PLoS ONE: Kræft-Forudsigelse genekspression Ændringer i tyktarmsslimhinde vestlige kost Fed MLH1 +/- Mice

Abstrakt

Kolorektal cancer (CRC) er den næsthyppigste årsag til kræft dødsfald i den vestlige verden og samspillet mellem genetiske og miljømæssige faktorer, herunder kost, er foreslået til at spille en afgørende rolle i dens ætiologi. Vi har udført en langsigtet fodringsforsøg i musen til at tage fat på genekspression og ændringer methylering opstår i histologisk normal colon mucosa som formodede kræft-disponerende arrangementer til rådighed for tidlig påvisning. Udtrykket af 94 vækstregulerende gener tidligere forbundet med menneskers CRC blev undersøgt på to tidspunkter (5 uger og 12 måneder) i den heterozygote

MLH1

+/-

mus, en dyremodel for human Lynch syndrom (LS), og vildtype

MLH1

+ /+

søskende, fodret af enten vestlig (WD) eller AIN-93G kontrol kost. Hos mus fodret med WD, proksimal kolon slimhinde, den dominerende sted for dannelse kræft hos LS, udviste et signifikant udtryk fald i tumorsuppressorgener,

DKK1, Hoxd1

,

Slc5a8

, og

Socs1

, de to sidstnævnte kun i

MLH1

+/-

mus. Reduceret mRNA-ekspression blev ledsaget af øget promotor methylering af de respektive gener. Den stærkeste udtryk fald (7,3 gange) sammen med en betydelig stigning i dets promotor methylering blev set i

DKK1

, en antagonist af den kanoniske Wnt signalvejen. Desuden inaktivering af

DKK1

synes at disponere til neoplasier i den proksimale colon. Dette og det faktum, at

MLH1

som viste kun beskedne methylering var stadig til udtryk i både

MLH1

+/-

og

MLH1

+ /+ Salg mus indikerer, at ekspressionen falder, og inaktiveringen af ​​

DKK1

i særdeleshed er en fremtrædende tidlig markør for colon onkogenese

Henvisning:. Pussila M, Sarantaus L, Dermadi Bebek D, Valo S, ReyhanI N, Ollila S, et al. (2013) Cancer-Forudsigelse genekspression Ændringer i tyktarmsslimhinde vestlige kost Fed

MLH1

+/- Mus. PLoS ONE 8 (10): e76865. doi: 10,1371 /journal.pone.0076865

Redaktør: Ajay Goel, Baylor University Medical Center, USA

Modtaget: Maj 22, 2013; Accepteret: August 28, 2013; Udgivet: 8 oktober 2013

Copyright: © 2013 Pussila et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Det Europæiske Forskningsråd (2008-AdG-232.635), The Sigrid Juselius Foundation (https://www.sigridjuselius.fi/foundation), finsk Cancer Organisationer (https://www.cancer.fi/da /), The Academy of Finland (https://www.aka.fi/eng), og Biocentrum Helsinki (https://www.helsinki.fi/biocentrum/). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kolorektal cancer (CRC) udvikler sig som en flertrinsproces, som kræver en række genetiske og epigenetiske ændringer. Processen fremskyndes i individer med nedarvet kræft disposition, og samspillet mellem genetiske og miljømæssige faktorer, herunder kost, synes at være i nøgleposition i sin ætiologi [1,2]. Betydningen af ​​epigenetiske ændringer såsom DNA methylering ændringer i indledningen af ​​CRC er nu anerkendt [3,4], endnu, de tidligste begivenheder i normal colon mucosa rådighed til tidlig opdagelse og forebyggelse af udvikling af kræft mangler at blive belyst.

Selvom arvelige mutationer i tumorsuppressorgen (GTS) APC (adenomatøs polypose coli), en vigtig komponent i Wnt /β-catenin-signalvejen, og mismatch repair (MMR) gener (f.eks

MLH1

, mutL homolog 1), der styrer mutation sats i en celle [2] kan give en høj levetid risiko for kræft med en tidlig alder ved debut, kolorektal cancer er helt klart en sygdom i stigende alder [3,4]. Derfor er der påvist methylering ændringer i en lille delmængde af GTS i den aldrende colon mucosa af normale sunde individer, og denne methylering indebærer gener, som ofte bliver mere væsentligt methylerede i neoplastiske celler [5-7], hvilket tyder på deres rolle i cancer initiering og progression. Sammen med ældning nogle exogene forbindelser fra kilder i kosten er vigtige modifikatorer af mønstre for methylering i colon [8], sandsynligvis forklarer, hvorfor den vestlige befolkning indtager betydelige mængder af rødt kød, mættet fedt og sukker, og kun moderate mængder af kostfibre, vitaminer og mineraler (f.eks calcium, folat, og vitamin D), samt plante afledt næringsstoffer viser de højeste CRC forekomster i verden [1] (World Cancer Research Fund, www.dietandcancerreport.org). Epigenetiske ændringer giver således en potentiel sammenhæng mellem ernæring og kræft [9], og understrege behovet for at belyse kosten virkninger på genregulering i tarmslimhinden.

Dyremodeller, især gnavere, giver en værdifuld ressource inden for miljø- epigenetik herunder undersøgelser af ændringer medieret gennem kosten [10]. Resultater tyder på, at vestlig kost (WD) inducerer gastrointestinale tumorer i musemodeller for familiær tarmkræft, og selv i vildtype (WT) mus uden nogen kræftfremkaldende behandling [11-14] fik os til at undersøge virkningerne af WD eksponeringer på gen regulering og methylering i normal colon mucosa med og uden arvet tyktarmskræft modtagelighed. Vi valgte 94 vækstregulerende gener tidligere knyttet til menneskelig CRC og studerede deres udtryk i den heterozygote

MLH1

+/-

mus analog til humant Lynch-syndrom (LS), og WT

MLH1

+ /+

søskende. Under en langvarig fodringsforsøg brugte vi vores egen modifikation af vestlig kost (WD *), som stærkt ligner New Western Diet (NWD) vist at inducere benigne og maligne neoplasmer i colon af normale C57BL /6-mus efter 18 måned fodringsforsøg [12]. Den væsentligste forskel mellem NWD og WD * er det fedt kilde, der i WD * blev i vid udstrækning ændret fra olie til dyr (mælk) fedt og dermed ligner mere fedt forbruges af vestlige befolkninger. Her, proximal colon, den dominerende sted for dannelse kræft i LS [15], afslørede adskillige signifikante aldersrelaterede ændringer i genekspressioner. Nogle ændringer blev forstærket af WD * og nogle blev kun fundet i mus med genetisk cancer prædisposition. Vi viste endvidere, at udtrykket ændringer detekteres fra histologisk normal slimhinde bemærkelsesværdigt var tidligt forekommende før

APC

inaktivering og den anden hit i

MLH1

.

Metoder

mus

Heterozygot B6.129-

MLH1

tm1Rak

mus (MLH1

+/-) (stamme 01XA2) blev opnået fra NCI -MMHCC; National Institutes of Health, Mouse Repository, NCI-Frederick, MD. I B6.129-

MLH1

tm1Rak

mus, er exon 2 mangler i en af ​​de to

MLH1

alleler, der fører til ikke-funktionelt MLH1 protein [16 ]. MLH1

+/- mus har en forøget morbiditet sammenlignet med deres WT samme kuld og cirka en tredjedel udvikle tumorer, såsom lymfomer samt tumorer i tynd- og tyktarmen og en række andre organer under deres levetid [17]. Den MLH1

+/- og MLH1

+ /+ mus blev genotype ved hjælp af genomisk DNA ekstraheret fra øremærker i henhold til protokollen offentliggøres i Mouse Repository hjemmeside (https://mouse.ncifcrf.gov/protocols.asp? ID = 01XA2 p_allele = MLH1% 3Ctm1Rak% 3E prot_no = 1) (Se materialer og metoder S1)

Etik erklæring

Mus blev avlet og behandles ifølge undersøgelsen protokol godkendt af. den nationale dyreforsøg Board i Finland (ESLH-2008-06.502 /Ym-23). Musene blev humant aflivet med CO2 inhalation.

Diæter

I en alder af 5 uger (tidspunkt 0, TP0),

MLH1

+ /-

MLH1

+ /+

mus blev tilfældigt opdelt i to kosten grupper (n = 8 /gruppe, herunder begge køn) fodret med AIN-93G ( AIN) kontrol kost [18] eller vestlig (WD *) kost (Harlan Teklad, Madison, WI) (tabel 1, detaljeret beskrivelse af kostvaner og deres ernæringsmæssige kompositioner er i tabel S1).

AIN93- g

WD *

Fat Kilder (g /kg)

en (g /kg)

bSoybean Oil70-vandfrit mælkefedt-133Canola Oil-55Sunflower Oil-12Carbohydrate SourcesStarch397306Maltodextrin13295Sucrose100116Protein Source200 ( Kasein) 232 (Casein, vitamin gratis) Samlet energiindhold (kcal /g) 3.84.6Kcal fra fedt (%) 17.239.2Kcal fra kulhydrater (%) 63.942.3Kcal fra protein (%) 18.818.5Vitamin D (IU /kg) 1000100Folic syre (mg /kg) 20.2Calcium50.5Table 1. kost ernæringsmæssige oplysninger.

for detaljeret sammensætning af de eksperimentelle diæter se tabel S1.

a Hvis ikke andet er angivet

b Hvis ikke andet er angivet CSV Hent CSV

Prøveforberedelse

Otte mus pr hver gruppe på TP0 (MLH1

+/-, MLH1

+ /+) og TP1 (12 måneder) (MLH1

+ /+ AIN, MLH1

+/- AIN, MLH1

+ /+ WD *, MLH1

+/- WD *) 48 mus i alt blev aflivet og stikprøven. Histologiske undersøgelser blev udført på The Finnish Center for Laboratory Animal Patologi (FCLAP), University of Helsinki, Finland.

For genomisk DNA og total RNA ekstraktioner, slimhinden (6 x 4 mm) blev adskilt fra den underliggende submucosa og muskulatur under et dissektionsmikroskop. Prøver til RNA-ekstraktion blev opbevaret i RNAlater (Qiagen, Valencia, CA) ved -80 ° C.

RNA-ekstraktion og revers transkription

De totale RNA-prøver blev fremstillet ved anvendelse af RNeasy Plus Kit ( Qiagen, Valencia, CA) med en ekstra DNase-behandling (Qiagen, Valencia, CA). RNA integritet blev analyseret med Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) og kun høj kvalitet RNA (RNA integritet nummer RIN 8) blev anvendt til cDNA syntesereaktioner, der blev kørt som dubletter og poolet til RT -qPCR reaktioner. Revers transkription fra enten 200 ng (individuelle prøver til StellARray) eller 1600 ng (puljer af otte prøver, 200 ng hver, fra otte forskellige mus for hvert TP1 gruppe for TaqMan RT-qPCR) af total RNA blev opnået med M-MuLV RNase H

+ (Thermo Scientific, Finland) eller Hævet III (Life technologies, Carlsbad, CA), henholdsvis ved hjælp af tilfældige primere ifølge producentens anvisninger.

RNA udtryk undersøgelser

RNA udtryk for histologisk normale vævsprøver fra proksimale colon mucosa blev analyseret ved hjælp af en kvantitativ skræddersyet StellARray

TM platform (Lonza Group Ltd, Bar Harbor BioTechnology). Den StellARray omfattede 94 gener (73 GTS) tidligere er forbundet med udvikling af kolorektal cancer og /eller dokumenteret at udstille CpG øen (CGI) hypermethylering i CRC og andre menneskelige kræftformer (tabel S2).

APC

indgik i array som en indikator for løbende carcinogenese. Otte mus fra hver studiegruppe blev hver analyseret for ekspression af de 94 gener af interesse (48 RT-qPCR arrays i alt).

Hver StellARray plade godt var lastet med 20 ul SYBR Green mester mix indeholder 8 pi prøve specifik cDNA og modificeret

Thermus brockianus

DNA-polymerase (Thermo Scientific, Finland). RT-qPCR arrays blev kørt på en Mx3000P variator (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) ved følgende cyklusparametre: 50 ° C i 2 min, 95 ° C i 7 min, 40 cyklusser af 95 ° C i 15 s, og 60 ° C i 1 min. Fluorescens data blev erhvervet under 60 ° C annealing /forlængelse trin. Primeren specificitet blev overvåget gennem en smeltekurveanalyse. Udtrykket forskelle mellem forskellige mus grupper blev analyseret ved hjælp af Global Pattern Recognition ™ (GPR) software (Bar Harbor Biotechnology, Trenton, ME)

Resultatet af statistisk signifikante udtryk ændringer i forhold til WD * og /eller arvet kræft disposition blev valideret på TP1 bruge TaqMan assays (tabel S3). I modsætning til StellARray RT-qPCR, blev TaqMan RT-qPCR-analyse sker fra samleprøve. Hver poolet prøve blev analyseret tre gange for målgener, såvel som de endogene reference- gener ved anvendelse af følgende cyklusparametre: 1 cyklus ved 95 ° C i 10 minutter, 40 cykler ved 95 ° C i 15 s, og 60 ° C i 1 min. Termisk cykling og erhvervelse fluorescens-data blev udført med en StepOnePlus cycler (Life Technologies, Carlsbad, CA) og CQ værdier blev kaldt ved hjælp af data-assistere v2.0 software (Life Technologies, Carlsbad, CA). De ensartet udtrykte reference- gener (

HDAC1

Stk4

) blev udvalgt ved hjælp af GeNorm algoritme [19] blandt de 94 gener indgår i StellARray.

MLH1

ekspressionsniveauerne ved TP0 blev også kvantificeret under anvendelse TaqMan assay.

Hvis mængden af ​​template var for lav til at give pålidelige resultater, blev RT-qPCR validering udføres ved hjælp af pre-forstærket cDNA. For hver TP1 gruppe, puljede prøver var multiplex pre-amplificeret under anvendelse af 16 ng cDNA med TaqMan PREAMP Master Mix Kit (Life Technologies, Carlsbad, CA) ved at følge producentens instruktioner. De cykliseringsparametre var som følger:. 1 cyklus af 95 ° C i 10 minutter og 10 pre-amplifikationscykler ved 95 ° C i 15 s, og 60 ° C i 4 min

DNA methyleringsanalyse

for DNA methylering analyse, kun de gener, der havde vist en signifikant mRNA udtryk fald (dvs. kandidat hypermethyleret GTS) i forbindelse med nedarvet disposition og /eller WD * blev udvalgt, og methylering niveauer af deres CpG øer (CGI’er) blev vurderet individuelt for hver TP0 og TP1 mus. Genomisk DNA for methylering analyse blev ekstraheret under anvendelse DNeasy Blood Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA) fra vævsprøver fra den umiddelbare nærhed af dem, der anvendes til RNA-ekspression studier.

Den kvantitative methylering analyse blev udført med Sequenom s MassARRAY EPITYPER

TM-system (Sequenom GmbH, Hamburg , Tyskland), som er en bisulfat-baseret teknologi bygger på basen-specifik spaltning af RNA og matrix-assisteret laser desorption ionisering time-of-flight massespektrometri (MALDI-TOF-MS) for at bestemme den relative udstrækning af methylering i DNA-fragmenter indeholdende enten en eller flere efterfølgende bindingssteder for CpG, som der henvises til som CpG enheder [20]. I massespektret, et distinkt signal mønster skyldes den methylerede og ikke-methylerede målsekvens, og EPITYPER software afgør de enkelte methylering ratioer (dvs. forhold signal intensitet som den procentdel af methylerede til ikke-methylerede signaler) til CpG sites /enhed i en målsekvens. Systemet kan detektere methylering niveauer så lave som 5%.

ampliconer blev primært udvalgt til at dække CGI’er kommenteret af UCSC genom browser og som sammenfald med transkriptionsstartstedet og 5′-UTR eller være i deres nærhed. I alt tolv forskellige amplikoner (længder mellem 174 og 499 bp) blev analyseret, hvoraf otte tilhørte prævalideret Mouse Standard EpiPanel og fire var skik DNA methylering analyser udformet ved hjælp Sequenom s EpiDESIGNER software (Sequenom GmbH, www.epidesigner.com), for hvilken primer sekvenser og target sites findes i tabel S4. For at reducere methylering variabilitet indført under PCR [21], blev tre gentagne amplifikationer udføres, og puljet til masse analyse. Den oprindelige data methylering blev filtreret af Sequenom at udelukke målinger dårlig kvalitet. CpG enheder der gav data i mere end 75% af prøverne bestået den indledende kvalitetskontrol. Fra disse blev prøver, der gav data i mere end 80% for alle CpG enheder inden en amplikon udvalgt til at prøve /amplicon par. For yderligere analyse, CpG enheder, som havde data for mindre end 50% af alle prøver og prøver, som havde data for mindre end 50% af alle CpG enheder blev udelukket. Efter kvalitetskontrol 78% af CpG enheder analyserede (152 ud af 196), og alle de 48 prøver blev inkluderet i yderligere analyse trin.

statistiske analyser

I StellARray RT-qPCR, en fælles tærskel blev sat på tværs af alle de 48 plader inden forsøget. Ekspressionsniveauerne forskelle mellem forskellige grupper blev analyseret under anvendelse af Global Pattern Recognition ™ (GPR) software, som udfører effektivitet korrektion og reference-genet og kontrolgruppen normalizations (www.bhbio.com/BHB/dw/products.gpr.html~~number=plural). GPR tager også fordel af biologiske gentagelser til at udtrække væsentlige ændringer i genekspression. Det StellARray Systemet virker ikke med brugerdefinerede reference- gener. I stedet GPR software algoritme bestemmer det bedste sæt referencestoffer gener i forsøget ved at sammenligne ekspressionen af ​​alle generne inkluderet i assayet mellem test- og kontrolprøver, genererer en global ekspressionsmønster ændringer, og skaber en prioriteret liste over betydelig ændringer [22]. På denne måde valget af reference- gener er unbiased, da det giver de eksperimentelle data til at definere de stabilt udtrykte reference- gener.

i TaqMan assays, blev relative mRNA-ekspression ændringer analyseret ved anvendelse af sammenlignende C

t (ΔΔC

t) metode, der præsenterer dataene som fold ændringer i genekspression normaliseret til endogene reference- gener og i forhold til kontrolgruppen [23]. Data-hjælpelys v2.0 software (Life Technologies, Carlsbad, CA) blev anvendt til kvalitetskontrol og normalisering af kvantificering cyklus (CQ) data, og en median permutation metode [24] blev anvendt til at bestemme betydningen af ​​udtrykket fold ændringer sammenlignet med kontrolgruppen med signifikansniveau på

P

0.05.

Sammenhængen mellem StellARray ekspressionsmønstre af 5 uger gamle

MLH1

+ /+

MLH1

+/-

mus blev undersøgt ved hjælp af Pearson korrelationsanalyse (

R Drømmeholdet værdi) i PASW Statistics 18-systemet.

Chipster software [25] blev brugt til at visualisere og analysere methylering data. Non-metrisk Multi-Dimensional Scaling (NMDS) værktøj blev anvendt til at producere todimensionale kort baseret på prøve forskellighed beregnet ved hjælp euklidiske afstand, og Dendrogrammet værktøjet blev brugt til at skabe dendrogrammer af prøver ved hjælp af normaliserede data med Pearson korrelation og gennemsnitlig kobling metode . For Chipster analyser, manglende methylering værdier af de enkelte CpG enheder blev defineret som medianværdien af ​​CpG enhed i den pågældende mus gruppen.

Sammenligning af de gennemsnitlige methylering niveauer mellem forskellige mus grupper blev udført ved hjælp af Mann-Whitney test af PASW Statistics 18-systemet.

Resultater

Colon neoplasier udvikler overvejende WD * mus

Samlet set en proksimal adenocarcinom og fem adenomer /hyperplastiske polypper blev observeret i 32 mus ved TP1. Betydningen af ​​WD * på CRC risiko i vores muse-serien er fremhævet af den kendsgerning, at 5 ud af 6 mus med neoplasier blev fodret med WD * og at WD * forårsagede tumorudvikling også i vildtypemus uden nedarvet disposition, dvs. den eneste karcinom og én adenom blev fundet i

MLH1

+ /+

WD * mus (tabel 2, figur S1). Den enkelte AIN fodret mus udvikler neoplasi (hyperplastisk polyp) var en mutation luftfartsselskab.

Mus Group

DKK1

udtrykt (n = 16)

DKK1

ikke udtrykkes ( n = 16)

MLH1

+ /+

AIN62

MLH1

+/-

AIN3

a5

MLH1

+ /+

WD * 4

b4

c

MLH1

+/-

WD * 35

a, b, bdTable 2.

DKK1

inaktivering og colon neoplasier i forskellige mus grupper

en hyperplastisk polyp.;

b adenom;

c adenocarcinom;

d ikke histologisk bekræftet CSV Hent CSV

MLH1

+/- og MLH1

+ /+ mus viser lignende mRNA ekspressionsmønstre i starten

I begyndelsen af ​​den eksperimentelle fodring periode (TP0), den MLH1

+/- og MLH1

+ /+ mus viste en bemærkelsesværdig god korrelation (Pearsons

R

= 0,989,

P

0,01) mellem mRNA ekspressionsmønstre for de 94 gener indeholdt i den tilpassede StellARray RT-qPCR array (figur S2A). Imidlertid adskiller sig fra de andre gener, men i overensstemmelse med de forskellige genotyper, ekspressionen af ​​

MLH1

var ca. 50% lavere i den heterozygote mus end i WT-mus (Figur S2B). Samlet set en isogen baggrund i starten gjorde det berettiget at ræsonnere, at udtrykket forskelle, der ville blive vist mellem de forskellige mus grupper senere blev erhvervet, og ikke resultatet af nedarvede genetiske konstitution.

WD * og /eller arvet disposition er forbundet med differentiel ekspression af flere gener ved TP1

i en alder af 12 måneder (TP1), viste sig at blive forøget ekspression af flere gener eller nedsættes i forhold til TP0 (tabel 3 og 4). Alle GPR resultater (

P

-værdier og fold ændringer) af udtryk forskelle mellem forskellige mus grupper for alle de 94 gener er i tabel S5. Ni ud af de 94 gener viste statistisk signifikant (

P

0,05) udtryk ændringer mellem TP0 og TP1 i alle mus grupper (MLH1

+ /+ AIN, MLH1

+/- AIN, MLH1

+ /+ WD *, MLH1

+/- WD *) (tabel 3). Nedsat mRNA-niveauer blev set i

CCND1

(cyclin D1),

CDH1

(Cadherin 1), og

Mal

(Myelin og lymfocyt-protein, T-celledifferentiering protein), mens øget ekspression blev set i

Axin2

,

Cdx1

(Caudal typen homeobox 1),

Fzd10

[Frizzled homolog 10 (

Drosophila

)],

Mbd2

(Methyl-CpG bindende domæne protein 2),

Mbd4

(Methyl-CpG bindende domæne protein 4), og

Rasgrf2

(Ras-protein-specifik guaninnukleotidbindende frigivende faktor 2). Da disse ændringer ikke afhænge af nedarvet disposition eller WD * de kan tilskrives aldring.

MLH1

+ /+

AIN

MLH1

+/-

AIN

MLH1

+ /+

WD

MLH1

+/-

WD

nedreguleret GenesFold Change (

P

) Fold Change (

P

) Fold Change (

P

) Fold Change (

P

)

CCND1

3,3 (0,003) 3.8 (0.000) 4,3 (0,001) 3,6 (0,000)

CDH1

5,4 (0,002) 4,9 (0,000) 5,9 (0,002 ) 8.4 (0.000)

Mal

3.4 (0,025) 3.4 (0,014) 3,2 (0,034) 2,7 (0,028) opreguleres GenesFold Change (

P

) Fold Change (

P

) Fold Change (

P

) Fold Change (

P

)

Axin2

2,6 (0,005) 3,0 (0,002) 1,8 (0,039) 1,6 (0,028)

Cdx1

4,1 (0,002) 5.6 (0.000) 3,4 (0,002) 5.4 (0.000)

Fzd10

4,8 (0,002) 7.6 (0.000) 3,4 (0,021) 5,0 (0,000)

Mbd2

3.3 (0,004) 4,7 (0,000) 3,2 (0,003) 5,7 (0,000)

Mbd4

3,0 (0,005) 6.0 (0.000) 3,0 (0,004) 3,3 (0,000)

Rasgrf2

2.3 (0,002) 1.8 (0,006) 2.3 (0.001) 1,5 (0,040) tabel 3. Gener viser statistisk signifikant (

P

0,05) mRNA-ekspression forskelle mellem TP0 og TP1 i alle fire mus grupper; i kontrolgruppen (MLH1

+ /+ AIN) og de tre studiegrupper (MLH1

+/- AIN, MLH1

+ /+ WD, MLH1

+/- WD).

CSV Hent CSV

MLH1

+ /+

AIN

MLH1

+/-

AIN

MLH1

+ /+

WD

MLH1

+/-

WD

nedregulere GenesFold Change (

P

) Fold Change (

P

) Fold Change (

P

) Fold Change (

P

)

DKK1

2,0 (0,110) 5,1 (0,012) 6.2 (0,003) 7,3 (0,003)

Slc5a8

1,3 (0,078) 1,7 (0,041) 1,3 (0,224) 1,5 (0,032)

Hoxd1

1,1 (0,348 ) 2,0 (0,075) 2,1 (0,019) 1,5 (0,191)

Socs1

1.6 (0.460) 2,7 (0,067) 1,0 (0,485) 3,1 (0,026) opreguleres GenesFold Change (

P

) Fold Change (

P

) Fold Change (

P

) Fold Change (

P

)

DKK2

2,2 (0,108) 2,2 (0,037) 1,7 (0,329) 1,0 (0,637)

RPRM

1,4 (0,442) 2,0 (0,017) 1,1 (0,725) 3,3 (0,019)

Acaa1b

2,4 (0,120) 1,8 (0,140) 3,5 (0,124) 9.4 (0.000) tabel 4. Gener viser statistisk signifikant (

P

0,05) mRNA ekspression forskelle mellem TP0 og TP1 i mindst én af de studiegrupper, men ikke i kontrolgruppen (MLH1

+ /+ AIN).

CSV Hent CSV

Statistisk signifikante udtryk ændringer mellem TP0 og TP1 forbundet med nedarvet cancer prædisposition (MLH1

+/-) og /eller WD * blev observeret i syv gener (tabel 4, tabel S5); faldt udtryk i

DKK1

[Dickkopf homolog 1 (

Xenopus laevis

)]

, Slc5a8

[(opløst stof carrier familie 5 (iodid transporter), medlem 8]

, Hoxd1

(Homeoboxen D1), og

Socs1 Hotel (Suppressor af cytokin signalering 1), og forøget ekspression i

DKK2

[Dickkopf homolog 2 (

Xenopus laevis

)],

RPRM

(Reprimo, TP53 afhængig G2 anholdelse mægler kandidat), og

Acaa1b

(acetyl-coenzym A acyltransferase 1B).

Den stærkeste udtryk fald (7,3 fold) blev set i Wnt signalering suppressor gen

DKK1

blandt MLH1

+/- mus fodret med WD *. i heterozygote mus fodret med AIN og i WT mus fodret med WD *, var nedgangen 5.1 og 6.2 gange. Interessant, homeobox genet

Hoxd1

viste en aldersrelateret udtryk fald (2,1 gange) kun i MLH1

+ /+ WD * gruppe, og statistisk signifikant fald relateret til WD * blev yderligere observeret, når denne gruppe blev sammenlignet med kontrolgruppen (

MLH1

+ /+

AIN) på TP1 (1,9 gange) (tabel S5). Udtrykket fald i transportør af butyrat

Slc5a8

forbundet kun med

MLH1

heterozygositet (1,5 og 1,7 gange i WD * og AIN-grupper, henholdsvis), mens

Socs1

, et cytokin signalering regulator, var væsentligt ned reguleret (3,1 gange) kun hvis begge risikofaktorer var til stede, dvs. i

MLH1

+/-

WD * gruppe.

udtryk for

DKK2

, anden Wnt signalering modulator, blev øget betydeligt i MLH1

+/- AIN gruppe (tabel 4), således at der på TP1,

DKK2

udtryk blandt MLH1

+/- mus var signifikant lavere (2,2 gange) i WD * gruppen sammenlignet med AIN gruppen (tabel S5).

RPRM

viste en statistisk signifikant aldersrelateret udtryk stigning i forbindelse med

MLH1

heterozygositet (3.3 og 2.0. Fold i WD * og AIN henholdsvis).

Acaa1b

viste en signifikant udtryk stigning i MLH1

+/- WD * mus (9,4 gange), og ekspressionsniveauerne viste en signifikant forskel (5,0 gange), når

MLH1

+/-

WD * mus sammenlignet med

MLH1

+/-

AIN gruppe på TP1 (tabel S5).

Der var ingen ledige vævsprøver /uddragene validere resultaterne på proteinniveau. Derfor blev TaqMan RT-qPCR bruges til at validere udtryk ændringer i forbindelse med kræft-disponerende

MLH1

mutation og /eller WD *. Den isogen baggrund og vores egne resultater, at mus viste lignende mRNA ekspressionsmønstre fra starten (figur S2A, S2B) gjorde det berettiget at kombinere de enkelte prøver (n = 8) fra hver gruppe i puljer til en efterfølgende brug i validerings- eksperimenter. Figur 1 illustrerer forskelle observeret mellem de studiegrupper og gruppen kontrol ved TP1.

Relativ udtryk i forskellige studiegrupper (MLH1

+/- AIN, MLH1

+ /+ WD *, og MLH1

+/- WD *) sammenlignes med kontrolgruppen (MLH1

+ /+ AIN). Hver prøve er en blanding af otte RNA-prøver fra otte forskellige TP1 mus tilhører hver mus gruppe. Dataene er angivet som middelværdi ± SEM (standard error af middelværdien) (n = 3), * signifikant forskel sammenlignet med kontrolgruppen. Median permutation metode,

P

0,05. (A)

MLH1

viser samme 50% ekspression forskel mellem genotyperne som ved udgangspunktet for undersøgelsen. (B)

DKK1

signifikant nedreguleret i studiegrupperne med WD * og /eller

MLH1

heterozygoti. (C)

Slc5a8

viser ikke signifikante udtryk forskelle på TP1. (D)

Hoxd1

er nedreguleret i samarbejde med WD * i begge genotyper nedreguleringen er særlig stærk i MLH1

+ /+ WD-gruppen. (E)

Socs1

viser ikke signifikante udtryk forskelle på TP1. (F)

DKK2

er nedreguleret i samarbejde med WD * i begge genotyper.

De TaqMan analyser bekræftede den observation, at

DKK1

er en af ​​de mest fremtrædende kandidater med udtryk i colon mucosa ændret i forbindelse med nedarvet kræft disposition og WD *. På grund af de lave niveauer af

DKK1

mRNA, RT-qPCR blev udført på forhånd forstærket cDNA (forstærkning ensartethed værdi på -0,76).

DKK1

mRNA niveauer blev faldt betydeligt sammenlignet med kontrolgruppen (

MLH1

+ /+

AIN) i alle studiegrupper [MLH1

+ /+ WD *, 1,5 gange (interval, 1,4-1,7); MLH1

+/- AIN, 1,4 (1,3-1,5); MLH1

+/- WD *, 1,2 (1,1-1,2)] (figur 1B). Udtrykket af

Hoxd1

blev signifikant reduceret ikke kun i MLH1

+ /+ WD * mus [1,9 (1,7-2,2)], en konstatering allerede observeret i StellARray, men også i MLH1

+/- WD * gruppe [1,3 (1,2-1,3)] (Figur 1D), fremhæver virkningen af ​​WD * på

Hoxd1

udtryk. Den TaqMan RT-qPCR bekræftede også betydningen af ​​WD * på ekspressionen af ​​

DKK2

, hvor i StellARray et statistisk signifikant fald blev set i MLH1

+/- WD * mus [1.2, (1,2 1.3)], men nu også i WT mus fodret med WD * [1,2 (1,2-1,3),

P

= 0,053] (figur 1F). Udtrykket af

Acaa1b

viste sig også at være signifikant øget både i MLH1

+/- WD * og MLH1

+ /+ WD * mus [2,6 (2,3-2,8) og 1,7 ( 1,7-1,8), henholdsvis] (fig S3). Ekspressionsniveauerne af

Slc5a8

Socs1

afveg ikke mellem kontrolgruppen og studiegrupperne (figur 1C, E).

Især ingen signifikant alder eller kost relaterede ændringer udtryk blev fundet i

Apc

eller

MLH1

. Ligesom i starten, udtryk for

MLH1

var ca. 50% lavere i heterozygote mus sammenlignet med WT mus, hvilket indikerer, at den anden inaktiverende ramt af

MLH1

endnu ikke havde fundet sted ved TP1 ( Figur 1A). Udtrykket af

Apc

var ens i begge genotyper (StellARray).

Væsentlige stigninger i DNA methylering niveauer ledsage reduceret ekspression af gener

De methylering niveauer i CGI’er af gener, der havde vist statistisk signifikant fald i mRNA-ekspression i forbindelse med

MLH1

heterozygositet og /eller WD * (

DKK1, Slc5a8, Hoxd1

, og

Socs1

; tabel 4 ) blev analyseret individuelt for hver TP0 og TP1 mus ved hjælp Sequenom s MassARRAY EPITYPER

TM system. Derudover

MLH1

, og

Sfrp1

som havde vist aldersrelateret udtryk fald i borderline signifikans (1,4 fold,

P

= 0,06) i MLH1

+ /- WD * gruppe (tabel S5) og er en velkendt gen i CRC og Wnt-signalering blev undersøgt for methylering. 0,05.