PLoS ONE: Resistensmekanisme og nye targets der medierer Modstand mod EGFR og c-Met tyrosinkinasehæmmere i ikke-småcellet Cancer

Abstrakt

tyrosinkinasehæmmere (TKI’er) mod EGFR og c-Met er oprindeligt effektiv når indgivet individuelt eller i kombination med ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) patienter. de samlede effektiviteter af TKI’er, er imidlertid begrænset på grund af udviklingen af ​​lægemiddelresistens. Derfor er det vigtigt at belyse mekanismer EGFR og c-Met TKI modstand, for at udvikle mere effektive behandlingsformer. Model NSCLC cellelinjer H1975 og H2170 blev brugt til at studere ligheder og forskelle i mekanismer EGFR /c-Met TKI modstand. H1975 celler er positive for T790M EGFR mutation, som giver resistens mod de nuværende EGFR TKI terapier, mens H2170 celler er EGFR vildtype. Tidligere blev H2170 celler gjort resistente over for EGFR TKI erlotinib og c-Met TKI SU11274 ved udsættelse for progressivt stigende koncentrationer af TKI’er. I H2170 og H1975 TKI-resistente celler, blev fundet centrale Wnt og mTOR proteiner, som skal differentielt modulerede. Wnt signalering transducer, blev aktiv β-catenin opreguleret i TKI-resistente H2170 celler sammenlignet med parentale celler. GATA-6, en transskriptionel aktivator af Wnt, blev også fundet at være opreguleret i resistente H2170-celler. I H2170 erlotinib resistente celler, opregulering af inaktive GSK3p (p-GSK3p) blev observeret, hvilket indikerer aktivering af Wnt og mTOR veje, der ellers hæmmes af dets aktive form. Men i H1975-celler, Wnt modulatorer såsom aktiv β-catenin, GATA-6 og p-GSK3p blev nedreguleret. Yderligere resultater fra MTT cellelevedygtighedsassays viste, at H1975 celledeling ikke var signifikant nedsat efter Wnt hæmning af XAV939, men kombinationsbehandling med everolimus (mTOR-hæmmer) og erlotinib resulterede i synergistisk celle væksthæmning. Således i H2170-celler og H1975-celler, samtidig inhibering af centrale Wnt eller mTOR pathway proteiner foruden EGFR og c-Met, kan være en lovende strategi for at overvinde EGFR og c-Met TKI resistens i NSCLC-patienter.

Henvisning: Botting GM, Rastogi i, Chhabra G, Nlend M, Puri N (2015) Resistensmekanisme og nye targets der medierer Modstand mod EGFR og c-Met tyrosinkinasehæmmere i ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 10 (8): e0136155. doi: 10,1371 /journal.pone.0136155

Redaktør: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, UNITED STATES

Modtaget: September 19, 2014 Accepteret: 31 Juli 2015; Udgivet: 24 August, 2015

Copyright: © 2015 Botting et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af National Cancer Institute of National Institutes of Health under award nummer R21CA158965-01A1 (http: //www.nih .gov) til Neelu Puri. Dette arbejde blev også finansieret delvist af en EF Grant fra Fællesskabet Foundation of Norther Illinois til Neelu Puri. Indholdet er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter National Institutes of Health. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har følgende interesser: Dr. Marie Nlend er ansat af Thermo Fisher Scientific . Der er ingen patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer, som beskrevet online i vejledningen for forfattere.

Introduktion

EGFR og c-Met er receptor tyrosin kinaser (RTK), er stærkt udtrykt i NSCLC og lette tumorigen signalering gennem fælles veje, når dysreguleret [1,2]. Adskillige tyrosinkinasehæmmer (TKI) terapier mod EGFR og c-Met er i øjeblikket administreres og er oprindeligt effektive i NSCLC patienter, der har visse somatiske EGFR-aktiverende mutationer såsom L858R [3-5]. Men udviklingen af ​​TKI resistens er almindelig og medfører tilbagevenden af ​​tumorer [6,7]. Større end 50% af alle erhvervede sekundær modstand mod EGFR TKI’er tilskrives udviklingen af ​​T790M sekundære “gatekeeper mutation” [8-12]. Denne mutation kan også forårsage primær EGFR TKI modstand hvis til stede før behandling [10]. Yderligere 20% af erhvervet resistens til EGFR TKI’er tilskrives amplifikation af c-Met receptor [2,13,14].

MET

genamplifikation og tilstedeværelsen af ​​T790M udelukker ikke hinanden, da undersøgelser har vist, at mange NSCLC patienter er positive for begge ændringer [2,15].

Tidligere undersøgelser fra vores gruppe og andre har vist, at EGFR og c-Met have betydelig krydstale, som bidrager til øget aktivering af deres fælles downstream pathways [16]. Også det er påvist, at der er en synergistisk effekt mellem EGF og HGF om tumorgenicitet [1], og at EGFR og c-Met TKI’er kan synergistisk hæmme NSCLC celledeling [17].

Forskning har foreslået, at dysregulering af Wnt-vejen kan være en vigtig faktor, der bidrager til øget vedligeholdelse og spredning signalering i forskellige kræftformer [18,19]. Andre undersøgelser tyder på, at krydstale mellem EGFR og Wnt kan forbedre lungekræft tumorigenese [17,18,20]. XAV939, en tankyrase inhibitor er en lovende small-molekyle Wnt inhibitor øjeblikket i prækliniske undersøgelser. XAV939 aktiverer Axin1, fremme β-catenin-nedbrydning [21], og således inhibering af kanoniske Wnt-signalering. Desuden pattedyr mål for rapamycin (mTOR), en serin /threonin-kinase, som er en central aktør i PI3K /Akt pathway, der handler både op og nedstrøms Akt [22-25] har også været forbundet med en række kræftformer, når dysreguleret, . Således har mTOR også blevet et potentielt terapeutisk mål i anti-cancer behandlinger [26]. Rapamycin og dens afledte, everolimus, er to lovende mTOR-hæmmere i øjeblikket i kliniske forsøg for lungekræft [27-30]. Kanoniske Wnt og mTOR veje kan være negativt reguleret af serin /threonin-kinase GSK3p [31-33]. Hos mennesker GSK3 har to isoformer, GSK3α og GSK3p [34], med den sidstnævnte er kendt for at virke som en del af β-catenin ødelæggelse kompleks [33,35,36]. Denne undersøgelse sammenligner disse alternative signalveje, specielt vigtige proteiner i Wnt og mTOR veje, i model NSCLC cellelinjer positive eller negative for EGFR-aktiverende mutation T790M.

Nylige undersøgelser i vores laboratorium, der involverer TKI-resistente H2170 celler har demonstreret en opregulering af p-ERK, et protein, der vides at aktivere GATA-6 [17]. GATA-6 er en transkriptionsfaktor som menes at være afgørende for udviklingen af ​​lungeepitelceller og andre embryogene processer [37,38], ved at regulere Wnt-vejen [37]. GATA-6 er også kendt for at lette Wnt-aktivering ved at fremme transskription af vigtige Wnt ligander [37,39-43]. Stimulering af den kanoniske Wnt-vejen i sidste ende resulterer i aktivering af β-catenin (dephosphoryleret på Ser37 og Thr41), som fremmer transkriptionen af ​​proteiner involveret i celleproliferation [44,45].

Denne undersøgelse viser, at en kombination Wnt eller mTOR-hæmmere med aktuelle EGFR og c-Met TKI’er kan med held hæmme celledeling og overlevelse i vildtype EGFR NSCLC celler. Men i tilfælde af T790M-positive celler, kan det være muligt at bryde modstand, ved at kombinere mTOR inhibitorer med EGFR og c-Met TKI’er. Denne undersøgelse tyder på, at mekanismen for resistens mod EGFR /c-Met TKI s er anderledes i muterede (T790M) og vildtype EGFR NSCLC-celler. Dette indikerer, at der skal anvendes selektiv kombinatorisk behandling for celler med vildtype EGFR og T790M muteret EGFR, at forbedre lungekræft patient prognose.

Materialer og metoder

Reagenser og antistoffer

Erlotinib [

N

– (3-ethynylphenyl) -6,7-bis (2-methoxyethoxy) quinazolin-4-amin]. (. Cat No. E-4007) og everolimus (katalog nr E -4040) blev indkøbt fra LC Laboratories (Woburn, MA), SU11274 [[(3Z) -N- (3-chlorphenyl) -3 – ({3,5-dimethyl-4 – [(4-methylpiperazin-1-yl ) carbonyl] 1H-pyrrol-2-yl} methylen) -N-methyl-2-oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonamid]] (katalog nr. S-9820) og XAV939 [3 , 5,7,8-tetrahydro-2- [4- (trifluormethyl) phenyl] -4H-thiopyrano [4,3-d] pyrimidin-4-on] (katalog nr. 53113) blev købt hos Sigma-Aldrich ( St. Louis, MO). Alle inhibitorer blev suspenderet i DMSO og opbevaret som aliquots ved -20 ° C. EGF (katalog nr. AF-100-15) og HGF (kat. Nr 100-39) blev købt hos PeproTech (Rocky Hill, NJ) og blev suspenderet i PBS og opbevaret som aliquots ved -20 ° C.

phosphospecifikt kanin monoklonale antistoffer til p-mTOR (Ser 2448, Clone D9C2), p-4E-BP1 (Thr37 /46, klon 2855), p-GSK3p (Ser 9), Total GSK3p, Axin1 (C76H11) og p-LRP6 (C5C7), phosphospecifikt kanin polyklonale antistoffer rettet mod p-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204) og p-p70SK (T389), blev kanin- og muse IgG sekundære antistoffer opnået fra Cell Signaling Technology. Polyklonalt ikke-phosphoryleret GATA-6 (sc-9055) blev opnået fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Et monoklonalt muse-antistof til aktiv β-catenin (05-665) blev opnået fra Millipore (Billerica, MA). Et monoklonalt museantistof for β-actin blev opnået fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Alle antistoffer blev anvendt ifølge producentens instruktioner.

cellelinier og cellekultur

H2170 og H1975 NSCLC cellelinier blev indkøbt fra American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD, USA, CRL-5928, CRL-5807 og CRL-5908, henholdsvis). De H2170 celler har vildtype EGFR, mens H1975 celler er positive for to EGFR kinasedomæmemutationer: L858R og T790M (dokumenteret af ATCC). Alle cellelinjer blev opbevaret i inkubatorer ved 37 ° C med 7% CO

2 og blev dyrket i overensstemmelse med ATCC instruktioner (atcc.org) i Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640) medier (Thermo Fisher Scientific, Pittsburg, PA, Cat No: SH3002701) suppleret med 10% (v /v) kalvefosterserum (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA, Cat No: S11050), 1% (v /v) Antibiotikum-antimycotisk opløsning (Life Technologies, Carlsbad, CA, Cat No: 15070-063), 1% (v /v) natriumpyruvat (Life Technologies, Carlsbad, CA, Cat No: 11360) og 1% (v /v) Hepes (Life Technologies, Carlsbad, CA, Cat No: 11360).

effekt af EGF /HGF og TKI’er om Phosphorylering af EGFR, c-Met og andre signalveje

Celler blev behandlet før lysis til bestemmelse af virkningerne af vækst faktor ligander og TKI’er på proteinekspression. Parentale celler blev udpladet og fik lov til at klæbe og vokse i 24 til 48 timer, indtil retter var ca. 40% sammenflydende. Celler blev derefter sultet i 24 timer med serum-frit RPMI (med 0,5% BSA). Efter 24 timers sult blev celler behandlet med eller uden respektive TKI’er (erlotinib eller SU11274) i 24 timer. Efter 24 timers TKI behandling blev celler behandlet med eller uden vækstfaktor ligander (15 ng /ml EGF i 2,5 minutter eller 40 ng /ml HGF i 7,5 minutter ved 37 ° C). Umiddelbart efter ligand behandling blev celler lyseret og opsamles til immunblotting.

Cell Lysis og immunblotting

Efter alle celle forbehandlinger (som beskrevet ovenfor) blev cellerne lyseret i puffer (20 mM Tris , 150 mM NaCl, 10% glycerol, 1% NP-40, 0,42% NaF, 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid, 1 nM natrium orthovanidate og 10 mM blanding af proteaseinhibitor (Sigma-Aldrich). Cellelysater blev derefter elektroforeret for separation på 7,5 % eller 10% SDS-PAGE. separerede proteiner blev derefter overført til nitrocellulosemembraner (Bio-Rad Laboatories, Hercules, CA) og probet med antistoffer for Wnt eller mTOR pathway relaterede proteiner. Immunoblots blev udviklet ved anvendelse Pierce ECL Substrat kemiluminescenskittet (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, 32109) og modulationer af forskellige proteiner blev beregnet ved densitometrisk analyse ved hjælp NIH ImageJ software.

MTT Cell levedygtighed Assay

virkningerne af forskellige TKI’er på H2170 og H1975 celle levedygtighed blev målt ved MTT kolorimetrisk reduktion farvestof under anvendelse af MTT 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid farvestof ifølge producentens anvisninger. Celler blev udpladet ved 3000 celler per brønd på 96-brønds plader og efter 24 timer blev celler behandlet med inhibitorer i 72 timer. MTT-reagens (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, kat. Nr M5655) blev derefter tilsat, og cellerne blev inkuberet ved 37 ° C i 4 timer, hvorefter formazankrystaller blev solubiliseret og absorbansen blev målt ved en bølgelængde på 570 nm. Procentvise levedygtighed lægemiddelbehandlede celler blev beregnet i forhold til ubehandlede kontrolceller. Alle eksperimenter levedygtighed celle blev udført tre gange i replikater af seks for hver behandling tilstand.

Immunofluorescens

20.000 celler blev udsået i 8-brønds glas kammer slides per brønd (Lab-Tek II Chamber Slide systemet, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL), der blev præ-coatet med poly-L-lysin (0,01% opløsning) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Celler lodes adhærere i 24 timer, hvorefter cellerne blev sultet natten over i serumfrit medium (med 0,5% BSA). Celler blev derefter behandlet med EGF /HGF (15 ng /ml EGF i 2,5 minutter eller 40 ng /ml HGF i 7,5 minutter ved 37 ° C) og fikseret ved anvendelse af 4% paraformaldehyd-opløsning i 1X PBS. Celler blev derefter permeabiliseret (0,1% Triton X-100 opløsning i 1X PBS) og blokeret (puffer indeholdende 5% normalt gedeserum i 1X PBS). Celler blev inkuberet natten over med aktiv β-catenin primært antistof (1: 400) ved 4 ° C og derefter inkuberet i 1 time ved stuetemperatur med IgG DyLight 488 anti-muse-sekundært antistof (1: 250) (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) (Product # 35502) fortyndet i 1X PBS med 1% BSA og Hoechst nuklear farvning farvestof (blå). Celler blev observeret under anvendelse af et Zeiss Axio Observer Z1 mikroskop. Gennemsnitlig nukleare fluorescensintensitet af aktiv β-catenin farvning blev målt ved hjælp af NIH ImageJ software over 10 mikroskopiske felter pr behandling tilstand og værdier blev beregnet.

qPCR-analyse

200.000 celler blev udsået i en 35 mm skål og fik lov til at klæbe i 24 timer. Sultende medier (RPMI med 0,5% BSA) blev derefter tilsat til cellerne i 24 timer, hvorefter totalt RNA blev indsamlet ved brug Invitrogen RNA mini kit. RNA blev kvantificeret under anvendelse af Tag 3 NanoDrop og derefter lige koncentrationer af RNA blev anvendt til syntese af cDNA. Primersekvenserne anvendt til β-Catenin er F: TGGATGGGCTGCCTCCAGGTGAC og R: ACCAGCCCACCCCTCGAGCCC og for GAPDH er F: TTGCCAATGACCCCTTCA og R: CGCCCCACTTGATTTTGGA. qPCR blev udført under anvendelse SuperScript III Platinum To Trin QRT-PCR-kittet (Life Technologies, Carlsbad, CA) ifølge fabrikantens protokol. Ekspressionen af ​​hvert gen blev analyseret i tre eksemplarer, og Ct-værdierne blev normaliseret med GAPDH. Dataene blev derefter analyseret ved hjælp ΔΔCt metode og fold ændringer blev beregnet ved hjælp af 2

(- ΔΔCt).

Statistisk analyse

blev udført Alle forsøgene tre til fem gange. Den t-test eller ANOVA blev anvendt til at analysere den statistiske signifikans af dataene. En p-værdi på mindre end 0,05 blev anset for at være statistisk signifikant hele undersøgelsen.

Resultater

Sammenligning af IC

50 af forældrenes og resistente H2170 cellelinjer med H1975 cellelinje

H2170 celler var oprindeligt moderat følsomme til TKI’er erlotinib og SU11274 grund af deres vildtype-status EGFR (tabel 1). Som beskrevet i vores tidligere undersøgelse [17], parentale (naive) H2170-celler blev behandlet med stigende koncentrationer af erlotinib (0,5 til 14 uM) og SU11274 (2,5 til 17 uM) over flere måneder for at opnå celler med stabil modstand ved høje koncentrationer af disse TKI’er. Disse celler udviste stabil modstand efter 12 passager i stoffri medier. MTT cellelevedygtighedsassays blev udført til bestemmelse af IC

50 for erlotinib og SU11274. Den IC

50-værdier beregnet ved hjælp af Sigma Plot 12.5 software og resultater vises i tabel 1. IC

50 af erlotinib og SU11274 i H2170 erlotinib resistente (H2170-ER) og SU11274 resistente (H2170-SR) celler viste sig at være 11.-22 gange og 4 til 5 gange større henholdsvis [17], når der sammenlignes med H2170 parentale (H2170-P) celler. Blev imidlertid IC fundet

50 af erlotinib og SU11274 at være ca. 15 gange og 2 gange højere i henholdsvis H1975 celler, sammenlignet med H2170 parentale celler. Under denne undersøgelse blev H2170 TKI-resistente celler opretholdt i medium indeholdende 10 uM erlotinib eller 10 uM SU11274. H1975 celler er naturligt resistente over for erlotinib, på grund af tilstedeværelsen af ​​T790M-mutationen, og med henblik på denne undersøgelse H1975-celler blev dyrket i stoffri medium.

Dual inhibering med EGFR og c- Met TKI’er på H1975 celleproliferation

Da den T790M EGFR mutation er kendt for at bibringe erlotinib resistens (tabel 1) i NSCLC, er det vigtigt at identificere potentielle lægemiddel følsomhed forårsaget af denne mutation. Derfor har vi testet for narkotika synergi på H1975 celler (positive for L858R og T790M EGFR mutationer) ved hjælp af erlotinib og SU11274 via MTT celleviabilitetstest. Synergistiske virkninger på H1975 cellevækstinhiberingen blev observeret med erlotinib og SU11274 i kombination i koncentrationer på 1 uM (1: 1 forhold af hvert lægemiddel) og 3 uM (1: 1 forhold af hvert lægemiddel) (Fig 1). Men deres kombinatoriske effekter ikke var synergistisk over koncentration på 5 uM af hvert lægemiddel (1: 1-forhold) (data ikke vist). Synergisme blev bestemt ved anvendelse CalcuSyn software v2.0 og kombinatorisk (CI) værdier under 1, blev opnået (Cl-værdier 1 indikerer synergisme) [46]

H1975-celler blev udpladet med 3000 celler per brønd i en. 96 brønds plade og efter 24 timer blev behandlet med varierende kombinationer af EGFR-inhibitor erlotinib og c-Met inhibitor SU11274. Efter 72 timers lægemiddeleksponering MTT cellelevedygtigheden blev udført. Synergistiske inhiberende virkninger på H1975 cellevækstinhiberingen blev observeret efter kombinationsbehandling af erlotinib og SU11274 ved koncentrationer på 1 uM og 3 uM (1: 1 forhold af hvert lægemiddel). Drug synergisme blev beregnet ved anvendelse CalcuSyn v2.0 software og Cl-værdier lå under 1. ANOVA-analyse blev anvendt til at bestemme statistisk signifikante forskelle mellem behandlinger (n = 3, p 0,01).

rolle Wnt og mTOR veje i EGFR /c-Met TKI-modstand

for at belyse mekanismen af ​​resistens over for erlotinib og SU11274 i H2170 celler blev ekspressionsniveauerne af vigtige proteiner involveret i Wnt /mTOR pathway bestemt af immunblotting. Vi observerede, at aktiv β-catenin blev opreguleret 1,5 gange og 2,0 gange i nærvær af EGF og erlotinib henholdsvis i H2170-ER-celler, sammenlignet med samme behandlinger i H2170 parentale celler. Vi observerede også, at GATA-6 blev opreguleret 2.0 til 3.0 gange i nærvær og fravær af EGF og erlotinib i H2170-ER-celler sammenlignet med samme behandlinger i H2170-P-celler. Endvidere p-GSK3p (Ser9) viste sig at være opreguleret ca. 2 gange i H2170-ER-celler i nærvær af erlotinib sammenlignet med erlotinib behandlet H2170-P-celler (Fig 2).

H2170 -P, H2170-ER og H2170-SR-celler blev udpladet i 35 mm skåle ved 125.000 celler pr skål og sultet (RPMI 1640 med 0,5% BSA) i 24 timer før ligand (EGF og HGF) eller /og lægemiddel (erlotinib og SU11274 ) behandlinger. Efter western blot analyse forøget ekspression af Wnt og mTOR pathway relaterede proteiner i H2170-ER og blev observeret H2170-SR celler sammenlignet med H2170-P celler med undtagelse af p-GSK-3β i H2170 SR celler. De fold ændringer blev beregnet ved hjælp af ImageJ software. (N = 3, p 0,05).

Ligeledes kan der i H2170-SR celler observerede vi aktiv β-catenin blev opreguleret 2.0 til 4.0 gange i nærvær og fravær af HGF og SU11274 ; p-GSK-3b blev opreguleret 1,5 til 2,0 gange i nærvær og fravær af HGF og SU11274; og GATA-6 var også opreguleret 3,0 til 4,0 gange i nærvær af HGF og SU11274, sammenlignet med samme behandlinger i H2170-P-celler (p 0,01) (Fig 2). Ingen signifikant modulation i ekspressionen af ​​totale proteiner blev observeret blandt H2170-P, H2170-ER og H2170-SR celler (fig 2).

Øget cellekerneakkumulering af aktiv β-catenin i H2170-ER og H2170 -SR celler Salg

på grund af det faktum, at aktive β-catenin er en central nedstrømseffektor i den kanoniske Wnt signalvejen og observeres at være signifikant opreguleret i H2170-eR og H2170-SR celler (fig 2). Vi analyserede lokaliseringen af ​​aktive β-catenin i H2170-P, H2170-ER og H2170-SR celler under anvendelse af immunofluorescens. Efter aktivering, β-catenin akkumuleres ind i kernen, og interagerer med TCF /LEF at initiere transkription. Vi observerede, at i H2170-ER og H2170-SR celler, blev der øget lokalisering af β-catenin i kernen i forhold til H2170-P celler. Gennemsnitlige fluorescerende intensitet af aktiv β-catenin-farvning i kernen blev fundet at være 1,9 og 2,5 gange større i H2170-ER-celler sammenlignet med H2170-P, i ​​EGF behandlede og ubehandlede celler (p 0,01) (figur 3) . Tilsvarende blev den gennemsnitlige fluorescensintensitet af aktiv β-catenin-farvning i kernen fundet at være 2,9 og 3,1 gange større i H2170-SR celler, sammenlignet med H2170-P-celler, i HGF behandlede og ubehandlede celler (p 0,01 ) (figur 3).

H2170-P, H2170-ER og H2170-SR celler blev udsået i 8-brønds kammer slides på 20.000 celler per brønd og derefter sultet natten over. Celler blev fikseret med 4% paraformaldehyd, permeabiliseret med 0,1% Triton X-100 og derefter blokeret med 5% normalt gedeserum og 0,3% Triton X-100 før inkubation med primært antistof. Cellerne blev derefter inkuberet med Dylight 488 konjugeret sekundært antistof og derefter blev observeret under fluorescensmikroskop. Den grønne farve i billedet repræsenterer aktive β-Catenin farvning i cellen og den lilla farve repræsenterer DAPI nuklear farvning. Gennemsnitlige intensitet af aktiv β-catenin-farvning blev kvantitativt målt ved anvendelse ImageJ software. Vi observerede større nukleare akkumulering af aktiv β-catenin i H2170-ER og H2170-SR celler, i sammenligning med H2170-P-celler (n = 3, p 0,01).

Aktivering af mTOR pathway i H1975 celler

for at belyse virkemåden af ​​resistens over for erlotinib og SU11274 i H1975 cellelinje (T790M-positive), immunoblotting blev udført for at analysere de modulationer i ekspressionsniveauerne af vigtige Wnt og mTOR proteiner. Aktiv β-catenin blev fundet at være nedreguleret 1,5 gange i H1975-celler i nærvær af erlotinib og EGF i forhold til H2170-P celler med samme behandlinger. GATA-6 viste sig at være nedreguleret 1.5 til 6,5 gange i H1975-celler i nærvær og fravær af EGF og erlotinib behandling sammenlignet med samme behandlinger i H2170-P-celler. Endvidere var negativ Wnt regulator Axin1 fundet, at være opreguleret 1,5 gange og 2,5 gange i H1975-celler, sammenlignet med H2170-P-celler i nærvær af EGF og erlotinib, (fig 4A). De modulationer i udtryk af centrale Wnt vej relaterede proteiner, efter EGF og erlotinib behandling tyder på, at i H1975 celler, den Wnt /β-catenin vej er ikke direkte involveret i udviklingen af ​​erlotinib resistens.

H1975 og H2170-P celler blev udpladet med 125.000 celler pr skål i 35 mm skåle og sultet (RPMI 1640 med 0,5% BSA) i 24 timer før ligand (EGF og HGF) eller /og lægemiddel (erlotinib og SU11274) behandlinger og analyseret under anvendelse western blot. (A) Aktiv β-catenin og GATA-6 blev observeret at blive nedreguleret og p-ERK, p-mTOR, p-p70S6K, p-LRP5 /6 og Axin1 blev observeret at være opreguleret i H1975-celler sammenlignet med de samme behandlinger i H2170-P-celler (n≥3, p 0,05). (B) På lignende aktive β-catenin og GATA-6 blev observeret at blive nedreguleret mens, blev p-GSK3p ikke signifikant moduleret i H1975-celler sammenlignet med H2170-P celler med samme behandlinger. Vi har også observeret p-ERK, p-LRP5 /6, p-mTOR, p-p70S6K, p-4E-BP1 og Axin1 blev alle opreguleret i H1975 celler sammenlignet med H2170-P celler med samme behandlinger (n≥3, s 0,05) (fig 4A).

Endvidere immunoblotting blev udført for at belyse ligheder eller forskelle i proteinekspression i H1975-celler efter behandling med HGF og SU11274. Aktiv β-catenin viste sig at være nedreguleret 1,5 til 2,0 gange i H1975-celler i nærvær og fravær af SU11274 og GATA-6 viste sig også at blive nedreguleret 1,5 til 3,5 gange i nærvær og fravær af HGF og SU11274 i H1975 celler sammenlignet med samme behandlinger til H2170-P-celler. Vi har ikke observere nogen væsentlige modulationer i ekspression af p-GSK3p (Ser9) i H1975 celler i forhold til lignende behandlingsgrupper i H2170-P celler. Endvidere var negativ Wnt regulator Axin1 fundet, at være opreguleret 2,0 gange i H1975-celler, i nærvær af HGF og SU11274 sammenlignet med H2170-P celler med samme behandlinger (p 0,05). (Fig 4B)

Derudover p-ERK og p-LRP5 /6 blev observeret at være opreguleret op til 2,0 gange i H1975-celler, sammenlignet med H2170-p-celler i nærvær af SU11274. Desuden blev p-mTOR opreguleret 1,5 gange i fravær af EGF og erlotinib og i nærvær af kun erlotinib, mens p-p70S6K blev opreguleret 1,5 til 3 gange i nærvær og fravær af HGF og SU11274 i H1975-celler sammenlignet med samme behandlinger i H2170-P-celler (p 0,05) (fig 4b). Vi observerede ikke nogen signifikant modulation i ekspressionen af ​​vigtige totale proteiner i H1975-celler sammenlignet med H2170-P-celler (S1 Fig).

opregulering af mTOR pathway i H1975-celler sammenlignet med erlotinib-resistente og SU11274 resistente H2170 celler

for at belyse ligheder eller forskelle i den måde, modstandsdygtighed over for erlotinib forekommer i H1975 og H2170-eR celler, immunoblotting blev udført efter EGF og erlotinib behandling. p-LRP5 /6 blev nedreguleret 1.5 til 2,2 gange i H1975-celler i nærvær og fravær af EGF og erlotinib sammenlignet med samme behandlinger i H2170-ER-celler. GATA-6 viste sig at være nedreguleret 3,6 gange og 2,9 gange i H1975-celler sammenlignet med H2170-ER-celler i nærvær af EGF og erlotinib, henholdsvis og p-ERK blev fundet at være opreguleret 2.0 til 70,0 gange i H1975 celler i nærvær og fravær af erlotinib og EGF i forhold til samme behandlinger til H2170-ER-celler. Desuden blev p-mTOR fundet at være opreguleret op til 1,6 gange i nærvær af EGF alene og i fravær af både EGF og erlotinib i H1975 sammenlignet med H2170-er celler med de samme behandlinger. Endvidere blev p-p70S6K fundet, at være opreguleret op til 2,0 gange i H1975-celler sammenlignet med H2170-ER-celler i fravær og nærvær af EGF og erlotinib både (p 0,05). (Fig 5A)

H1975, H2170-ER og H2170-SR-celler blev udpladet med 125.000 celler pr skål i 35 mm skåle og sultet (RPMI 1640 med 0,5% BSA) i 24 timer før ligand (EGF og HGF) eller /og lægemiddel (erlotinib og SU11274 ) behandlinger og blev analyseret ved anvendelse western blot. (A) GATA-6 og p-LRP5 /6 blev observeret at blive nedreguleret i H1975-celler sammenlignet med H2170 ER celler i samme behandlinger. Imidlertid blev p-ERK, p-mTOR og p-p70S6K opreguleret i H1975-celler sammenlignet med H2170-ER-celler i lignende behandlinger (n≥3, s 0,05). (B) Aktiv β-catenin og GATA-6 blev observeret at blive nedreguleret i H1975-celler sammenlignet med samme behandlinger i H2170-SR celler. Vi bemærkede også, at p-ERK, p-mTOR og p-p70S6K blev opreguleret i H1975 celler sammenlignet med H2170-SR celler i samme behandlinger. Ændringerne fold blev beregnet ved hjælp af ImageJ software (n≥3, p 0,05).

På samme måde til at belyse ligheder eller forskelle i den måde, TKI modstand forekommer i H1975 og H2170-SR celler, immunoblotting blev udført efter HGF og SU11274 behandling. blev observeret aktive β-catenin, der skal nedreguleres 2,0 gange i H1975-celler, sammenlignet med H2170-SR celler i nærvær og fravær af HGF og SU11274. GATA-6 blev nedreguleret 1.5 til 6,0 gange i H1975-celler sammenlignet med H2170-SR celler i nærvær og fravær af HGF og SU11274. p-ERK blev fundet at være opreguleret 2 gange og 6,0 gange i H1975-celler, sammenlignet med H2170-SR celler, i fravær af HGF og SU11274 begge og i nærvær af SU11274 alene hhv. p-mTOR blev opreguleret 5,5 gange og 1,5 gange i fravær af både HGF og SU11274; og i nærværelse af SU11274 alene i henholdsvis H1975 celler, sammenlignet med samme behandlinger i H2170-SR celler. Endvidere p-p70S6K blev også fundet, at være opreguleret 2.0 til 6,0 gange i H1975-celler sammenlignet med H2170-SR celler i nærvær og fravær af HGF og SU11274 (p 0,05). (Fig 5B)

Øget aktiv β-catenin udtryk i H2170-ER og H2170-SR celler

for yderligere at analysere genekspression af β-catenin i H2170 celler vi udførte qPCR forsøg som beskrevet i afsnittet metoder. Resultaterne indikerer, at i H2170-ER-celler ekspression af β-Catenin på mRNA niveauer var omkring 3,4 gange højere sammenlignet med H2170-P-celler (p 0,01). Tilsvarende β-Catenin ekspression i H2170-SR celler var 3,2 gange højere sammenlignet med de H2170-P-celler (p 0,01). Der blev imidlertid ikke observeret nogen signifikant ændring i β-Catenin genekspression i H1975-celler sammenlignet med H2170-P-celler. (Figur 6).

H2170 og H1975-celler blev udpladet med 125.000 celler pr 35 mm skåle og fik lov til at klæbe og vokse i 24 timer. Hvorefter blev celler udsultet (RPMI med 0,5% BSA) i 24 timer og derefter blev forarbejdet til RNA samling. Real-Time PCR resultater viser, at β-Catenin er opreguleret i H2170-ER og H2170-SR celler sammenlignet med H2170-P-celler. Mens der i H1975 (T790M EGFR muterede) celler vi ikke iagttage nogen signifikant modulation af β-Catenin sammenlignet med H2170-P-celler. Ekspression af hvert gen blev analyseret i tre eksemplarer (n = 2, p 0,01).

Effekt af Wnt og mTOR-hæmmere alene og i kombination med erlotinib på H1975 celler

MTT celle levedygtighed blev udført til bestemmelse af hæmmende virkninger af Wnt inhibitor XAV939 og mTOR-hæmmer everolimus på H1975 celler.