PLoS ONE: Hypoxi-inducerbare Factor 1α Bestemmer Gastric Cancer kemosensitivitet via Modulation af p53 og NF-κB

Abstrakt

Baggrund

Reduceret kemosensitivitet af faste cancerceller repræsenterer en afgørende hindring i klinisk onkologi . Derfor er den molekylære karakterisering af veje regulerer kemosensitivitet er en vigtig forudsætning for at forbedre cancerterapi. Hypoxi-inducerbare faktor HIF-1α er blevet forbundet med kemosensitivitet mens de underliggende molekylære mekanismer stort set undvigende. Derfor har vi analyseret omfattende HIF-1α rolle i fastlæggelsen kemosensitivitet fokus på ansvarlige molekylære veje.

Metode og vigtigste resultater

RNA-interferens blev anvendt til at inaktivere HIF-1α eller p53 i den menneskelige mavekræft cellelinier AGS og MKN28. Den kemoterapeutiske midler 5-fluoruracil og cisplatin blev anvendt, og kemosensitivitet blev vurderet ved celleproliferationsassays samt bestemmelse af cellecyklusfordeling og apoptose. Ekspression af p53 og p53 målproteiner blev analyseret ved western blot. NF-KB-aktivitet blev karakteriseret ved hjælp af elektroforetisk mobility shift-assay. Inaktivering af HIF-1α i gastriske cancerceller resulterede i robust forhøjelse af kemosensitivitet. Følgelig HIF-1a-kompetente celler udviste en signifikant reduktion af kemoterapi-induceret senescens og apoptose. Bemærkelsesværdigt, denne fænotype var helt fraværende i

p53

mutant celler, mens inaktivering af p53

per se

påvirkede ikke kemosensitivitet. HIF-1α markant undertrykt kemoterapi-induceret aktivering af p53 og p21 samt retinoblastoma protein, vinder resulterer i cellecyklusstop. Reduceret dannelse af reaktive oxygenarter i HIF-1α-kompetente celler blev identificeret som den molekylære mekanisme af HIF-1α-medieret inhibering af p53. Endvidere tab af HIF-1α ophævet, i en p53-afhængig måde, kemoterapi-induceret DNA-binding af NF-KB og ekspression af anti-apoptotiske NF-KB målgener. Derfor rekonstituering af NF-KB-underenhed p65 vendt øgede kemosensitivitet af HIF-1a-mangelfulde celler.

Konklusion og betydning

Sammenfattende vi identificeret HIF-1α som en potent regulator af p53 og NF-KB-aktivitet under betingelser for genotoksisk stress. Vi konkluderer, at

p53

mutationer i humane tumorer holde potentiale til at forvirre effekten af ​​HIF-1-hæmmere i kræftbehandling

Henvisning:. Rohwer N, Dame C, Haugstetter A, Wiedenmann B , DETJEN K, Schmitt CA, et al. (2010) Hypoxi-inducerbare Factor 1α Bestemmer Gastric Cancer kemosensitivitet via Modulation af p53 og NF-KB. PLoS ONE 5 (8): e12038. doi: 10,1371 /journal.pone.0012038

Redaktør: Deb Fox, The Research Institute for børn på Børnehospital New Orleans, USA

Modtaget: April 28, 2010; Accepteret: 19 jul 2010; Udgivet: 10 August, 2010

Copyright: © 2010 Rohwer et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (https://www.dfg.de) til TC (CR 133 /2-1, 133 /2-2 og 133 /2-3), og NR (Graduiertenkolleg 276/4 – “Signalerkennung und -umsetzung”). TC blev også støttet af en bevilling fra Berliner Krebsgesellschaft e.V. (https://www.berliner-krebsgesellschaft.de, CRFF200804). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Intrinsic og erhvervet lægemiddelresistens er de primære årsager til begrænset effekt af kemoterapi i de fleste gastrointestinale maligniteter, herunder mavecancer [1], [2]. Lægemiddelresistens repræsenterer en kompleks og multifaktoriel fænomen relateret til tumor mikromiljø, f.eks hypoxi, acidose og inflammation samt den neoplastiske celle selv [3]. Cellular resistens kan være uløseligt forbundet med den specifikke genetiske baggrund af tumor celle eller et resultat af mutationer og epigenetiske ændringer efter antiproliferativ terapi [4], [5].

transskription faktor hypoxi-inducerbare faktor 1 (HIF-1 ) udgør en central regulator af cellulær tilpasning til hypoxi og er blevet impliceret i resistens [6] – [8]. HIF-1-proteinet er en heterodimer sammensat af et konstitutivt udtrykt β-underenhed (Arnt (aryl hydrocarbon receptor nuklear translokatoren)) og en hypoxi-inducerbar α-underenhed [9]. Under normoxiske betingelser kan HIF-1α-aktivitet induceres af forskellige vækstfaktorer, cytokiner, aktiverede onkogener eller tab af funktion muterede tumorsuppressorgener [10]. HIF-1α er centralt involveret i flere aspekter af tumorigenese, herunder tumor celleproliferation, angiogenese, metastaser, såvel som reaktion på kemoterapi og strålebehandling [11]. HIF-1α overudtrykkes i en lang række faste tumorer, og tumoral HIF-1α ekspression er ofte forbundet med dårlig prognose [12] – [15]. Endvidere har inhibering af HIF-1α ved hjælp af RNA-interferens eller farmakologiske forbindelser vist sig antitumor virkningsfuldhed i forskellige murine cancermodeller [16]. Et bidrag HIF-1α til kemoresistens af neoplastiske celler er blevet observeret i et bredt spektrum af faste tumorer, herunder gastrisk cancer [6] – [8], [17] – [20]. Men de underliggende molekylære mekanismer samt rollen som HIF-1α for resistens under normoxiske betingelser stort set undvigende [8], [18], [21]. Her identificerer vi undertrykkelse af p53 og fremme af nuklear KB (NF-KB) aktivitet som centrale mekanismer for HIF-1α følsomhed-afgørende rolle mod 5-fluorouracil (5-FU) og cisplatin i humane gastriske kræftceller.

Resultater

HIF-1α bestemmer følsomheden af ​​gastriske kræftceller mod kemoterapeutiske midler 5-FU og cisplatin

Funktionel inaktivering af HIF-1α blev opnået ved lentiviral transduktion af AGS og MKN28 celler med små interfererende RNA (siRNA) specifikt rettet HIF-1α. Denne eksperimentelle fremgangsmåde gav en meget effektiv knockdown demonstreret ved en næsten komplet fiasko af transducerede celler for at inducere HIF-1α protein som respons på hypoxi som tidligere [22] offentliggjort. For at vurdere betydningen af ​​HIF-1α for følsomheden af ​​humane gastriske kræftceller mod etablerede kemoterapeutiske midler, vi sammenlignede virkningen af ​​5-FU og cisplatin i HIF-1α-kompetent (krypteret, “SCR”), og HIF-1α-mangel (knockdown, »KD«) AGS celler. Funktionel inaktivering af HIF-1α forskød dosis-afhængigheden af ​​vækstinhibering mod lavere medikamentkoncentrationer (figur 1A og figur S1), hvilket antyder, at HIF-1α er i stand til at reducere kemoterapi modtagelighed af gastriske cancerceller under normoxiske betingelser. I tråd med tidligere rapporter [6] – [8], [17], [18], udsættelse for hypoxi øget resistens over for 5-FU i AGS celler, men inaktivering af HIF-1α resulterede i robust forhøjelse af kemosensitivitet under hypoxiske betingelser ( Figur S2). I en supplerende fremgangsmåde, studerede vi konsekvenserne af overekspression HIF-1α (pcDNA HIF-1α) for kemosensitivitet af AGS-celler. AGS celler, der overudtrykker HIF-1α var betydeligt mere resistent over for behandling med 5-FU (figur 1B). Stabil HIF-1α ekspression blev bekræftet ved HRE (hypoxi responsivt element) luciferase reporter assay (figur 1C). Disse resultater antyder kraftigt, at HIF-1α begrænser cytotoksiske virkning af 5-FU og cisplatin i humane gastriske kræftceller og at inaktivering af HIF-1α kan have gavnlige virkninger på kemosensitivitet.

(A) spredning af AGS KD og SCR-celler 24 timer efter behandling med stigende koncentrationer af 5-FU under normoxiske betingelser. Cell-numre er vist som procent af ubehandlede celler (*,

P

0,05, **,

P

0,01). (B) AGS vildtypeceller blev transficeret med HIF-1α ekspressionsvektor (pcDNA HIF-1α) eller tom vektor (pcDNA 3.1) og behandlet med 5-FU 24 h efter transfektion. Cell-numre blev bestemt 24 timer efter behandling med 5-FU, og er vist som procent af ubehandlede kontrol celler (**,

P

0,01). (C) AGS vildtypeceller blev cotransficeret med enten pcDNA HIF-1α eller pcDNA 3.1 plus HRE-Luciferase reporter (pHRE-Luc) og

Renilla

reporter (phRL-null) som intern kontrol. Celler blev høstet 48 timer efter transfektion. HRE luciferaseaktiviteten, normaliseret for

Renilla

luciferaseaktivitet, blev udtrykt i forhold til den for kontrol transficeret celler (***,

P

0,001).

HIF-1a grænser kemoterapi-induceret cellecyklusstop og apoptose via undertrykkelse af p53

Vi startede en karakteristik af den observerede væksthæmning ved at analysere cellecyklus distributionsmønstre efter kemoterapi. G

1-synkroniseret, serum-hungrende AGS celler blev frigivet fra G

0 /G fase

1 ved tilsætning af serum og cellecyklus-profiler blev bestemt efter tilsætning af 5-FU. Løst kulturer af ubehandlede AGS let skred gennem G

1 i S og G

2 /M faser [22], mens 5-FU-behandlede celler forblev i G

1 fase (ikke vist). Interessant nok blev 5-FU-afhængig tilbageholdelse af celler i G

1 fase stærkt forøget i AGS KD forhold til AGS SCR-celler, i overensstemmelse med G

1 cellecyklusstandsning (figur 2A). Irreversible cellecyklusstop har vist sig som en vigtig virkningsmåde antiproliferative midler og er karakteriseret ved cellulære funktioner i senescens [7], [23]. Derfor blev den del af senescentceller bestemt. Faktisk behandling med 5-FU medførte et robust induktion af senescens i AGS celler. Dette respons blev signifikant forøget i celler med samtidig tab af HIF-1α (figur 2B). Endvidere induktion af apoptose blev foreslået af en forøget pre G

1 fraktion i DNA histogrammer af 5-FU-behandlede AGS KD-celler (ikke vist). Derfor blev opnået en kvantitativ analyse af den apoptotiske cellefraktion baseret på påvisning af spaltet caspase-3 (figur 2C). I overensstemmelse med data om cellecyklusfordeling blev den 5-FU-induceret apoptotisk fraktion steget betydeligt i HIF-1α-mangelfulde AGS KD celler sammenlignet med HIF-1a-kompetent celler.

(A) AGS KD og SCR-celler blev behandlet i 24 timer med 10 ug /ml 5-FU, og cellecyklus blev bestemt ved FACS-analyse (**,

P

0,01). (B) Kemoterapiinduceret senescens blev kvantificeret i AGS KD og SCR-celler 4 dage efter behandling med 5-FU ved måling af SA-β-Gal-aktivitet (**,

P

0,01). (C) AGS KD og SCR-celler blev behandlet i 48 timer med 10 ug /ml 5-FU og apoptose blev kvantificeret baseret på påvisning af aktiv caspase-3 under anvendelse af flowcytometri (**,

P

0,01 ). (D) repræsentant immunoblotanalyse af p53, p21, CDK2, cyclin A og pRb proteinniveauer i AGS KD og SCR-celler behandlet med 10 ug /ml 5-FU til 6 og 24 timer. Actin tjente som lastning kontrol. ppRb, phosphoryleret pRb.

kemoterapi-induceret aldring og apoptose begge er blevet tæt knyttet til tumor suppressor

p53

. Således har vi den hypotese, at p53 kan bidrage til forøget cytotoksicitet af 5-FU ved tab af HIF-1α. Efter 5-FU behandling, p53 protein gradvist akkumuleret i AGS celler, en effekt, der blev påfaldende forøget i HIF-1a-deficiente AGS celler (Figur 2D). Denne stabilisering af p53 blev forbundet med forøgede niveauer af cyclin-afhængig kinase (CDK) inhibitor p21, en veletableret transkriptionel mål og nedstrøms effektor af p53 med funktioner i cellecyklusstandsning, ældning induktion og apoptose (figur 2D). Igen viste HIF-1a-deficiente AGS celler en markant kraftigere stigning i p21 end HIF-1a-dygtige AGS celler. Stærk induktion af p21 forventes at inhibere aktiviteten af ​​G

1 cyclin /CDK-komplekser, hvilket resulterer i hypophosphorylering af retinoblastoma protein (pRb) og manglende inducere cykliner S-fase, fx cyclin A. Faktisk både pRb hypophosphorylering og reducerede cyclin A-niveauer blev bekræftet i 5-FU-behandlede AGS KD-celler og – i mindre grad – også i AGS SCR celler (Figur 2D). Disse ændringer underbygger opbevaring G

1 fase observeret i DNA histogrammer og er i overensstemmelse med den irreversible G

1 anholdelse observeret i kemoterapi-induceret ældning. Således er de forskellige biologiske udfald af 5-FU behandling i HIF-1α-deficiente og -proficient AGS celler skyldes differentiel regulering af p53 og dets nedstrømsmål p21.

Inaktivering af p53 sløver rolle HIF-1α for kemosensitivitet

for at opnå eksperimentelt bevis for den foreslåede rolle p53 i HIF-1α-medieret regulering af kemosensitivitet i AGS celler, vi funktionelt inaktiveret p53 ved RNA-interferens hjælp forbigående transfektion af anti-p53 siRNA (si p53) eller et kodet kontrol siRNA (si scr). P53 blev effektivt slået ned, som indikeret ved svigt af de transficerede celler til at inducere p53 effektorer p21 og MDM2 som respons på 5-FU-behandling (figur 3A). Interessant, AGS KD celler transficeret med si p53 var signifikant mindre modtagelig for vækstinhibering med 5-FU end AGS KD celler transficeret med kontrol siRNA (figur 3B). I overensstemmelse med disse resultater, blev G

1 cellecyklus fastholdelse og apoptose af 5-FU-behandlede AGS KD-celler reduceres med p53 knockdown i sammenligning med celler transficeret med kontrol siRNA (figur 3D og 3E). I skarp modsætning hertil blev kemosensitivitet af HIF-1a-dygtige AGS celler ikke påvirkes af inaktivering af p53 (figur 3C).

AGS celler blev transficeret med kontrol siRNA (si scr) eller siRNA mod p53 (si p53) og 10 pg /ml 5-FU blev der tilsat 24 h efter transfektion. (A) Immunblotanalyse for p53, p21 og MDM2 i helcelleekstrakter fra AGS KD celler efter 5-FU-behandling. Actin tjente som lastning kontrol. (B og C) Cell antal si scr og si p53 transficeret AGS celler blev bestemt 24 timer efter behandling med 5-FU. Resultaterne er vist som procent af ubehandlede kontrolceller (**,

P

0,01). Celler i G

1 fase (D) og thesub-G

1 population (E) blev vurderet fra DNA histogrammer af AGS KD celler transficeret med si p53 eller si scr og behandlet i 24 timer med 5-FU ( *,

P

0,05, **,

P

. 0,01)

HIF-1α ikke påvirke kemosensitivitet i

p53

mutant celler

for at bekræfte HIF-1α-afhængig regulering af 5-FU lydhørhed og for yderligere at karakterisere bidrag p53, vi undersøgte et andet menneske mavekræft cellelinje (MKN28), der bærer en missense mutation i

TP53

ved kodon 251. Interessant deletion af HIF-1α i MKN28 celler mislykkedes at øge vækstinhibering efter udsættelse for 5-FU (figur 4A). Tilsvarende 5-FU-induceret G

1 ophobning og apoptose af MKN28 celler blev ikke påvirket af tab af HIF-1α (figur 4B og 4C). I overensstemmelse med disse resultater, protein niveauer af p53 og pRb forblev uændret i 5-FU-behandlede MKN28 celler i hele 24 timer periode, og p21 induktion var fraværende (figur 4D). Men når p53-funktion blev restaureret ved forbehandling med den kemiske forbindelse PRIMA-1 [24] HIF-1α knockdown oversat til en væsentligt forbedret 5-FU cytotoksicitet (Fig S3). I overensstemmelse med den etablerede rolle p53 i kemoterapi-induceret cytotoksisk /cytostatisk virkning, behandling med PRIMA-1

per se

lidt reduceret spredning af MKN28 celler og væsentlig større effekt af 5-FU i MKN28 celler (figur S3).

(A) Cell antal MKN28 KD og SCR-celler 24 timer efter behandling med 5-FU under normoxiske betingelser. Data er vist som procent af ubehandlede celler. Celler i G

1 fase (B) og apoptotiske celler (C) blev kvantificeret fra DNA histogrammer af MKN28 KD og SCR celler behandlet i 48 timer med 10 ug /ml 5-FU. (D) Immunoblotanalyse af p53, p21 og pRb proteinniveauer i MKN28 KD og SCR-celler behandlet med 10 ug /ml 5-FU til 6 og 24 timer. Actin tjente som lastning kontrol.

NF-KB er en vigtig formidler af HIF-1α rolle i kemosensitivitet

Aktivering af NF-KB er forbundet med beskyttelse mod kemoterapi-induceret apoptose og omvendt inhibering af NF-KB kan forbedre effektiviteten af ​​anti-neoplastiske midler både

in vivo

in vitro

[25] – [27]. Derfor bestemte vi NF-KB-DNA-bindende aktivitet i HIF-1α-mangelfulde og -proficient AGS celler efter behandling med 5-FU ved elektroforetisk mobilitet (EMSA). Behandling med 5-FU kraftigt aktiverede NF-KB-DNA-bindende i AGS SCR-celler, med maksimale niveauer forekommer 6 timer efter udsættelse for 5-FU (figur 5A). Behandling med TNFa i 4 timer tjente som positiv kontrol for aktivering af NF-KB. Endvidere blev et supershift induceret af et anti-p65-antistof, hvilket bekræfter, at 5-FU inducerede NF-KB-komplekser indeholdt 65-kDa underenhed (p65). Tab af HIF-1a signifikant inhiberede aktivering af NF-KB som reaktion på 5-FU og TNFa (figur 5A). I overensstemmelse med denne observation, 5-FU behandling heller ikke inducere NF-KB målgener cIAP1 og A20 i AGS KD celler, hvorimod de let blev induceret i AGS SCR-celler (figur 5B).

(A) nukleare ekstrakter af AGS KD og SCR celler blev fremstillet i de angivne tidspunkter efter behandling med 10 ug /ml 5-FU eller TNFa som en positiv kontrol, og DNA-bindende aktivitet for NF-KB blev undersøgt ved EMSA. For supershift eksperimenter blev kerneekstrakter inkuberet med et anti-p65 antistof. (B) Ekspression af NF-KB målgener cIAP1 og A20 mRNA i totalt RNA ekstrakter fra AGS KD og AGS SCR-celler 48 timer efter behandling med 10 ug /ml 5-FU. Data blev udtrykt i forhold til mRNA-niveauer i ubehandlede AGS SCR celler, sat til 1,0 (*,

P

0,05, **,

P

0,01). (C) AGS KD-celler blev co-transficeret med enten pcDNA p65 eller pcDNA 3.1 og behandlet med 5-FU 24 h efter transfektion. Cell-numre var efter en anden 24 timer og præsenteres som procent af ubehandlede kontrol celler (***,

P

0,001). (D) DNA-bindingsaktivitet for NF-KB blev undersøgt ved EMSA hjælp nukleare ekstrakter af MKN28 KD og SCR celler behandlet med 10 ug /ml 5-FU eller TNFa i de angivne tidsrum. Antistof inhibering blev udført med et anti-p65 antistof.

For at løse den funktionelle betydning af NF-KB i 5-FU-induceret vækstinhibering, vi overudtrykt p65 (pcDNA p65) i AGS KD-celler. Transfektion af pcDNA p65, men ikke den tomme vektor kontrol, resulterede i en signifikant induktion af p65-protein og NF-KB transkriptionel aktivitet i AGS KD celler (Figur S4). At bemærke, HIF-1a-deficiente AGS KD celler, der overudtrykker p65 var betydelig mere resistente over for 5-FU behandling sammenlignet med AGS KD-celler transficeret med kontrolvektoren (figur 5C), i overensstemmelse med en væsentlig rolle af NF-KB i mediering kemoresistens dybt 5-FU i gastriske cancerceller. Tilsammen en samtidig aktivering af p53 og inhibering af NF-KB i 5-FU-behandlede, HIF-1a-deficiente AGS celler blev observeret. At afklare, om begge begivenheder er indbyrdes afhængige, studerede vi 5-FU-induceret NF-KB-aktivering i MKN28 celler med mutant

p53.

Både 5-FU og TNFa aktiverede NF-KB-DNA-bindende på en tids- afhængig måde, hvilket indikerer p53-uafhængige mekanismer af NF-KB-aktivering med 5-FU (fig 5D). Men forskellig fra konstateringen i AGS celler, dette NF-KB-aktivering i

p53

mutant cellelinie ikke sløvet af HIF-1α inaktivering. Således kan HIF-1α understøtte kemoterapi-induceret NF-KB-aktivering ved at modvirke p53-afhængige hæmmende mekanismer.

Altered ROS dannelse er ansvarlig for HIF-1α-induceret ændring af p53 aktivitet

Til klarlægge den molekylære mekanisme underliggende p53 superinduction i 5-FU-behandlede HIF-1α-deficiente celler, kendetegnet vi rollen af ​​reaktive oxygenarter (ROS). ROS udgør en kandidat link som (i) ROS er potente aktivatorer af p53 funktion og anses nøglefaktorer i induktion af p53 af forskellige kemoterapeutiske stoffer [28], og (ii) HIF-1α kan undertrykke ROS generation ved at sænke mitokondrie aktivitet og biogenese [22], [29], [30]. Følgelig blev AGS KD-celler forbehandlet med ROS-hæmmere diphenyleneiodonium chlorid (DPI) eller apocynin. Begge inhibitorer tilvejebragte signifikant beskyttelse mod 5-FU-induceret vækstinhibering i AGS KD-celler (figur 6A og 6B). Endvidere DPI og apocynin næsten fuldstændigt forhindrede induktionen af ​​p53 og dets nedstrømsmål p21 i 5-FU-behandlede celler (figur 6C og 6D). Disse resultater antyder et skæringspunkt for HIF-1α signalering med p53-medieret respons til 5-FU på niveauet af ROS-produktion. At etablere en kausal rolle HIF-1α til redoxpotentialet af AGS celler efter 5-FU-behandling blev intracellulære ROS-niveauer bestemt i AGS KD og SCR-celler ved flowcytometri. Vi fandt, at de intracellulære superoxid niveauer i 5-FU-behandlede AGS KD-celler var 2,5 gange højere end i 5-FU-behandlede AGS SCR-celler (figur S5), hvilket indikerer, at funktionel inaktivering af HIF-1α i AGS-celler resulterede i signifikant og funktionel forhøjelse af intracellulær oxidativ stress selv under kemoterapeutisk behandling.

(A-D) AGS KD-celler blev forbehandlet i 16 timer med forskellige koncentrationer af NADPH oxidase hæmmere diphenyleneiodonium (DPI) eller apocynin. Proliferation af DPI-forbehandlet (A) eller apocynin-forbehandlet (B) AGS KD-celler 24 timer efter behandling med 10 ug /ml 5-FU under normoxiske betingelser (***,

P

0,001). Celleantal er vist som procent af ubehandlede celler. (C og D) Effekten af ​​DPI (C) og apocynin (D) på p53 og p21 proteinniveauer blev bestemt ved immunoblotanalyse ved anvendelse af hele celleekstrakter af AGS KD celler behandlet i 24 timer med 10 ug /ml 5-FU. (E) Foreslået model for HIF-1-afhængig regulering af kemosensitivitet af ROS-induceret modulering af p53. (Venstre felt) Kemoterapiinduceret respons i HIF-1-kompetente celler. HIF-1 modvirker dannelsen af ​​ROS på det mitokondrielle niveau. Nedsat ROS-niveauer igen aftage aktivering af p53 og muliggøre cellecyklusprogression trods kemoterapi. Derfor HIF-1-kompetente celler udviser en mere kemoterapi fænotype. Ub, ubiquitin; P, phosphat. (Højre panel) Kemoterapiinduceret respons i HIF-1-deficiente celler. Inaktivering af HIF-1 fører til accelereret mitokondrie ROS-generering. ROS er potente inducere af p53 og dermed øge aktivering af p53 ved kemoterapeutiske midler. P53 til gengæld transaktiverer-blandt andre – cyclinafhængige kinase (CDK) inhibitor p21 og inhiberer NF-KB-aktivitet. Den kombinerede aktivering af p53 og hæmning af NF-KB, resultere i apoptose og /eller ældning af HIF-1-mangel celler og dermed en mere chemosensitive fænotype.

Diskussion

transkriptionsfaktor HIF-1α er blevet etableret som vigtig mediator af hypoxi-medieret kemoresistens [6] – [8], [17], [18], [20]. Her identificerer vi HIF-1α som en stærk determinant for kemosensitivitet i gastriske cancerceller under normoxiske betingelser. Ved at anvende et lentivirus-baserede siRNA system, vi viser signifikant forbedret 5-FU og cisplatin toksicitet i HIF-1a-deficiente gastriske cancerceller. Tilgængelige data om betydningen af ​​HIF-1α til kemosensitivitet af kræftceller under normoxiske betingelser er modstridende. Mens HIF-1a-mangelfulde fibrosarcomceller (HT1080), der vises signifikant forøget følsomhed over for etoposid under omgivende luft, tyktarmskræft (HCT116) og hepatoma (Hepa-1) celler undladt at gøre det [6]. Unruh

et al.

Rapporterede øget modtagelighed af HIF-1a-deficiente murine embryonale fibroblaster til carboplatin eller etoposid under normoxiske samt hypoxiske betingelser [8]. Med hensyn til gastrisk cancer, blev forbedret effekt af 5-FU og vincristin påvist under normoxi

in vitro

[18]. Godt i tråd med vores resultater, konkluderede begge undersøgelser en central rolle for HIF-1α i mediering kemoresistens under normoxiske betingelser. Interessant, en nylig undersøgelse fra Japan viste lavere effekt af 5-FU-baseret kemoterapi i HIF-1α-udtrykker humane gastriske adenokarcinomer, styrke opfattelsen af ​​HIF-1 som en afgørende faktor i bestemmelsen af ​​mavekræft kemoresistens [31].

Kontrol af cancer progression af kemoterapi afhænger i det mindste delvis på induktion af cellulær ældning. For nylig, tab af HIF-1α blev vist at forårsage for tidlig ældning af immortaliserede murine embryonale fibroblaster under normoxiske betingelser [32]. Vores nuværende data tyder på, at HIF-1α tilsvarende vagter mavekræft celler mod kemoterapi-induceret aldring under normoxiske betingelser. Dette udgør den første rapport af forhøjet kemoterapi-induceret aldring via funktionel inaktivering af HIF-1α i en etableret human cancer cellelinje. I HIF-1a-deficiente celler, vi også observeret forbedret apoptose induktion i respons til 5-FU. Tidligere undersøgelser rapporteret en reaktivering af proapoptotiske faktor Bud [6], eller en ændring i balancen i pro- og anti-apoptotiske Bcl-2 familiemedlemmer til at redegøre for øget apoptose satser efter inaktivering af HIF-1α i lægemiddelbehandlede gastrisk cancerceller [ ,,,0],. 18]

Vores nuværende undersøgelse identificerer en ny mekanisme, hvorved HIF-1α modvirker både kemoterapi-induceret aldring og apoptose: Vi præsenterer afgørende bevis for kapaciteten af ​​HIF-1α at undertrykke induktion af tumor suppressor p53 som svar på 5-FU under normoxiske betingelser. P53 er en central celle skæbne determinant på grund af sin rolle i reguleringen af ​​cellecyklus-progression og apoptose som reaktion på cellulært stress og udgør det mest almindeligt muterede gen i human cancer [33]. En lang række kemoterapeutiske midler viste sig at stabilisere p53 og omvendt, tab af p53 udgør et princip mekanisme for kræft resistens overfor kemoterapi [33], [34]. Interaktionen af ​​p53 og HIF-1α har været genstand for langvarige diskussioner som både positive og negative rapporter er blevet offentliggjort [35]. Men hele tidligere offentliggjorte arbejde fokuseret på p53-HIF-1a-interaktioner under hypoxiske (eller endog anoxisk) betingelser. Så vidt vi ved, vores eksperimenter for første gang fremlægge dokumentation for undertrykkelse af p53 aktivitet ved HIF-1α under normoxiske betingelser. Som konsekvens af p53 opregulering i HIF-1a-mangelfuld celler, vi observerede ændringer i nedstrømseffektorer der er knyttet til den irreversible cellecyklusstop karakteristisk for ældning, f.eks stabilisering og hypophosphorylering af pRb p21. Forskellig fra vores observation, gjorde seneste arbejde på kemoresistens mod etoposid i HIF-1α-mangelfulde udødeliggjort murine embryonale fibroblaster ikke observere en induktion af p21 [36]. Også HIF-1α stabiliseret p21 og p27 samt ført til hypophosphorylering af pRb under hypoxi-induceret vækst anholdelse af udødeliggjort murine embryonale fibroblaster og primære milt B-lymfocytter [37]. Disse modsatrettede resultater er sandsynligvis forklares ved de undersøgte celletyper: Mens Goda

et al

. kendetegnet et fysiologisk respons på hypoksi i ikke-transformerede celletyper, vi analyserede opfølgningen alvorlige DNA beskadigelse i etablerede cancercellelinier.

Mens p53 blev gentagne gange vist sig at modvirke NF-KB-funktion [38], [39 ], vores nuværende data viser en rolle for tumor suppressor i reguleringen af ​​HIF-1α-afhængig NF-KB-aktivering. Bortset fra p53, har NF-KB dukket op som en anden, central determinant for resistens overfor kemoterapeutiske midler [40]. Flere forskellige undersøgelser har fastslået, funktionelle forbindelser mellem NF-KB og HIF-1α, selvom de variabelt placere HIF-1α enten opstrøms for NF-KB eller omvendt. For eksempel hypoxi-induceret stabilisering af HIF-1α i glatte muskelceller er under transkriptionel kontrol af NF-KB [41]. Tilsvarende resultater opnået fra betingede IKK-p-knockout-mus bekræftede den centrale rolle af NF-KB ved styring basal og hypoxi-induceret ekspression af HIF-1α

in vivo

[42]. Omvendt blev genekspression af NF-KB-underenhed p65 påvist at være kontrolleret af HIF-1α i forbindelse med hypoxi-undertrykt apoptose af neutrofiler [43]. Vores fund af markant reduceret NF-KB-aktivitet i HIF-1a-mangelfulde celler efter behandling med 5-FU er derfor godt i tråd med denne sidstnævnte rapport. Interessant vi også observeret signifikant reduceret DNA binding af NF-KB-underenheder i HIF-1α-deficiente celler efter stimulering med TNFa, en veletableret inducer af NF-KB-aktivitet [44]. Dette rejser relevante spørgsmål hvorunder fysiologiske og patofysiologiske tilstande HIF-1α er i stand til at regulere NF-KB-aktivering. HIF-1α og NF-KB deler afgørende betydning for forskellige processer såsom inflammation, mikrobiel drab og tumorigenese. Den nøjagtige molekylære natur samt hierarkiet af deres interaktion er sandsynligvis celle- og kontekstafhængig og kan ikke generaliseres.

I den aktuelle undersøgelse var vi i stand til at lokalisere ROS som et skæringspunkt for HIF- 1a med p53-medieret cellulær stress respons på kemoterapi. Intracellulær ROS er kendt som potente inducere af p53 og deltage i aktiveringen af ​​p53 ved kemoterapeutiske lægemidler [45]. Mitokondrier repræsenterer den primære kilde til intracellulær ROS [46], og HIF-1α sandsynligvis modvirker ROS produktionen på mitokondrie-niveau via flere mekanismer, herunder hæmning af mitokondrie biogenese og pyruvat pendulfart ind mitokondrierne, reduktion af mitokondrie aktivitet på grund af forøget udnyttelse af glykolyse og aktivering af mitokondrie autofagi [29], [30], [47], [48]. Tidligere etablerede vi en funktionel sammenhæng mellem HIF-1α-kontrolleret reduktion af ROS og forankring uafhængighed af gastriske cancerceller [22], implicerer HIF-1α i patogenesen af ​​mavekræft i fravær af hypoxi. Finder vi nu, at capacitiy af HIF-1α at begrænse ROS produktion af gastrisk cancerceller også giver resistens over for kemoterapeutiske midler, der fungerer via aktivering af p53 (figur 6E). Interessant er også rapporteret stigende virkning på terapi resistens via modulering af p53 og ROS for HIF-2α [49]. HIF-a isoformer 1 og 2 viser et bredt overlap i formodede HIF-mål og binding til hypoksiske responselementer og endelig fordeling af hypoxi-inducerede effekter til enten isoform er ikke altid accomplishable [50]. Bertout

et al.

Påvist, at inhibering af HIF-2α øger stråling-induceret apoptose via ROS akkumulering og efterfølgende forøgelse af p53-aktivitet [49]. Desuden Roberts

et al.

Viste, at modstanden mod kemoterapi delvist medieres af HIF-2α-medieret suppression af p53 i renale celle carcinom-celler [51]. Derfor de hermed rapporteret observationer garanterer undersøgelser af potentielle rolle HIF-2α, en opgave, som er i gang i vores laboratorium.

På baggrund af den kliniske behov for at identificere respons prædiktorer efter tilgængelige behandlingsmuligheder, vores