PLoS ONE: Opposite rolle Kindlin-1 og Kindlin-2 i Lung Cancers

Abstrakt

Lungekræft er meget heterogen og består af forskellige undertyper, der er i forskellige differentierede etaper. De nyligt identificerede integrinpositive interagerende proteiner Kindlin-1 og Kindlin-2 er aktivatorer af transmembrane receptor integriner, der spiller en vigtig rolle i udviklingen af ​​kræft. I denne rapport præsenterer vi udtrykket profiler af Kindlin-1 og Kindlin-2 i lungekræft hjælp patientprøver og etablerede deres korrelation med lungekræft progression. Vi fandt, at Kindlin-1 blev udtrykt i epitel-afledte ikke-småcellet lungecancer, især i planocellulært lungecancer men udtrykkes ved lave niveauer i dårligt differentieret storcellet lungecancer. Imidlertid blev Kindlin-2 stærkt udtrykt i storcellet lungecancer. Både Kindlin-1 og Kindlin-2 blev fundet ikke udtrykkes eller udtrykkes ved meget lave niveauer i neuroendokrine-afledte småcellet lungekræft. Vigtigt er det, så er der Kindlin-1 ekspressionsniveau positivt korreleret med differentieringen af ​​pladecelle lungekræft. Overraskende fandt vi, at de meget homologe Kindlin familie proteiner, Kindlin-1 og Kindlin-2, der vises, modvirke funktionelle roller i lunge kræftceller. Ektopisk udtryk for Kindlin-1 i ikke-småcellet cancerceller hæmmede

in vitro

celle migration og

in vivo

tumorvækst, mens Kindlin-2 fremmet disse funktioner. Mekanistisk, Kindlin-1 forbudt epithelail til mesenkymale overgang i ikke-småcellet kræftceller, mens Kindlin-2 forstærket epithelail til mesenkymale overgang i disse celler. Tilsammen viste vi, at Kindlin-1 og Kindlin-2 forskelligt regulere lungekræft celle progression. Endvidere kan ekspressionsniveauerne af Kindlin-1 være potentielt anvendes som markør for lungekræft differentiering og målretning Kindlin-2 kan blokere den invasive vækst af storcellet lungecancer

Henvisning:. Zhan J., Zhu X, guo Y, Wang Y, Wang Y, Qiang G, et al. (2012) Modsat rolle Kindlin-1 og Kindlin-2 i lungekræft. PLoS ONE 7 (11): e50313. doi: 10,1371 /journal.pone.0050313

Redaktør: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Children ‘s Hospital Medical Center, USA

Modtaget: 11. juli, 2012; Accepteret: 18 oktober 2012; Udgivet: November 29, 2012 |

Copyright: © 2012 Zhan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (NSFC) nøgleprojekt 30.830.048, Ministeriet for Videnskab og Teknologi i Kina 2010CB912203 og 2010CB529402, NSFC31170711, den 111-projektet af Undervisningsministeriet og Beijing Natural Science Foundation 7.120.002 til HZ, og også af en bevilling til Staffan Strömblad fra center for Biosciences på Karolinska Institutet. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

lungekræft er en kompliceret sygdom, der kan histologisk klassificeres i småcellet lungecarcinom (SCLC), der udgør næsten 20% af lungekræft, og størstedelen er ikke-lille-celle lungecancer (NSCLC), som repræsenterer mere end 80% af lungecancer [1]. NSCLC omfatter pladecellecarcinom (SCC), adenocarcinom (AC), og storcellet carcinom (LCC) [2]. Meget differentierede, moderat differentierede og dårligt differentierede karcinomer kan ses i SCC og AC. Lungekræft er ganske heterogen i tumorvækst, invasion og metastase samt i resultaterne efter behandling. Lungekræft i forskellige differentiering status vises uoverensstemmelsen i malignitet, fx lavt-opdelte lunge karcinomer er mere ondartet end høj-opdelte kræftformer, som er hurtigt voksende og meget metastatisk.

Fermitin familiemedlem en (FERMT1) koder Kindlin -1 er en FERM (4,1-Ezrin-Radixin- moesin) -holdige protein, der tilhører Kindlin familie. Kindlins er integrin- interagerende proteiner, som regulerer integrin aktivering via interaktion med integrin β-underenheden cytoplasmatiske domæne [3], [4]. Kindlin-2 kodes af FERMT2 fandtes at styre en tovejs signalering via integrin [5]. Kindlin blev udpeget fra Kindler syndrom, der blev opfundet i 1954 fremhævede ved en kombination af epidermal atrofi, udvidede kapillærer og broget kutan pigmentering [6]. Mutationer af Kindlin-1 var blevet identificeret som årsag til Kindler syndrom [7], [8]. Indtil for nylig Kindlin familiemedlem er blevet forbundet til progression af tumorer [9]. Kindlin-2 er blevet vist at blive udtrykt i malignt mesotheliom og regulerer adhæsion og migration [10], og ekspressionsniveauet af Kindlin-2 er relateret til følsomheden af ​​prostatacancerceller for cisplatin-induceret celledød [11]. Kindlin-2-ekspression blev fundet korreleret med tumorinvasion, lymfeknudemetastase, og patient resultat i gastrisk cancer [12]. Kindlin-1 er fundet overudtrykt i 60% af lungekræft og 70% af coloncancer som undersøgt ved RNA ekspressionsniveauer ud af ti patienter [9]. For ganske nylig Sin et al viste, at Kindlin-1 spiller en rolle i væksten af ​​brystkræft og lunge metastase [13]. Udover ekspression i tumorceller, blev Kindlin-2 også fundet at være højt udtrykt i tumoren stroma i blære kræft [14]. Men mens Kindlin-1 og Kindlin-2 er relateret til cancer progression, Kindlin-3 er medvirkende i de hæmatopoietiske lidelser [15] – [19]. Kindlin-2 udtrykt bredt i endotel og vesikulær glatte muskulatur [3], [20], og er en vigtig del af interkalerede diske, der er nødvendig for hvirveldyr hjertefunktion struktur og funktion [21]. Men hidtil lidt om roller Kindlin-1 og Kindlin-2 i lungekræft progression.

I denne undersøgelse vil vi besvare det første, at hvis Kindlin-1 og Kindlin-2 spiller en rolle i lungekræft progression. På grund af den høje heterogenecity for lungekræft ønsker vi også at svare, at hvis Kindlin-1 og Kindlin-2 udtrykkes forskelligt i forskellige typer af lungekræft og fungerer tydeligt i lunge kræftceller. Til dette formål har vi undersøgt ekspressionen af ​​Kindlin-1 og Kindlin-2 i et panel af lungekræft vævsprøver og opmærksomhed for at sammenligne de relative ekspressionsniveauer af Kindlin-1 og Kindlin-2 i den samme patient. Interessant, identificerede vi en gensidig rolle Kindlin-1 og Kindlin-2 i reguleringen af ​​tumor progression i begge celler og dyr. Tilsammen vores resultater giver en ny forståelse af Kindlin-1 og Kindlin-2 i lungekræft celle progression og kan hjælpe til fremtidig drug design mod lungekræft lægemidler.

Materialer og metoder

Etik

den etiske komité af Peking University Health Science center har godkendt den aktuelle undersøgelse for mus eksperimenter (Permit Nummer: LA2011-73). Det etiske udvalg af kinesisk-Japan Friendship Hospital har godkendt den aktuelle undersøgelse ved hjælp lungekræft patient tumorvæv til forskningsformål (Permit nummer: ZRLW-5) .De procedurer for håndtering af mus og menneskelige materialer var i overensstemmelse med den etiske standard af Helsinki erklæring af 1975, og den reviderede i 1983.

ekspressionsvektorer, cellekultur og stabil transfektion cellelinjer

Kindlin-1 cDNA i fuld længde blev klonet fra et humant placenta cDNA bibliotek ved hjælp af primere: CAGAATCCATGCTGTCATCCACTGACTTTAC (fremadrettet primer) og GATCTAGATCAATCCTGACCGCCGGTCAA (bagudrettet primer). PCR-produkt blev klonet i PCRII vektoren, og derefter yderligere klonet ind pCMV10-3 × Flag-vektor (Sigma) under anvendelse af Hindlll-EcoRI-steder. U1752, H1299, A549 og U1810 cellelinjer blev købt fra ATCC i USA eller Cell Collection Center i Peking Union Medical School i Kina og blev dyrket i RPMI1640-medie (Invitrogen) med 10% FBS og 50 ug /ml gentamycin. Celler blev dyrket i 75 cm

2-dyrkningskolber eller 60 mm skåle ved 37 ° C i fugtighed med 5% (v /v) CO

2. Medier blev ændret hver anden dag. For etablering af stabile kloner, der udtrykte Kindlin-1 og Kindlin-2 hver for sig, blev H1299 celler transficeret med Flag-Kindlin-1, Flag-Kindlin-2 og tom vektor hjælp lipofectamin. Fireogtyve timer efter transfektion blev cellerne passeret og G418 blev tilsat ved en slutkoncentration på 1200 ug /ml. Enkelte kloner, der udtrykte Kindlin-1 eller Kindlin-2 blev samlet sammen for at undgå klonale effekter. Puljede celler udtrykker Kindlin-1 eller Kindlin-2 blev anvendt til funktionelle studier som angivet i teksten.

tumorvæv

Lungekræft vævsprøver blev opnået fra Institut for Thoracic Surgery Sino-Japan Venskab Sygehus, Beijing Kina, og blev snittet på Patologisk Institut Health Science center Peking University, Beijing Kina. Blandt de 140 tumor vævssnit, der blev brugt til immunhistokemisk analyse, 65 er SCC, 43 er AC, 12 er LCC og 20 er SCLC (tabel 1). Alle disse prøver blev underkastet Kindlin-1 og Kindlin-2-farvning. Desuden 7 friske lungekræft væv med de parrede tumor omegn væv omfatter 3 SCC, 3 AC og en LCLC. Disse væv blev anvendt til at ekstrahere mRNA for qPCR påvisning af Kindlin-1-ekspression.

Western blot-analyse

PBSTDS lyseringspuffer med tilstedeværelsen af ​​protease cocktail inhibitor (Roche Diagnostics, GmbH) blev anvendt til at ekstrahere totale cellelysater. 80% af cellelysater blev sat til 20% på 5 × SDS loading buffer og derpå opløst ved 10% SDS-PAGE-gel og blottet på PVDF-membraner (porestørrelse 0,45 um). De primære antistoffer anti-Kindlin-1 muse-monoklonalt antistof (1:500 fortynding Klon 4A5.14, Milipore, USA), anti-Kindlin-2 muse-monoklonalt antistof (1:1000 fortynding Klon 3A3, Milipore, USA), anti -Vimentin kanin monoklonalt antistof (1: 2000 fortynding Epitomics, USA), anti-Ecadherin kanin monoklonalt antistof (1: 3000 fortynding Epitomics, USA), anti-N-caherin kanin monoklonalt antistof (1: 10000 fortynding Epitomics, USA ), anti-FLAG-monoklonale antistof (1:10000 fortynding Klon M2, Sigma, USA) og anti-β-actin-monoklonalt museantistof (1:1000 fortynding Klon C4, Santa Cruz, USA) blev inkuberet med membranerne særskilt under rotation. Efter grundig vask blev membranerne inkuberet yderligere med tilsvarende sekundære antistoffer, der genkender enten kanin eller muse-Ig (Jackson Laboratories, USA). Endelig blev båndene visualiseret ved den forbedrede chemoluminescens (Pierce).

Kvantitativ PCR

Kvantitativ PCR (qPCR) assays blev udført for at detektere ekspressionen af ​​Kindlin-1 mRNA i lunge tumorvæv. Kort fortalt blev de normale væv og lunge tumor samlede mRNA’er isoleret ved Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), og 2 ug af total RNA blev revers transkriberet under anvendelse af M-MLV revers transkriptase (Promega, CA, USA). Derefter PCR blev udført ved anvendelse af Taq PCR MasterMix (TIANGEN, Kina) med indstillingerne som: 94 ° C 2 minutter; 94 ° C 30 sek, 60 ° C 30 sek, 72 ° C 30 sek, i 30 cykler; 72 ° C 5 min. Primersekvenserne var som følger: til human Kindlin-1, frem: TCATGTTGGAGGAGTGATGC, omvendt: AAGCCAGCAATGCTTCTGTT; til actin, frem: CTGAGCGTGGCTACTCCTTC, omvendt: GCCATCTCGTTCTCGAAGTC. PCR-produkter blev analyseret ved 2,5% agarosegelelektroforese i nærværelse af ethidiumbromid til visualisering. Kvantitativ PCR blev også anvendt til at identificere ændringerne af MMP’er mRNA-niveau induceret af Kindlin-1 og Kindlin-2 i H1299 cellelinie. MMP-2 frem: AGCTCCCGGAAAAGATTGAT, omvendt: GGTGCTGGCTGAGTAG- ATCC; MMP-7 fremad: GTCTCGGAGGAGATGCTCAC; omvendt: TACCCAAA-GAATGGCCAAGT; MMP-9 fremad: TCTTCCCTGGAGACCTGAGA; omvendt: ATTTCGACTCTCCACGCATC. Relative fold ændringer i qPCR blev bestemt ved ΔΔCt metoden.

cellemotilitet assays

Transwell kamre (Costar) med 8 um porestørrelse blev anvendt til at udføre cellemigrationsassay. Først blev Collagen type I anvendes til at coate den nedre overflade af Transwell membraner i 1 time ved stuetemperatur. Derefter H1299 celler stabilt transficeret med Flag-BAP (bakteriel alkalisk phosphatase), Flag-Kindlin-1 og Flag-Kindlin-2 blev podet på den øvre overflade af Transwell. Efter 6 timers inkubation i migration buffer (RPMI1640, 2 mM CaCl

2, 1 mM MgCl

2, 0,2 mM MnC

2, og 0,5% BSA) ved 37 ° C i befugtet 5% CO

2 blev Transwell membraner fikseret med 4% formaldehyd i 15 minutter og farvet ved krystalviolet i 10 minutter. Til sidst blev 6 mikroskopiske felter tilfældigt valgt til at tælle de migrerede celler.

For celle sårheling eksperiment, 48 timer efter transfektion monolag celler blev ridset ved hjælp af en standard 100 pi pipettespids. De sårede monolag blev vasket to gange for at fjerne ikke-adhærente celler med 0,1 M PBS (pH 7,2). Tolv timer senere såret blev observeret med en 20 × objektiv (Nikon, Japan) og målt for bredden af ​​cellen sår. Seks mikroskopiske felter for hver skål blev observeret og fotograferet.

Immunhistokemi (IHC)

Lung tumor slides opnået fra Sino-Japan Friendship Hospital var alle formalin-fikseret og paraffinembeded. Afparaffinering og hydrering blev udført og efterfulgt ved at afskaffe endogen peroxidaseaktivitet under anvendelse 0,3% hydrogenperoxid i 30 minutter og mikrobølgeovn for antigen retrieval in 10 mM natriumcitratbuffer (pH 6,0) i 20 min. Vi anvendte affinitetsoprenset polyklonalt anti-Kindlin-1 (PKU Animal Facility) antistof ved 2 ug /ml og monoklonalt anti-Kindlin-2 (Milipore, USA) ved 2 ug /ml til at udføre disse forsøg. Det primære antistof blev anvendt ved 4 ° C natten over. Så PV9000 2-trins plus Poly-HRP Anti-mus /kanin IgG Detection System (Zhongshan Jin Qiao) blev anvendt. Den streptavidin-biotin peroxidase metode blev anvendt til detektion og diaminobenzidin blev ansøgt om substrat (ChemMate Detection Kit, DAKO). Hematoxylin blev anvendt til kontrastfarve. Negative kontroller blev udført ved at udelade brugen af ​​primære antistof.

Evaluering af immunhistokemi

To uafhængige patologer evalueret alle immunfarvninger og en konsensus begrundelse baseret på diskussion blev registreret. Vurderingen blev klassificeret i 4 kvaliteter: ingen reaktivitet markeret som 0, svag reaktivitet som 1+, moderat reaktivitet som 2+, og stærk reaktivitet som 3+

In vivo

xenograft tumorvækst. eksperimentere Salg

nøgne Balb /c-mus blev implanteret subkutant i flanken med 1 × 10

6 celler, som er stabilt overudtrykker Kindlin-1, Kindlin-2 og kontrolvektoren separat. Tumorer blev målt for deres størrelser i atten dage og fortsætter med at optage i den angivne tid. Mus blev aflivet under anvendelse af eutanasi når tumorvækst på 1 cm i diameter. Tumorer blev taget ud og vægtet.

Statistisk analyse

statistiske analyser for patientens materialer blev udført med Kruskal-Wallis test og statistiske analyser for parrede prøver ansat Students t-test. Alle statistiske analyser brugte SPSS version14.0. Resultaterne blev betragtet som statistisk signifikant på niveau med

P

. 0,05

Resultater

Kindlin-1 udtrykkes i normal lungevæv og forskellige undertyper af lungekræft

Kindlin-1-ekspression i lungekræft er blevet foreløbigt foreslået

9,13. Imidlertid er intet kendt i detaljer for Kindlin-1 ekspression i forskellige undertyper af lungecancerpatienter. For at forstå den posible involement af Kindlin-1 og Kindlin-2 i lungekræft progression, vi først undersøgt ekspressionen af ​​Kindlin-1 i lungecancerpatient væv under anvendelse immnohistochemistry (IHC) med et affinitetsoprenset polyklonalt Kindlin-1-antistof, med normal lungevæv som kontrol. Vi fandt, at Kindlin-1 ikke kunne påvises i normale pulmonale alveoler og svagt signal i normale lunge blodkar sås (fig. 1a-A). Interessant Kindlin-1 blev fundet stærkt udtrykt i cytoplasmaet og kerner af kegleformede celler og spindel celler fordelt i søjleformede epitel (fig. 1a-B). Imidlertid Kindlin-1 blev fundet svagt udtrykt i colummar celler, bægerceller og ikke udtrykkes i kælderen memberane. I lunge tumorvæv blev Kindlin-1 fundet højt udtrykt i cytoplasmaet samt membran af SCC (fig. 1a-C). Endvidere Kindlin-1 blev fundet moderat udtrykt i cytoplasmaet i tumorøst glandulær epiteler i AC (fig. 1a-D) og svagt udtrykt i LCC (fig. 1a-E). Overraskende blev ingen ekspression af Kindlin-1 på alle i SCLC observeret (fig. 1a-F) (tabel 2).

a. Kindlin-1-ekspression i væv fra normale og forskellige undertyper af lungekræft undersøgt af IHC. Billeder vises er normal lunge (A), Pseudo-stratificeret cilierede søjleformede epitel (B), SCC (C), AC (D), LCC (E), og SCLC (F). b. Bestemmelse af mRNA-niveauer af Kindlin-1 i den friske kliniske prøver målt ved qPCR. c. Re-analyser af Kindlin-1-ekspression i Oncomine database. Venstre: Kindlin-1-ekspression udvindes i Hou lunge datasæt; Til højre: Kindlin-1-ekspression udvindes i Garber lunge datasæt. Statistiske analyser mellem forskellige patientgrupper blev undersøgt af Students

t

test. ** Repræsenterer for

s

. 0,01

Desuden undersøgte vi Kindlin-1 mRNA-ekspression selv frisklavet tumorvæv fra SCC, AC og SCLC af lunge kræftpatienter. Vi fandt, at SCC viste højere niveauer af Kindlin-1-ekspression end AC, og SCLC viste den laveste udtryk for Kindlin-1 mellem forskellige typer af lungekræftpatienter undersøgt (fig. 1b).

opmuntrende, ovenstående Kindlin -1 udtryk profil som bestemmes enten ved immunhistokemi eller qPCR blev yderligere understøttet af re-analizing Kindlin-1 mRNA-ekspression profil i patientens datasæt fra Oncomine Database (www.oncomine.com). Efter at have analyseret Hou og Garber lungekræft patientens Affymetrix datasæt, fandt vi, at Kindlin-1-ekspression i forskellige typer af NSCLC på mRNA-niveau significanly blev forøget (fig. 1c), hvilket er i overensstemmelse med ovennævnte IHC-resultater. Disse data tyder på, at Kindlin-1 faktisk er stærkt expessed i SCC ved undersøgelse af forskellige patientgrupper co-Horts.

Kindlin-1-ekspression er korreleret med celledifferentiering i SCC, men ikke i AC

Ovennævnte resultater viste, at selv inden SCC, Kindlin-1-ekspression er heterogen. Dette antyder, at Kindlin-1 ekspression kan variere med ændringen af ​​celledifferentiering i lungekræft. Til dette formål har vi analyseret Kindlin-1-ekspression i SCC med forskellige stadier af celledifferentiering. Interessant fandt vi, at Kindlin-1 udtrykkes kraftigt i brønden differentieret SCC end moderat differentierede SCC (fig 2-A og -B.); og den moderate differentieret SCC udtrykte højere Kindlin-1 end dårligt differentieret SCC (fig. 2-B og -C). Men denne tendens Kindlin-1-ekspression fundet i SCC var ikke gældende for AC (data ikke vist). Taget sammen indikerer disse data, at jo højere differentiering fase reagerer på højere ekspression af Kindlin-1 i SCC (tabel 2).

Repræsentative billeder afspejler Kindlin-1-ekspression i SCC er blevet udvalgt og statistiske analyser kan være findes i tabel 2. En, godt differentieret SCC. B, Moderat differentieret SCC. C, Dårligt differentieret SCC.

Kindlin-1 og Kindlin-2 udtrykkes forskelligt i forskellige undertyper af lungekræft

Indtil nu er der ingen rapport om Kindlin-2-ekspression i lunge cancercellelinjer samt i lungekræftpatienter. Det er af interesse at vide, om både Kindlin-1 og Kindlin-2 udtrykkes i patienter med lungecancer. Til dette formål undersøgte vi Kindlin-2-ekspression i samme panel af patientprøver førnævnte. Mens Kindlin-2 viste sig udtryk i blodkarrene i de normale lungevæv (Fig. 3a-A), Kindlin-2 viste sig stærkt udtrykte i cytoplasmaet og kerner af kegleformede celler (fig. 3a-b) i lighed med den Kindlin-1-farvning, som vist i fig. 1a-B. Dette indikerer, at både Kindlin-1 og Kindlin-2 udtrykkes i den normale bronkierne epithilium. Interessant Kindlin-2-ekspression mønster er helt forskellig fra den af ​​Kindlin-1 i SCC. I stedet for udtrykt i SCC og AC blev Kindlin-2 findes hihgly udtrykt i tumoren stroma (Fig. 3a-C og -D), som står i skarp kontrast til ekspressionsmønsteret for Kindlin-1 i disse typer af lungekræft. Endvidere Kindlin-2 viste sig stærkt udtrykt i LCC på cellemembranen og den omgivende tumor stroma forhold til det svage ekspression af Kindlin-1 i LCC (fig. 3a-E). Derudover lav eller ingen positiv farvning af Kindlin-2 blev observeret i SCLC (fig. 3a-F), som er magen til den Kindlin-1-farvning i den samme celletype (fig. 1a-F). Disse IHC resultater blev yderligere styrket af de re-analyser af Kindlin-2 mRNA-ekspression i Oncomine databaser Hou lunge og Garber lunge (fig. 3b). I serien af ​​SCC patientens vævssnit blev Kindlin-1 udtrykkes kraftigt i tumorcellerne, mens Kindlin-2 viste sig primært til udtryk i tumorstroma (fig. 3c-A, -B). Disse observationer indikerer, at Kindlin-1 og Kindlin-2 forskelligt udtrykkes i lunge kræftceller.

a. Kindlin-2-ekspression i væv fra normale og lungekræft undersøgte væv ved IHC. Billeder vises er normal lunge (A), Pseudo-stratificeret cilierede søjleformede epitel (B), SCC (C), AC (D), LCC (E), og SCLC (F). b. Re-analyser af Kindlin-2 ekspression i Oncomine database. Venstre: Kindlin-2-ekspression udvundet fra Hou lunge datasæt; Højre: Kindlin-2-ekspression ekstraheret fra Garber lunge datasæt. Statistiske analyser mellem forskellige patientgrupper blev undersøgt af Students

t

test. ** Repræsenterer for

s

0,01. c. Sammenligning af udtryk for Kindlin-1 og Kindlin-2 i SCC fra den samme patient. Som vist Kindlin-2 udtrykkes højt i tumor stroma, men ikke i lungecancerceller.

Tabel 2 summerized ekspressionen af ​​Kindlin-1 og Kindlin-2 i tumorerne af forskellige lungekræftpatienter. Kindlin-1-ekspression var positiv i 84% af patienter med lungecancer. For de forskellige tumor undertyper, både Kindlin-1 og Kindlin-2 viste høj positiv rate i NSCLC end i SCLC (

s

0,0001). Interessant, inden NSCLC Kindlin-1 udtrykt ved lave niveauer i LCC, moderat i AC, og det højeste udtryk for Kindlin-1was fundet i SCC (

s

0,0001). Imidlertid Kindlin-2 har en gensidig ekspressionsprofil,: ekspressionsniveauet af Kindlin-2 er lav i SCC, moderat i AC og den højeste ekspression af Kindlin-2 blev observeret i LCC (

s Restaurant 0,0001) . Interessant nok blev Kindlin-1-ekspression fundet korreleret med differentiering af tumorer. SCC, der består af pladeepitel, og AC er sammensat af glandulær epitel blev udstillet højere Kindlin-1-ekspression end LCC, der er klassificeret som udifferentieret carcinom (

s

0,0001). Desuden godt differentieret SCC har en højere Kindlin-1-ekspression end dårligt differentieret SCC (

s

= 0,0024). Til sammenligning blev der ingen korrelation identificeret for Kindlin-1-ekspression med differentiering til AC (

s

= 0,8523). Tilsvarende blev Kindlin-2-ekspression ikke at være korreleret med differentiering af forskellige undertyper af lungekræft (

s

= 0,1759).

Kindlin-1 og Kindlin-2 modsat regulere lungekræft celle progression

in vitro

Da Kindlin-1 og Kindlin-2 forskelligt udtrykkes i lungekræft celler, er det fristende at forstå, om Kindlin-1 og Kindlin-2 fungerer også forskelligt til regulere lungekræft celle progression. Vi har tidligere fundet, at Kindlin-2 blev højt udtrykt i tumor invasiv foran i malignt mesotheliom [10]. Til dette formål undersøgte vi ekspressionen af ​​Kindlin-1 og Kindlin-2 i

de novo

SCC, der er lokaliseret på de sekundære steder fra intra-lunge formidling af et SCC patient. Som vist i fig. 4a-A, Kindlin-1 var stærkt til udtryk på tumormassen af ​​

de novo

SCC, men svagt til udtryk på tumoren invasive front. Dog er Kindlin-1 farvning koncentreret i kerner af celler ved tumor invasiv forsiden af ​​

de novo

SCC, hvilket tyder på en cytoplasma til kerne overgang kan eksistere for Kindlin-1 (fig. 4a-A.Arrowed) . I modsætning hertil blev Kindlin-2 ikke, udtrykt i lignende type struktur fra den samme patient (Fig. 4a.B). Interessant nok blev en cytoplasma til kerne overgang Kindlin-2 også findes på tumoren invasive front (fig. 4a-B.Arrowed). Kollektivt, antyder disse data, at Kindlin-1, men ikke Kindlin-2 er involveret i reguleringen af ​​lungekræft celle kolonisering i SCC. Derfor fortsatte vi med at karakterisere forskellen rolle Kindlin-1 og Kindlin-2 i reguleringen af ​​lungekræft progression. Vi først opdaget udtrykkene for Kindlin-1 og Kindlin-2 samt epithelial til mesenkymale overgang (EMT) -markører E-cadherin og vimentin i lungekræft cellelinier afledt fra SCC, AC og LCC og fandt, at Kindlin-1 og Kindlin- 2 blev differentielt udtrykt i lungekræft cellelinier (fig. 4B). Vi derefter etableret H1299 celler, der stabilt overudtrykt Kindlin-1. Vi fandt, at EMT markører N-cadherin og vimentin blev nedreguleret i lungekræft H1299 celler, der stabilt overudtrykker Kindlin-1 sammenlignet med de kontrol celler, der udtrykker Flag-BAP (fig. 4c), hvilket antyder en rolle Kindlin-1 i inhibering af EMT-programmet i lung adenocarcinom-celler. Endvidere at undersøge forskellen rolle Kindlin-1 og Kindlin-2 i reguleringen af ​​lungekræft celle motilitet, vi udførte hepatotactic migration assay på type I kollagen, der medierer β1 integrin-relateret celle migration. Vi fandt, at Kindlin-1 inhiberes mens Kindlin-2 fremmet H1299 cellemigration i et Transwell assay (fig. 4d). Imens den særskilte rolle Kindlin-1 og Kindlin-2 i reguleringen af ​​lungekræft celleinvasion blev undersøgt ved bestemmelse af ekspressionen af ​​metalloprotenases herunder MMP7, MMP9 og MMP13. MMP7 og MMP9 fandtes at være nedreguleret med ektopisk ekspression af Kindlin-1, hvorimod MMP7 og MMP13 blev opreguleret med ektopisk ekspression af Kindlin-2 (fig. 4e). I en transient transfektion overekspression af Kindlin-1 førte til nedregulering af N-cadherin (fig. 4f venstre panel), hvilket antyder en inhibitorisk rolle Kindlin-1 på EMT forekomst. Imidlertid knockdown af endogent Kindlin-2 faldt niveauet N-cadherin (fig. 4f venstre panel), en effekt, der er ækvivalent med overekspression af Kindlin-1. Endvidere undersøgte vi ekspressionsniveauerne af Kindlin-2 i det primære og sekundære LCC og fandt, at Kindlin-2 var stærkt udtrykt i lymfeknuder fra metastaseret LCC (fig. 4g-B, pile) sammenlignet med den primære tumor fra den samme patient ( fig. 4g-A). Dette fund antydede, at højt Kindlin-2 ekspression kan svare til et stort potentiale for LCC invasion. Tilsammen disse data viste, at den differentierede udtryk for Kindlin-1 og Kindlin-2 i lungekræftpatienter svarer til en modsat forordning om cellemigration samt på cellen invasive kapacitet.

a. Ekspression af Kindlin-1 og Kindlin-2 i den sekundære

de novo

SCC fra en invasiv SCC patient. A. Kindlin-1-ekspression i

de novo

SCC. B. Kindlin-2 udtryk i

de novo

SCC fra den samme patient som i A. f. Venstre panel: Differentiel udtryk for Kindlin-1, Kindlin-2, E-cadherin og vimentin i forskellige lungekræft cellelinjer styret af actin til lastning. Højre panel: Kvantificering af de relative protein ekspressionsniveauer. c. Venstre panel: Stabil udtryk for Kindlin-1 i H1299 celler. Angivet blandes stabile kloner, der udtrykker Flag-Kindlin-1. Højre panel: Kvantificering af de relative protein niveauer for Kindlin-1 reguleret N-cadherin og vimentin. d. Kindlin-1 og Kindlin-2 forskelligt regulere migration i H1299 celler. Vises, er kvantificeringen og plottet som gennemsnit ± standardfejl fra tre uafhængige forsøg. Statistiske analyser mellem forskellige cellegrupper blev undersøgt af Students

t

test. ** Repræsenterer for

s

0,01. e. Kindlin-1 og Kindlin-2 differentielt regulere mRNA-niveauerne af MMP’er analyseret af qPCR i H1299-celler, der stabilt udtrykker Kindlin-1 og Kindlin-2. Indsæt viser ekspressionen af ​​Kindlin-1 og Kindlin-2 i de stabile blandede kloner anvendes i qPCR. f. Venstre paneler: Ekspression af Kindlin-1 nedregulerer N-cadherin og Knockdown af Kindlin-2 nedregulerer N-cadherin. Højre paneler: Kvantificering af de relative protein niveauer for Kindlin-1- og Kindlin-2-regulerede N-cadherin. Statistiske analyser mellem forskellige cellegrupper blev undersøgt af Students

t

test. ** Repræsenterer for

s

0,01. g. Ekspression af Kindlin-2 i lymfekirtel metastaseret storcellet lungecancer patient. A. Primær stor celle lungekræft; B. Lymfeknude spredt stor celle lungekræft fra den samme patient.

Kindlin-1 og Kindlin-2 modsat regulere lungekræft cellevækst i en

in vivo

mus xenograftmodel

på baggrund af ovenstående konstatering af, at Kindlin-1 og Kindlin-2 differentielt blev udtrykt i lungekræft patientprøver, og modsat reguleret migration lungekræft celle

in vitro

, var vi ivrige efter at vide, om Kindlin -1 og Kindlin-2 spiller en særlig rolle i reguleringen af ​​tumorvækst

in vivo

. Til dette formål muse tumorxenoplantater med Kindlin-1 overekspression voksede langsommere og størrelserne af tumorerne var mindre end den af ​​kontrollen (fig. 5a og b). Men tumorer med Kindlin-2 overekspression voksede meget hurtigere og størrelserne af tumorerne var meget større end den af ​​kontrollen (fig. 5a og b). Interessant, tumorvæv udvundet fra mus xenografter vises også øget N-cadherin og vimentin udtryk i Kindlin-2 overekspression tumorer, med ingen ændringer for N-cadherin og vimentin i Kindlin-1 overeksprimeres eller kontrol tumorer (fig. 5c). Disse data viste klart, at Kindlin-1 og Kindlin-2 ikke kun modsat reguleret tumorvækst, men også tumoren invasive potentiale i

in vivo

mus xenograftmodel.

a. Tumorvækst kurve. Tumoren volumen af ​​H1299-Flag-Kindlin-1 gruppe er betydeligt mindre end den Flag-BAP gruppe (

s

0,01, som analyseres af Students

t

test) på dag 22, og i mellemtiden mængden af ​​Flag-Kindlin-2 gruppe er naturligvis større end Flag-BAP gruppe (

s

0,01, som analyseres af Students

t

test). b. Tumorer inddrives fra mus på dag 27. c. Venstre panel: Bestemmelse af udtryk for N-cadherin og vimentin fra tumorxenoplantater stabilt udtrykker Kindlin-1, Kindlin-2 og kontrol BAP ved Western blot-analyser. Højre panel: Kvantificering af de relative protein niveauer for Kindlin-1- og Kindlin-2-regulerede N-cadherin og vimentin. Statistiske analyser mellem forskellige tumor grupper blev undersøgt af Students

t

test.