PLoS ONE: Effekter af Metformin på CD133 + Kolorektal Cancer Cells i Diabetic Patients

Abstrakt

I diabetespatienter kompliceret med kolorektal cancer (CRC), metformin behandling blev rapporteret at have forskellige korrelation med CRC-dødelighed. I laboratorieundersøgelser, blev metformin rapporteret at påvirke overlevelsen af ​​kræft stamceller (CSCS) i bryst og pancreascancer og glioblastom. Selvom CSCS spiller en kritisk rolle i modstanden mod 5-fluoruracil (5-FU) kemoterapi i CRC patienter, virkningen af ​​metformin på CSCS i CRC patienter og den synergistiske virkning af metformin i kombination med 5-FU på CSCS rapporteres ikke. I den foreliggende undersøgelse blev udført patologiske undersøgelser i 86 CRC patienter kompliceret med type 2 DM, som var blevet opdelt i en metformin gruppe og en ikke-metformin gruppe. Sammenligninger med hensyn patologisk type, forekomst af metastase, ekspression af CD133 og β-catenin blev udført mellem de to grupper. Vi udforskede synergistiske virkninger af metformin i kombination med 5-FU på spredning, cellecyklus, apoptose og andelen af ​​CD133 + CSCS af SW620 humane kolorektale cancer cellelinjer. Resultaterne viser, at metformin behandling havde omvendte korrelationer med andelen af ​​patienter med dårligt differentieret adenocarcinom, at andelen af ​​CD133 + CSCS i CRC patienter med type 2 DM. Metformin forbedrede de antiproliferative virkninger af 5-FU på CD133 + CSCS i SW620-celler. Disse resultater giver et vigtigt supplement til tidligere undersøgelse. Hæmning af spredningen af ​​CD133 + CSCS kan være en potentiel mekanisme ansvarlig for sammenslutningen af ​​metformin brug med forbedrede CRC resultater i CRC patienter med type 2-diabetes

Henvisning:. Zhang Y, Guan M, Zheng Z, Zhang Q Gao F, Xue Y (2013) Virkninger af Metformin på CD133 + Kolorektal Cancer Cells hos diabetespatienter. PLoS ONE 8 (11): e81264. doi: 10,1371 /journal.pone.0081264

Redaktør: Chunming Liu, University of Kentucky, USA

Modtaget: Juli 19, 2013; Accepteret: 2 oktober 2013; Udgivet: November 21, 2013 |

Copyright: © 2013 Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af en bevilling fra provinsen Industrial Technology Research andDevelopment Projects, NO. (2010) 207 og Forskningsfonden Guangdong Pharmaceutical Association for medicin af type 2 diabetes, NO. 2012C07, Guangdong, Kina. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

forvaltning af diabetespatienter kompliceret med kolorektal cancer (CRC) er en stor udfordring for klinikere. Epidemiologiske undersøgelser har vist, at diabetes mellitus (DM) er nært beslægtet med forekomsten af ​​cancere, især gastrointestinal malignitet [1,2]. En meta-analyse af 15 undersøgelser med i alt over 2,5 millioner mennesker, viste, at diabetes var forbundet med en 30% øget risiko for CRC [3]. Desuden er diabetes signifikant associeret med øget samlet og CRC-dødelighed [4,5] mens metformin (1,1-dimethyl-biguanid-hydrochlorid), de mest ordinerede orale antidiabetika for type 2 DM [6,7], kan faldet kræftrisiko og CRC-dødelighed hos diabetikere [8]. Akkumuleret beviser tyder på, at metformin kan være et potentielt lægemiddel til chemoforebyggelse af CRC hos diabetespatienter. I vores tidligere undersøgelse, metformin hæmmer væksten af ​​SW-480 celler inkuberet med eller uden fremskreden glycosylering slutprodukter (AGEs) og nedregulerer ekspressionen af ​​cyclin D1 og telomeraseaktivitet [9,10]. De antineoplastiske virkninger af metformin er blevet rapporteret at være associeret med aktivering af AMP-aktiveret protein kinase (AMPK) signalvejen, forbedring af insulinresistens og hyperinsulinæmi [11,12].

Senest har en anden antineoplastisk fordel ved metformin blev rapporteret. Det kan hæmme overlevelsen af ​​kræft stamceller (CSCS, tumor-initierende stamceller-lignende celler: TISCs) i brystet, og pancreascancer og glioblastom in vitro [13,14]. Som CSCS besidder potentialet til at initiere og opretholde tumorvækst og metastase, de er ansvarlige for resistens mod kemoterapi og gentagelse af kræft, hvor Wnt /β-catenin signalvejen kan være involveret [15,16]. CD133-positive (CD133 +) celler adskilt fra CRC udviser egenskaber CSCS, ligesom selvfornyelse og høj tumorigent potentiale. I brystkræft, er CD133 blevet rapporteret som en nyttig markør til at forudsige effektiviteten af ​​kemoterapi og tilbagefald [17]. Lignende roller CD133 er også blevet identificeret i CRC. Den høje andel af CD133 + celler var stærkt korreleret med dårlig samlet overlevelse (OS) i CRC patienter [18]. Men der er ingen forskning i sammenhængen mellem metformin behandling og andelen af ​​CD133 + CSCS i CRC patienter.

Hvad mere er, er der ingen forskning enten i den sammenhæng mellem metformin behandling og 5-fluorouracil (5-FU) kemoterapi. Metformin er for nylig blevet rapporteret at have en synergistisk effekt i kombination med nogle kemoterapi [19,20]. 5-FU, en first-line kemoterapeutisk lægemiddel til CRC patienter, anvendes sædvanligvis i kombination med andre kemoterapeutiske lægemidler, der kan forbedre den terapeutiske effektivitet, da resistens mod 5-FU sandsynligvis forekommer i avancerede CRC patienter og ofte fører til svigt af kemoterapi [ ,,,0],21]. Derfor skal det undersøges, om metformin kan anvendes i kombination med 5-FU at øge den antiproliferative virkning af 5-FU på CRC. I betragtning af den vigtige rolle, som CSCS i tumor progression vi hypotese, at den positive rolle metformin i CRC kan være delvist bidraget til dens antiproliferative effekt på kolorektale CSCS.

For at klarlægge, hvordan metformin påvirker patogenese og patologisk progression af CRC med type 2 DM, vi undersøgte sammenslutninger af metformin med den patologiske type og forekomsten af ​​metastaser af CRC hos diabetespatienter kompliceret med CRC og antiproliferative effekt af metformin på kolorektale CSCS (CD133 +) samt. For at forstå, hvordan metformin synergistisk med 5-FU at påvirker cellulære adfærd CRC, vi undersøgte synergistiske virkninger af metformin på ekspressionen af ​​CD133 + celler i kombination med 5-FU in vitro.

Materialer og metoder

Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité af Nanfang Hospital, Southern Medical University.

den etiske udvalg Nanfang Hospital frafaldes behovet for patienternes samtykke, da prøverne blev indkøbt fra vævsbanken af afdelingen for patologi, Nanfang Hospital, Southern Medical University.

1.1.1 patienter og studiedesign

i alt 187 type 2 diabetespatienter undergik resektion af CRC på Nanfang Hospital, Southern Medical University i Guangzhou, Kina mellem januar 2010 og juni 2012. De medicinske registreringer af disse patienter blev hentet til epidemiologiske undersøgelser af deres demografi og kliniske karakteristika. Anvendelse af andre diabetisk medicin (sulfonylurinstoffer, thiazolidindioner, a-glucosidaseinhibitorer, insulin, og så videre) blev også undersøgt. Den mediane alder var 64 år gamle (fra 29 til 87 år gamle) og 119 (63,64%) af patienterne var over 60 år gammel. 88 (47,06%) af patienterne havde nydiagnosticeret type 2 DM. Varigheden af ​​DM mindre end 5 år, og mere end 5 år tegnede sig for 26,74% (50/187) og 22,99% (43/187) hhv. De andre (6/187, 3,21%) havde ingen klare oplysninger om varigheden af ​​DM. Endelig blev 86 patienter med fuldstændige medicinske journaler indskrevet i denne undersøgelse og blev inddelt i to grupper efter anvendelse af metformin. I metformingruppen var der 36 patienter, der havde anvendt konsekvent metformin før CRC diagnose og i den ikke-metformin gruppe der var 50 patienter. Patologiske prøver af 37 patienter, der havde gennemgået hverken kemoterapi eller strålebehandling før resektion af CRC blev hentet til immunhistokemisk undersøgelse af udtryk for CD133 og β-catenin.

De to grupper blev sammenlignet med hensyn til demografi, kliniske karakteristika og laboratoriefund. Patient demografi og kliniske karakteristika inkluderet alder ved diagnose, køn, varighed af diabetes, body mass index (BMI), systolisk /diastolisk blodtryk (SBP /DBP). Laboratorieresultater inkluderet fastende plasma glucose (FPG), hæmoglobin A1c (HbA1c), blod urin nitrogen (BUN), kreatinin (CR), triglycerider (TG), total cholesterol (T-Chol), low-density lipoprotein kolesterol (LDL), meget lav densitet lipoprotein cholesterol (VLDL) og high-density lipoprotein kolesterol (HDL), samt oplysninger om den CRC diagnose, herunder histologi, differentiering og metastase. Datoen for CRC diagnose blev defineret som den dag, konkret patologisk diagnose.

1.1.2 Immunohistokemiske Eksaminer

Vævsprøver fra hver patient af de 37 patienter blev fikseret i formalin og indstøbt i paraffin. Dernæst paraffinsnit blev deparaffineret før, de blev opvarmet i 20 minutter ved 105 ° C i antigen-genvinding puffer (Jinqiao Zhongshan BioTech, Beijing, Kina). Efter blokering med 10% gedeserum blev objektglassene inkuberet med primære monoklonale antistoffer henholdsvis mod CD133 (BIOS, Kina, fortynding 1: 150) og β-catenin (Cell Signaling Technology, USA, fortynding 1: 200) natten over ved 4 ° C efterfulgt af peberrodsperoxidase-mærket sekundære antistoffer i 1 time ved stuetemperatur. Og så blev pladerne udviklet med diaminoben-Zidine tetrahydrochlorid (DAB), og modfarvet med hæmatoxylin.

1.1.3 immunhistokemisk Assessment

For hvert dias, mindst 5 felter (inde i tumor) og 500 celler blev analyseret med høj effekt (× 400 forstørrelse) mikroskopi af to patologer. Prøver blev defineret som positive for CD133 ekspression, hvis tumorceller tydeligt blev farvet af anti-CD133-antistoffer. Resultaterne blev klassificeret i to niveauer: 10% og ≥10% CD133-positive celler.

udtrykkene for β-catenin på cellemembranen og i cytoplasmaet og kerner blev registreret. A 70% ekspression af β-catenin på cellemembranen blev anset for normalt, registreres som negativ (-), medens a 10% ekspression af β-catenin i cytoplasmaet og kerner blev som unormalt, registreres som positive (+ ).

1.2.1 Cellelinier og cellekultur betingelser Salg

Den humane kolorektal cancer cellelinje SW620 blev opnået fra ATCC (USA) og opretholdt i RPMI-1640-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS; PPA, Østrig) i en fugtig atmosfære med 5% CO2 ved 37 ° C. 5-FU og metformin blev indkøbt fra Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA. For at vurdere virkningerne af metformin kombineret med 5-FU, blev cellerne behandlet med eller uden metformin (5 mM) i 24 timer og derefter vasket med PBS, derefter behandlet med 5-FU (5μΜ) for en anden 48h.

1.2.2 celleproliferationsassays

SW620-celler blev podet i plader med 96 brønde før behandling med eller uden metformin efterfulgt af 5-FU i 24, 48 og 72 timer henholdsvis. Celleproliferation blev målt med 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT; 5 mg /ml; Sigma, MO, USA) assay. Efter passende behandling tidsrum blev MTT tilsat til en slutkoncentration på 1 mg /ml, og reaktionsblandingen blev inkuberet i 3 timer ved 37 ° C. De resulterende krystaller blev opløst i 0,04% HCI i isopropanol, og absorbansen blev aflæst ved 562 nm. Hver behandling blev udført tre gange, og hvert eksperiment blev gentaget to gange.

1.2.3 cellecyklus analyser

SW620 celler blev forbehandlet med metformin i 24 timer eller ej, og derefter behandlet med 5-FU i 48 timer. Celler blev høstet ved en eksponentiel vækstfase, og encellede suspensioner indeholdende 1×106 celler blev fikseret med 70% alkohol. Celle cyklus blev overvåget ved anvendelse af propidiumiodid (PI) farvning af kerner. Fluorescensen af ​​DNA-bundne PI i celler blev målt med et flow-cytometri (BD Biosciences). Resultaterne blev analyseret med ModFit 3.0 software (Verity Software House, Topsham, ME). Eksperimentet blev udført tre gange. Forholdet af celler i G0 /G1, intra-S, og G2 /M-faser blev udtrykt som middelværdi ± SD.

1.2.4 Vurdering af apoptose

Apoptose blev påvist ved flowcytometri via undersøgelse af det ændrede plasmamembranen phospholipid pakning af lipofile farvestof Annexin V. Kort fortalt blev behandlede celler høstet og vasket to gange med PBS før resuspenderet ved en koncentration på 1 × 106 celler /ml i bindingsbuffer i overensstemmelse med producentens instruktioner (AnnexinV: FITC apoptose Detection Kit, BD Pharmingen, CA, USA). Derefter blev 5 pi Annexin V-FITC og 5 pi propidiumiodid (PI) tilsat til 100 pi cellesuspension og inkuberet i 15 minutter ved stuetemperatur i mørke. Efter tilsætning af 400 pi bindingspuffer blev mærkede celler tælles inden for 30 min ved FACS Calibur flowcytometer (Becton-Dickinson, Mountain View, Californien). Tidlige apoptose celler (Annexin V-positive, PI-negative), nekrotiske /sen apoptose celler (dobbelt positive), samt levende celler (dobbelt negativ) blev målt før efterfølgende analyse af Cell Quest-software (Becton-Dickinson).

1.2.5 Påvisning af CD133-positive celler

Efter SW620-celler blev fremstillet og behandlet som beskrevet, blev tumorcellerne opsamlet og farvet med anti-CD133-antistof (monoklonalt muse-IgG, 1: 10 , Milteny Biotec) eller IgG1 isotypekontrolantistof (Milteny Biotec) i 30 minutter i mørke ved 2-8 ° C. CD133-farvning blev analyseret ved flowcytometri (Becton Dickinson, San Jose, CA). Forsøgene blev udført in triplo. Forholdet mellem CD133 + celler blev udtrykt som middelværdi ± SD.

1.3 Statistisk analyse

Data blev præsenteret som den gennemsnitlige + Standardafvigelse (SD) og analyseret ved hjælp af SPSS v.16.0 statistisk software (Abbott Laboratories, North Chicago, IL). Envejs variansanalyse (ANOVA) og derefter uparret Students

t

-test blev anvendt til at bestemme virkningerne af forskellige variabler. Foreningerne mellem udtryk for CD133 og β-catenin og klinisk-patologiske parametre blev analyseret med brug af Pearsons chi-square (χ

2) test og Fishers eksakte test.

P Drømmeholdet værdi mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

2.1.1 Patientdemografi og kliniske karakteristika

Patientdemografi og kliniske karakteristika er opsummeret i tabel 1. Der var ingen signifikante forskelle mellem metformin og ikke-metformingruppen vedrørende alder ved diagnose, blodtryk, BMI, varighed af diabetes, FPG, HbA1c, BUN, CR, ALB, TG, T-Chol, HDL eller VLDL-niveauer ved baseline, men LDL niveauet var signifikant lavere i metformin-gruppen end i den ikke-metformin (p = 0,024). Som for de patologiske egenskaber mellem de to grupper, var andelen af ​​patienter med dårligt differentieret adenocarcinom i metformin-gruppen var signifikant lavere end i den ikke-metformin-gruppen (2,78% vs. 16,0%, p = 0,048). Endvidere fjernmetastase sats i metformin-gruppen var signifikant lavere end i den ikke-metformin-gruppen (5,60% vs. 21,6%, p = 0,035). Imidlertid blev der ikke observeret nogen signifikant forskel mellem de to grupper i lymfeknude metastaser (tabel 2).

Metformin (n = 36)

Non-metformin (n = 50)

p

Alder ved diagnose (år) 66,19 ± 9.8863.22 ± 9.940.725DM varighed (år) 4,99 ± 3.685.75 ± 4.700.334BMI (kg /m

2) 22,39 ± 3.4125.09 ± 3.450.894SBP ( mmHg) 144,72 ± 21.82137.66 ± 19.230.199DBP (mmHg) 80,11 ± 9.7277.98 ± 17.720.306BUN (mmol /l) 6,92 ± 9.836.42 ± 3.780.430CR (mmol /l) 92,61 ± 69.2197.94 ± 108,490. 253ALB (g /l) 34,96 ± 6.9333.71 ± 5.760.063FBG (mmol /l) 8,63 ± 2.099.27 ± 2.950.080HbA1c (%) 6,78 ± 1.067.61 ± 1.990.083TG (mmol /l) 1,75 ± 1,282. 51 ± 3.070.132T-Chol (mmol /l) 4,44 ± 0.835.42 ± 4.260.173HDL (mmol /l) 1,25 ± 0.251.27 ± 0.850.203LDL (mmol /l) 2,27 ± 0.522.41 ± 1.070.024VLDL ( mmol /l) 0,88 ± 0.490.95 ± 0.540.741Table 1. Patientdemografi og kliniske karakteristika ved baseline.

CSV Hent CSV

metformin (n = 36)

Non-metformin gruppe ( n = 50)

p

Patologisk characteristicsWell differentieret adenocarcinoma12 (33,33%) 13 (26,0%) 0.460moderately differentieret adenocarcinoma21 (58,33%) 22 (44,0%) 0.190poorly differentieret adenocarcinoma1 (2,78%) 8 (16,0%) 0.048mucinous adenocarcinoma2 (5,56%,) 6 (12,0%,) 0.310signet ring celle carcinoma01 (2,0%,) Metastasislymph node7 (19,44%) 14 (28,0%) 0.257distant2 (5,60%) 11 (21,6%) 0.035Table 2. patologiske karakteristika og metastaser i to grupper.

CSV Hent CSV

2.1.2 udtryk for CD133 og β-catenin i CRC prøver

Immunohistokemiske mønstre af CD133 og β-catenin udtryk blev analyseret i CRC prøver . CD133 brunlige signaler blev observeret på cellemembranen, især på dets luminale og basale overflade. Generelt højere farvningsintensitet af CD133 indikerer højere procentdel af CD133 + tumorceller (figur 1, felt 1). I metformingruppen, 15 af de 19 CRC prøver (78,9%) indeholdt mindre end 10% CD133-positive tumorceller, mens de andre 4 (21,1%) indeholdt mere end 10% CD133-positive tumorceller. Selvom halvdelen af ​​CRC prøver (9/18, 50,0%) i den ikke-metformin gruppe indeholdt mere end 10% CD133-positive tumorceller,

forskellen mellem de to grupper nåede ikke et signifikant niveau

(

p = 0,065

). (Tabel 3)

(A): svagt positiv eller fokalt positiv farvning i 10% af cellerne; (B): moderat eller stærkt positiv-farvning involverer 10% eller flere af cellerne; (C) og (D): farvningen af ​​CD133 på den luminale overflade og den basale overflade af cancerceller. Panel 2: (A): cytoplasmatisk eller nukleær ekspression af β-catenin var til stede; (B): nuklear ekspression af β-catenin var mindre end 10% af cancercellerne; (C) og (D):. Udbredt nukleare ophobning af β-catenin

Positiv udtryk

*

Metformin (n = 19)

Non-metformin (n = 18)

p-værdi

CD1334 (21,1%) 9 (50,0%) 0.065β-catenin7 (36,8%) 13 (72,2%) 0.031Table 3. udtryk for CD133 og β-catenin i to grupper.

* større end eller lig med 10% ekspression af CD133 i cellerne blev registreret som positiv; 10% ekspression af β-catenin i cytoplasmaet og kerner blev registreret som positive. CSV download CSV

Ekspression af β-catenin var helt tydelig på de celle-celle grænser og cytoplasmaet i et flertal af CRC prøver, mens der i nogle af cellerne blev observeret nukleare akkumulering af β-catenin-protein (figur 1, felt 2 ). Der var en signifikant forskel mellem de to grupper i den positive rate af β-catenin-proteinekspression (p = 0,031). Den cellekerneakkumulering på β-catenin i mere end 10% af tumorcellerne var signifikant lavere i metformingruppen end i den ikke-metformin-gruppen (7/19, 36,8% vs. 13/18, 72,2%; p = 0,031) . (Tabel 3)

Der er en signifikant positiv sammenhæng mellem CD133 og β-catenin udtryk (p = 0,028).

Udtrykket af CD133 er korreleret med den patologiske type CRC, men de nåede ikke et signifikant niveau (p = 0,056

). Der er ikke nogen signifikant korrelation mellem β-catenin og den patologiske type CRC (p = 0,335).

2.2.1 antiproliferativ virkning af 5-FU alene og i kombination med metformin på SW620-celler

In vitro blev SW620 celler behandlet med henholdsvis 5-FU alene og med en kombination af 5-FU og metformin. Spredningen af ​​SW620 celler i begge grupper steg med tiden at udvide. Vi observerede, at metformin forbehandling efterfulgt af 5-FU behandling signifikant inhiberede proliferationen af ​​SW620-celler i sammenligning med behandlingen af ​​5-FU alene (1,019 ± 0,181 vs. 1,218 ± 0,090, p = 0,058 i 24 timer eksponering; 1,075 ± 0,118 vs. 1,644 ± 0,219, p = 0,001 i 48 timer eksponering; 1,299 ± 0,147 vs 1,786 ± 0,109, p 0,001 i 72 timer eksponering). (Figur 2A)

B: Andelen af ​​SW620-celler i enten G0 /G1 eller G2 /M fase blev ikke åbenbart ændret mellem de tre grupper (p = 0,06 og p = 0,248), men den metformin forbehandling reducerede signifikant andel af SW620-celler i S-fase (24,14 ± 6,01 versus 39,62 ± 0,88, P = 0,003). **, P. 0,01 for sammenligninger af MET + 5-FU behandling henholdsvis med 5-FU behandling og kontrol

2.2.2 Synergistisk effekt af metformin og 5-FU på cellen cyklus af SW620 celler

for at undersøge effekten af ​​metformin kombineret med 5-FU på cellecyklus, vi forbehandlet SW620 celler med metformin i 24 timer forud for 5-FU-behandling. Derefter blev andelene af SW620-celler i G0 /G1, S, og G2 /M-faser analyseres ved flowcytometri. Vi observerede, at der ikke var nogen signifikant forskel mellem de tre grupper i andelen af ​​SW620-celler i G0 /G1 eller G2 /M-fase (p 0,05), medens metformin forbehandling betydeligt reduceret, at i S-fase i forhold til 5-FU alone behandling (24,14 ± 6,01% vs. 39,62 ± 0,88%, p = 0,003) (Figur 2B).

2.2.3 Effekt af MET + 5-FU behandling på apoptose af SW620 celler

procentdelen af ​​apoptotiske celler var signifikant forhøjet ved metformin forbehandling efterfulgt af 5-FU behandling sammenlignet med 5-FU alene behandling (Tidlig apoptose rate: 3,50 ± 0,44% vs. 2,33 ± 0,38%, p = 0,029; Late apoptose rate: 11,80 ± 4,15% vs. 5,30 ± 2,10%, p 0,001) (figur 3A).

*, p 0,05 og ***, s 0,001 for sammenligninger mellem MET + 5-FU-gruppen og alene 5-FU-gruppen. B: Andelen af ​​CD133 + -celler blev signifikant reduceret med MET + 5-FU behandling sammenlignet med 5-FU alene behandling (15.13 ± 3.43 vs 21.30 ± 1.40; p = 0,027). Værdier blev angivet som gennemsnit ± SD.

2.2.4 Virkninger af MET + 5-FU-behandling på andelen af ​​CD133 + -celler

Andelen af ​​CD133 + -celler blev bestemt ved flowcytometri. 27.63 ± 2,58% af SW620 celler udtrykte membranen antigen CD133 og både 5-FU alene og MET + 5-FU-behandlinger faldt betydeligt andelen af ​​CD133-positive celler. Endvidere metformin forbehandling i 24 timer efterfulgt af 5-FU behandling i 48 timer betydeligt forstærket den inhiberende virkning af 5-FU alene behandling af andelen af ​​CD133-positive celler (15.13 ± 3.43 vs 21.30 ± 1.40; p = 0,027) (figur 3B).

Diskussion

I CRC patienter kompliceret med type 2-diabetes, viste denne undersøgelse, at den fjernmetastaser sats i metformin-gruppen var signifikant lavere end i den ikke-metformin-gruppen (5,60% vs. 21,6%, p = 0,035) og andelen af ​​patienter med dårligt differentieret adenocarcinom var signifikant mindre i metformingruppen end i den ikke-metformin-gruppen (2,78% vs. 16,0%, p = 0,048). Disse resultater viser en anden fordel af metformin i CRC patienter. I det seneste årti, epidemiologiske undersøgelser og store, randomiserede kontrollerede forsøg (RCT), såsom vedtage (A Diabetes Outcome Progression Trial) og RECORD (Rosiglitazon evalueret for Kardiovaskulære Resultater og Regulering af glykæmi i Diabetes), har foreslået en omvendt sammenhæng mellem metformin bruge og cancer risiko, især risikoen for kolorektale cancere (CRC), i sammenligning med andre antidiabetiske behandling [22,23]. Metformin behandling resulterede i en reduceret risiko for total dødelighed og CRC-dødelighed i CRC patienter med diabetes [24]. Et prospektivt randomiseret undersøgelse viste, at metformin behandling reducerede antallet af rektal kryptfoci (ACF), en endoskopisk surrogatmarkør for CRC, hos patienter uden diabetes [25]. I flere cancer cellelinjer og dyremodeller, metformin behandling udøver antiinvasive og antimetastasis effekter [26-29]. Men kun få undersøgelser rettet korrelationerne af metformin behandling med cancer metastaser og med den patologiske type kræft i humane populationer. Nærværende undersøgelse er en tentativ forsøg af vores til at udforske disse spørgsmål. Styrken af ​​denne forskning er vores patologiske observation af en undergruppe af CRC patienter med samtidig type 2-diabetes, der fik metformin behandling. Vi fandt solid patologiske dokumentation en bemærkelsesværdig sammenslutning af metformin med forbedrede resultater i sådanne patienter, der udløste vores videre undersøgelse i nogle af de mekanismer, der ligger til grund foreningen.

I vores tidligere undersøgelse blev proliferationen af ​​SW480-celler signifikant inhiberet af metformin behandling på en dosis- og tidsafhængig måde, som kan skyldes den nedregulering af cyclin D1-ekspression og telomeraseaktivitet ved metformin [ ,,,0],9,10]. I den foreliggende undersøgelse viser vi, at metformin har synergistiske virkninger med 5-FU på proliferationen og cellecyklus af SW620-celler. Den betydelige vækst hæmmende og pro-apoptotiske virkninger af metformin på kræftceller sandsynligvis på grund af aktivering af LKB1 /AMPK og forbedring af insulinresistens [19,20,30]. Desuden har Ras /Raf /MAPK-vejen og reduktiv glutamin metabolisme også blevet rapporteret at spille en rolle i den anti-neoplastiske virkning metformin [19]. Senest metformin blev rapporteret at påvirke overlevelsen af ​​CSCS i flere cancer cellelinjer [13,14]. CSCS er blevet identificeret som terapeutiske mål for tumorprogression [31], fordi de spiller en vigtig rolle i tilblivelsen og fornyet tumorer, metastaser og resistens mod kemoterapi som et resultat af to kritiske egenskaber: selvfornyelse kapacitet og differentiere potentiale i ubegrænset heterogene populationer af kræftceller. Efterfølgende vi undersøgt effekten af ​​metformin behandling på de kolorektale CSCS i CRC patienter, ved hjælp af deres patologiske prøver. Vi fandt derfor en omvendt korrelation af metformin behandling med CD133 + CSCS i CRC patienter. CD133 er blevet menes at være den mest robuste overflade markør for kolorektale CSCS. Patienterne med CD133-høj ekspression syntes at have en meget lavere sats på 5-års OS og flere chancer for T3, 4 tumor invasion, positiv N og vaskulær invasion end dem med CD133-lavt udtryk [32].

Efter vores fund af sammenslutningen af ​​metformin behandling med andelen af ​​CD133 + CSCS i CRC af disse patienter, vi yderligere undersøgt den synergistiske effekt af metformin plus 5-FU behandling på andelen af ​​CD133 + celler og ekspression af β-catenin-protein i SW620-celler. Vi viste, at metformin i kombination med 5-FU faldt betydeligt både andelen af ​​CD133 + -celler og ekspressionen af ​​β-catenin-protein, hvilket indikerer metformin kan have en synergistisk antineoplastisk virkning på CRC ved inhibting spredning af CSCS via β-catenin pathway. En lignende antineoplastisk virkning af metformin er blevet rapporteret i brystcancer [20]. Selvom 5-FU er den mest almindelige kemoterapeutiske middel til behandling af CRC, modstanden mod dette stof er meget almindelig i kemoterapi af CRC patienter. Aktiveringen af ​​Wnt /β-catenin pathway i CD133 (+) colorektale CSCS kan være ansvarlig for modstanden af ​​kemoterapi i CRCs [15,16,33]. For nylig blev AMPK aktivatorer rapporteret at undertrykke cervikal vækst cancercelle ved at inhibere Wnt /β-catenin pathway [34]. Hæmning af Wnt /β-catenin vej af AMPK kan være ansvarlig for den synergistiske effekt af metformin i kombination med 5-FU om spredning af kolorektale CSCS. Det er bemærkelsesværdigt, at vi fandt den kombinerede behandling af metformin plus 5-FU havde en signifikant bedre antineoplastisk effekt end behandling af 5-FU alene, hvilket tyder på, at den kombinerede behandling kan være en potentiel standard kemoterapi for CRC patienter, især for dem, der er meget modstandsdygtig over for 5-FU. Selvfølgelig yderligere research, både kliniske forsøg og laboratorieforsøg, der er nødvendige for at kontrollere denne antagelse.

Som konklusion, vores undersøgelse bekræfter endvidere, at metformin er ikke kun en antidiabetika, men også en potentiel anticancer medicin. Vores resultater viser, reverse korrelationer af metformin behandling med forekomsten af ​​fjerne metastaser og dårligt differentieret adenocarcinom, den positive rate af CD133 og ekspressionen af ​​β-catenin-protein i CRC patienter med type 2 DM. Vi viser også de synergistiske virkninger af metformin i kombination med 5-FU på cellebiologi og andelen af ​​CD133 + -celler in vitro. Men den mekanisme af metformin forstyrrer udbredelsen af ​​CSCS forbliver underbestemte. I fremtiden er potentielle rcts forpligtet til at undersøge effekten af ​​metformin i kombination med 5-FU på prognosen for CRC patienterne og de underliggende mekanismer bør undersøges nærmere.

Tak

Vi vil gerne takke professor Yanqing Ding, direktør for Institut for Patologi, og Hongfen Shen, en tekniker på Cancer Research Institute, Southern Medical University, Guangzhou, Kina. Vi anerkender også de nyttige kommentarer og revisioner af dette manuskript af Prof. Ping Allen Liang.