre, om der er en sammenslutning af XMRV med tumor klasse.

Diskussion

Vi brugte PCR og serologisk test for at studere forekomsten af XMRV i 162 velkarakteriserede Nordamerikanske patienter med prostatacancer. Vi undersøgte kræftformer med mellemliggende til avancerede stadier, og udnyttede flere PCR-analyser, herunder test med bevarede primere til at tillade påvisning af forskelligartede XMRV og MLV-relaterede sekvenser. Næsten halvdelen af ​​prøverne blev også testet i tre eksemplarer til maksimere afsløring følsomhed af lav-kopi-sekvenser. Vi anvendte en bredt reaktivt WB assay til at teste alle patienter for antistoffer. Vores resultater dokumenterer en meget lav forekomst (1,9%) af XMRV sekvenser i prostatavæv DNA og fravær af antistof positivitet i alle prøver. Kombineret disse data understøtter ikke en sammenslutning af XMRV eller relaterede MLV med prostatakræft.

De overvejende negative PCR resultater blev observeret på trods af en ug DNA, som er 4-10 × højere end input-DNA anvendt i tidligere undersøgelser, der rapporterede XMRV afsløring [7], [9], [14], [16]. Ligeledes kan den observerede lave forekomst af XMRV ikke forklares ved en nedsat PCR-assay-følsomhed, da vi screenede prøver med det samme assay anvendes først ved Urisman

et al.

[7]. I de tre prøver med påviselige sekvenser, vi bemærkede, at kopien nummer var meget lav som indlejret PCR og kopiere test var ofte nødvendigt for detektion. Vigtigere er, i alle tre prøver kunne vi ikke påvise muse mtDNA trods anvendelse af et yderst følsomt assay, hvilket antyder, at kilden til XMRV er usandsynligt resultat af forurening med muse-DNA. Disse resultater er vigtige, da mus DNA-kontaminering blev rapporteret at være kilden til XMRV i en nylig undersøgelse af prostatakræft væv [26]. Forfatterne til denne undersøgelse anvendes en PCR-assay til musen intracisternal En partikel (IAP) som de angives at være mere følsom end en mus-specifik D-loop mtDNA-assay [26]. Selvom DNA prøver ikke var tilgængelig til testning i IAP testen, har vi fundet, at IAP assayet er lige følsomme over for vores COX2 realtid mtDNA assay (data ikke vist), hvilket yderligere eksklusive muse DNA-kontaminering som en kilde til vores positive PCR resultater. Desuden blev DNA prøver fremstillet ved FCCC hvor kun humane biologiske prøver og ikke cellelinjer, håndteres, hvilket reducerer yderligere muligheden for murine kontaminering.

Sekvensanalyse af de PCR-positive prøver var meget informative, fordi det bekræftet, at alle tre prøver var XMRV-relaterede. Også konstateringen af ​​en virusstamme i tre prostata kræftpatienter, der er forskellig fra den XMRV set i tidligere undersøgelser er betydelig og demonstrerer en bredere viral mangfoldighed [7], [9], [14], [16]. Dette ville være et forventet resultat i overensstemmelse med virus evolution under spredning og persistens. Fraværet af antistoffer og plasma viræmi i disse tre patienter er bemærkelsesværdigt, fordi det kan afspejle sekvestrerede eller latente infektioner. Tab af antistof under en latent infektion, mens atypisk for de fleste retrovirale infektioner, er blevet beskrevet tidligere for naturlig infektion af makakaber med simian type D retrovirus (SRV) [27]. SRV i makakaber er forbundet med udbrud af alvorlig immundefekt i primat kolonier og latent SRV-infektion i disse antistof negative dyr bekræftes med større følsomhed ved hjælp af PCR-analyse [27]. Vores resultater er også i overensstemmelse med dem, der ses for nylig i makakaber eksperimentelt inficeret med XMRV, hvor væv ved obduktion er PCR-positive, men viræmi og afsløring af provirus i PBMC’er forsvinder hurtigt, efterfulgt af tab af antistof detektion [28], [29]. Selvom én undersøgelse rapporteret påvisning af XMRV neutraliserende antistof i 11 patienter med prostatacancer, blev disse data ikke bekræftet af mere følsomme metoder, såsom WB, eller ved PCR test i alle tilfælde, og dermed kan repræsentere ikke-specifik reaktivitet [11], [17 ]. Forløbsundersøgelser kan bedre definere vært reaktioner på XMRV infektion.

Vores undersøgelse populationen indeholdt 15 personer med mutant QQ RNase L allel. Men ingen var XMRV-positive, hvilket står i kontrast til de oprindelige resultater ved Urismann

et al.

[7]. De XMRV-smittede personer i vores undersøgelse havde enten homozygot vildtype (RR) eller heterozygot (RQ) RNase L R462Q alleler. Vores resultater er i overensstemmelse med andre amerikanske og europæiske studier, som også er identificeret højere frekvenser af homozygote QQ mutant allel i XMRV-negative personer [9], [10], [16]. Tilsammen tyder disse resultater på, at XMRV infektion ikke er forbundet med dette allel form af RNase L.

Selvom vores data ikke støtter en sammenslutning af prostatacancer med XMRV, er det vigtigt at forstå, om XMRV har nogen kausal rolle i prostatacancer, når det er sjældent detekteres. Generelt gammaretroviruses ligesom XMRV inducere malign transformation ved insertionsmutagenese, således at maligne celler i en tumor er alle klonalt inficeret. Denne mekanisme af carcinogenese er blevet fundet i dyr såvel som hos børn, der udsættes for MLV-afledte vektorer i gen-terapi forsøg [30], [31]. Derfor er den lavfrekvente af XMRV-inficerede celler findes i alle tre patienter er uforenelige med en direkte rolle XMRV i prostata carcinogenese hos disse patienter. Tidligere har en human prostatacancer-cellelinie, 22Rv1, blevet vist at udtrykke høje niveauer af XMRV, en konstatering, der understøtter en rolle XMRV i prostatakræft tumorigenese [32]. Det blev imidlertid rapporteret for nylig, at XMRV udtrykt af 22Rv1 ikke kan være af human oprindelse, men sandsynligvis opstod via rekombination af to overlappende XMRV-lignende genomer under passage af prostata tumor i indavlede mus (T. Paprotka

et al .

18

th konference om Retrovira og opportunistiske infektioner). Endvidere har andre vist, at XMRV integrationssteder klonet fra prostatavæv af to ud af ni patienter kan have været resultatet af kontaminering med DNA fra eksperimentelt inficerede DU145 celler [33], mens andre XMRV integrationssteder ikke er i nærheden tumorsuppressorgener eller proto- onkogener [34]. Kombineret, disse resultater rejser spørgsmål om den rolle, XRMV i prostatakræft. Ikke desto mindre er mere arbejde nødvendige for bedre at forstå forekomsten af ​​XMRV og MLV’er i mennesker og deres rolle i human sygdom.

Materialer og metoder

studiepopulation

Anonym, arkiveret plasma og prostata væv var tilgængelige fra 162 patienter amerikanske prostatacancer indsamlet af Fox Chase Cancer center (FCCC) bioprøven Repository Core Facility mellem 1997 og 2004. Hele blodprøver blev indsamlet på tidspunktet for præ-kirurgisk afprøvning eller på operationsdagen før anæstesi fra samtykkende kræftpatienter som en del af en undersøgelse godkendt af FCCC personmotiver udvalget. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle deltagere. Den FCCC personmotiver etiske komité godkendt indsamling, opbevaring og fremtidig testning af prøver indsamlet fra alle samtykkende undersøgelsens deltagere. En ikke-forskning bestemmelse blev godkendt til afprøvning af de anonymiserede prøver ved CDC for XMRV og beslægtede vira. Alderen ved diagnose af de 162 deltagere varierede fra 36 til 71 år med et gennemsnit og median på 57 år. 86% var hvide, 12% African American, og 1% var asiatisk, ikke registreret, eller andet. Den gennemsnitlige og median serum prostata-specifikt antigen (PSA) niveauer var 7,22 ng /ml og 5,5 ng /ml. Tumoren kvalitet for 75 af 162 (46%) af deltagerne var moderat differentieret, mens 54% havde dårligt differentierede tumorer. Ved hjælp af Gleason-system, 42% af den undersøgte population havde klasse 5-6 kræft, 40% havde Karakteren 7, og 18% havde høj kvalitet adenocarcinom (Gleason score 8-10). Patologisk stadieinddeling klassificeret de prostatatumorer som T1C (0,6%), T2A (9,3%), T2B (3,1%), T2C (61,7%), T3A (17,9%), T3B (5,6%), og T4 (1,8%).

Prøve forberedelse

Plasma blev opdelt i portioner og opbevaret ved -80 ° C inden for 4 timer blodprøvetagning. Plasmaprøver blev alikvoteret igen på CDC efter optøning for serologisk testning; de resterende portioner blev nedfrosset ved -80 ° C. DNA prøver blev fremstillet ved phenol-chloroform-ekstraktion af prostatavæv ved FCCC anvendelse af standardprocedurer. Kun humane væv behandles ved FCCC. For udvalgte prøver QIAamp DNA MINIKIT (Qiagen, Carlsbad, CA) blev anvendt ved CDC. For plasma RT-PCR test af en volumen på 0,5-1,0 ml blev ultracentrifugeret ved 45.000 rpm for at koncentrere virus. 360 ul til 860 ul plasma supernatant blev forsigtigt fjernet, og pelleten blev resuspenderet i 140 ul centrifugeret plasma tilbage i røret og derefter RNA blev ekstraheret under anvendelse af QIAamp Viral RNA MINIKIT (Qiagen, Valencia, CA). Nucleinsyre-koncentrationer blev bestemt ved spektrofotometri ved anvendelse af NanoDrop instrument (Thermo Scientific, Wilmington, DE). Integritet af DNA- og RNA-prøver blev bestemt ved anvendelse ß-actin eller GAPDH PCR henholdsvis som beskrevet [35], [36]. Alle prøvepræparation, vævskultur, og PCR test blev udført i fysisk isolerede rum for at forhindre forurening.

Molekylær detektering af XMRV

For at opdage XMRV og andre MLV varianter vi brugte særskilte PCR-assays med primere specifik til påvisning af XMRV eller konserverede primere til den generiske detektion af MLV og XMRV, som tidligere beskrevet [21]. DNA prøver blev screenet under anvendelse af to indlejrede PCR-assays. Den første analyse bruger PCR primere GAGOF, GAGOR, GAGIF, og GAGIR ansat af Urismann

et al.

Og Lombardi

et al.

At opdage 413 bp XMRV

gag

sekvenser i prostatacancerpatienter og hos personer med CFS henholdsvis [7], [18]. Den anden PCR-assay detekterer generisk MLV og XMRV polymerase (

pol

) sekvenser ca. 216 bp i længde under anvendelse af primerne XPOLOF, XPOLOR, XPOLIF, og XPOLOR [21]. Både

gag

pol

PCR-test kan afsløre 10 eksemplarer af XMRV plasmid-DNA fortyndet i en baggrund af en ug menneskelige DNA [21]. Prøver at teste positiv for enten

gag

eller

pol

sekvenser blev re-testet med begge analyser og blev også testet med en tredje nested PCR test for XMRV kuvert (

env

) sekvenser, der også er generisk for XMRV /MLV. Den eksterne XENVOF (5 ‘GGG GAT CTT GGT GAG GGC AGG AGC 3’) og XENVOR (5 ‘CAG AGA GAA CAG GGT CAC CGG GTC 3’) og intern primere XENVIF (5 ‘AGG GCT ACT GTG GCA AAT GGG GAT 3’ ) og XENVIR (5 ‘FTT TTT ACC CGC GTC AGT GAA TTC 3’) forstærke en 215-bp

env

sekvens. Derudover blev en delmængde af prøver (n = 77), for hvilke tilstrækkeligt DNA var tilgængelig testet tredobbelt ved hjælp af den indlejrede

pol

PCR-assay til at forbedre påvisning af lavt kopiantal XMRV /MLV.

PCR blev udført under anvendelse af 1 ug af prostatavæv-DNA i en 100 ul reaktionsvolumen under anvendelse af standardbetingelser på 94 ° C i 30 sek, 50 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 45 sek i 40 cyklusser på et ABI 9700 thermalcycler ( Foster City, CA). PCR-produkter blev visualiseret ved elektroforese i en ethidiumbromid-farvet 1,8% agarosegel. For at øge følsomheden og specificiteten af ​​de analyser, forstærket

gag

,

pol

, og

env

sekvenser blev bekræftet ved Southern blot analyse ved hjælp af de biotinylerede oligoprober XGAGP2 (5 ‘ ACC TTG CAG CAC TGG GGA GAT GTC 3 ‘), XPOLP (5’ TTG ATG AGG CAC TGC ACA GAG ACC 3 ‘), og XENVP (5’ TGG GCT CCG GTA GCA TCC AGG GTG 3 ‘) og kemiluminescensdetektion. Ligesom XMRV

gag

pol

PCR-analyser [21], den nye XMRV

env

PCR test var også i stand til at detektere 10 eksemplarer af XMRV plasmid i en baggrund af 1 ug menneskelige DNA (30/32, 93,8%). Vi har ikke afsløre eventuelle XMRV /MLV-sekvenser i PBMC DNA fra 41 amerikanske bloddonorer ved hjælp af hvert af de tre indlejrede PCR-test [21].

Kvantitativ XMRV RNA RT-PCR

Plasmaprøver fra personer med positive XMRV PCR-resultater i prostata væv DNA blev testet yderligere for viral RNA ved hjælp af to RT-PCR-test. Den første analyse, kaldet q

pro

bruger MLV /XMRV generiske protease (

pro

) Taqman primere Pro-UNV-F1 (5 ‘FTT GAA CCC AGG ATA ACC CT 3’) og Pro-UNV-R1 (5 ‘GTG GTC CAG CGA TAC CGC T 3’) og sonder Pro-UNV-P1C (FAM5 ‘AGA TAC TGG GGC CCA ACA CTC CGT GCT GAC 3’BHQ1) og Pro-UNV-PR1 ( Resultaterne og konklusionerne i denne rapport er forfatternes og afspejler ikke nødvendigvis synspunkter Centers for Disease Control og Forebyggelse.