PLoS ONE: Novel Molekylær Tumor Cell Markers i regionale lymfeknuder og blodprøver fra patienter, der gennemgår kirurgi for ikke-småcellet lungekræft

Abstrakt

Introduktion

De seneste oplysninger tyder på, at mikroskopiske lymfeknudemetastaser og cirkulerende tumorceller kan have klinisk betydning i lungekræft. Formålet med denne undersøgelse var at identificere nye molekylære markører for tumorceller i regionale lymfeknuder (LNS) og perifert blod (PB) fra patienter med ikke-småcellet lungekræft (NSCLC).

Metoder

Kandidat markører blev udvalgt baseret på digital udskrift profilering og tidligere litteratur.

KRT19

,

CEACAM5

,

EPCAM, DSG3, SFTPA, SFTPC

SFTPB

mRNA niveauer blev oprindeligt godkendt af real-time revers transkription PCR- baseret kvantificering i 16 NSCLC tumorer og 22 LN og 12 PB prøver fra personer uden kendt kræft. Fem af kandidatlandene markører blev udvalgt til sekundær validering af kvantificering i parallelle tumorbiopsier, regionale LN og PB prøver fra 55 patienter, der gennemgår operation for NSCLC. LN og PB markør status blev sammenlignet med klinisk-patologiske patientdata.

Resultater

Alle valgte markører undtagen DSG3 var til stede ved høje niveauer i de primære tumorer og ved meget lave eller ikke-påviselige niveauer i normal LN og PB i den første runde af validering, hvilket indikerer et potentiale for at detektere tumorceller i NSCLC patienter. Udtrykket profiler af

KRT19

,

CEACAM5, DSG3, SFTPA

SFTPC

mRNA blev bekræftet i den større gruppe under den sekundære validering. Brug den højeste normale LN for hver markør som tærskel, 39 (71%) af de 55 patienter havde forhøjede niveauer af mindst én markør i regionale LN. Tilsvarende 26 (47%) patienter havde forhøjede niveauer af mindst en markør i PB. En signifikant større antal patienter med adenokarcinomer havde positive LN status for disse markører, sammenlignet med andre histologiske typer (P = 0,004).

Konklusioner

Flere lovende molekylære tumor celle markører i de regionale LN og PB blev identificeret, herunder de nye

SFTPA

og

SFTPC

mRNA. Klinisk opfølgning i en større kohorte er nødvendig for at belyse deres prognostiske værdi

Henvisning:. Nordgård O, Singh G, Solberg S, Jørgensen L, Halvorsen AR, Småland R, et al. (2013) Novel Molekylær Tumor Cell Markers i regionale lymfeknuder og blodprøver fra patienter, der gennemgår kirurgi for ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 8 (5): e62153. doi: 10,1371 /journal.pone.0062153

Redaktør: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Spanien

Modtaget: December 3, 2012; Accepteret: 18 Marts 2013; Udgivet: 3 maj 2013

Copyright: © 2013 Nordgård et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en) sydøstlige Norge Regional Health Authority og 2) Folke Hermansen Fund. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er den hyppigste årsag til kræft død på verdensplan [1]. Prognosen er bedst for patienter med små tumorer og ingen mediastinale eller fjernmetastaser. Patienter med ipsilaterale hilar lymfeknudemetastaser kan modtage kirurgi, hvis ellers passer. Det TNM-systemet er bredt accepteret for prækirurgisk klassifikation [2], og guider yderligere behandling.

Mange patienter med små tumorer og ingen synlige lymfe-node metastaser vil stadig bukke under for sygdommen. De fem-års overlevelse hos patienter med lokaliseret sygdom er 50% hos kvinder og 41% hos mænd [3]. Dette indikerer, at en undergruppe af patienter med små tumorer havde metastatisk spredning før kirurgi, og at aktuelt tilgængelige fremgangsmåder til identifikation sådant spread har svigtet. Ved at identificere resterende kræftceller, kunne udvalgte patienter modtager adjuverende behandling for at udrydde kræftcellerne ikke fjernet ved operation.

Flere projekter har til formål at finde markører til at identificere mikrometastaser og resterende kræftceller, enten som tumorceller i blodet , lymfeknuder (LN) eller knoglemarv, eller som RNA eller proteiner fra cancerceller i blod, linje eller knoglemarv [4], [5]. Fælles teknologier til påvisning metastaser indbefatter revers transkription polymerasekædereaktion (RT-PCR), immunocytokemi og immunohistokemi. identifikation Tumor celle ved den CellSearch systemet (baseret på immunomagnetisk berigelse og immunofluorescens) eller filtrering procedurer er udført både i en generel lungekræft-befolkning [5], [6] og i patienter, der gennemgår specifik behandling i et klinisk forsøg [7] . Kvantitativ RT-PCR-analyse af lymfeknudeceller lysater menes at være en mere følsom teknik i forhold til immunhistokemi, og denne fremgangsmåde tillader undersøgelse af hele LN snarere end kun udvalgte sektioner. Blodprøver kan også vurderes ved RT-PCR til påvisning af metastatisk sygdom, og ville være den mindst invasive af metoderne til identifikation metastatiske celler.

Flere forskellige proteiner og transkripter er blevet undersøgt til tumor cellemarkører i blod og LN. MRNA’erne for epitel-specifik cytokeratin (CK) 19 og 7, er blevet foreslået som markører for mikroskopisk lymfatisk spredning [8]. Angivelse af

SFTPB, TACSTD1

, og

PVA

har vist lovende sammenfald med lymfeknudemetastaser [9], og

CEACAM5

PLUNC

til udtryk i lymfeknuder blev evalueret med RT-PCR, afslører en korrelation med overlevelse [10].

CEACAM5

mRNA-niveauer i lymfeknuder viste en forening med overlevelse i en kinesisk undersøgelse af NSCLC-patienter [11]. Resultaterne har afveget, både med hensyn til afsløring satser og klinisk effekt, muligvis på grund af forskelle i metode og stikprøvestørrelser.

I denne undersøgelse analyserede vi flere formodet interessante markører i LN og i perifert blod (PB) fra patienter med tidligt stadium lungekræft undergår kirurgi. Vi sammenlignede udtryk for de forskellige markører i tumorer, de LN, og PB prøver i relation til patientens kliniske karakteristika.

Materialer og Metoder

Patienter

Patienter indlagt på Oslo University Hospital – The National Hospital for kirurgisk behandling af histologisk verificeret ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) blev rekrutteret fremadrettet for undersøgelsen i perioden 2009 til 2010. Tumorer fra patienter blev inkluderet i biobanken afhængigt af studiet sygeplejerske tilgængelighed, og ca. 53% af det samlede antal lunge kræftpatienter kirurgisk behandlet i denne periode blev medtaget. klassificering Baseline efter alder, køn, rygning status, scene (TNM-7-klassificering) og histologi er vist i tabel 1. Median alder var 66,5 år.

Etik Statement

projektet blev godkendt af den norske Radium Hospital Institutional Review Board og det regionale etiske komité Sydøst (tilladelse nummer: S-05307). Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra hver deltager.

Prøver

Alle tumorbiopsier blev taget fra formentlig afgørende tumorvæv. I mindre tumorer uden tegn på nekrose blev prøverne taget fra den centrale del af tumoren. I større tumorer med tegn på central nekrose blev prøverne taget fra flere perifere dele af tumoren. blev gjort en indsats for at tage rent tumorvæv, uden omgivende lungevæv.

LN stikprøver i de fleste tilfælde blev udført i henhold til European Society of thorax kirurger (EST) retningslinjer [12]. Prøverne blev hovedsageligt taget fra det forventede dræning tumorområdet. Enkelte undtagelser fandt sted i situationer, hvor kirurgen mistanke patologi i andre LN-stationer.

En til fire hilar LN blev dissekeret fra de kirurgiske eksemplarer af alle patienter, der forlader halvdelen noden for rutinemæssig patologisk gennemgang og den ene halvdel for molekylær analyser. Både tumorvævet og lymfeknuder var snap-frosset i flydende nitrogen i operationsstuen, og opbevaret ved -80 ° C indtil RNA-isolering. Indholdet tumorcelle i tumorprøver var mere end 70% i de fleste prøver.

Seksten cancer-fri LN fra 8 patienter, der gennemgår kirurgi for godartede kolon sygdomme og 6 LN fra 6 patienter, der gennemgår kirurgi for godartede lungesygdomme var indsamlet som normalt LN referencemateriale.

for alle patienter 2,5 ml blod blev opsamlet i PAX-rør før operation for RNA konservering. Blodprøverne blev hentet fra en venøs havn, og prøverne trukket til forskning var ikke den første; derfor var usandsynligt epitelial forurening celle. Perifere blodprøver blev også opnået fra 12 raske kontroller.

RNA Extraction

LN og tumorvæv var homogeniseret og lyseret, og RNA blev ekstraheret under anvendelse af TRlzol (Invitrogen).

for blodprøver blev PAXgene blod RNA rør optøet ved stuetemperatur natten over. Totalt RNA blev isoleret ved anvendelse af PAXgene Blood miRNA Isolation Kit ifølge producentens instruktioner. RNA mængde og renhed blev vurderet ved hjælp af NanoDrop ND-1000 spektrofotometer (ThermoFisher Scientific, Wilmington, Delaware, USA). RNA kvalitet blev kontrolleret af Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA).

DNAse Behandling og Reverse Transcription

RNA blev DNAse behandlet ved at inkubere 500 ng total RNA fra hver prøve med 1 enhed RQ1 RNAse-fri DNAse (Promega) i et samlet volumen på 10 l 1 × First Strand Synthesis buffer (Invitrogen) indeholdende 10 enheder RNAseOUT RNAse inhibitor (Invitrogen). Reaktionsblandingen blev inkuberet ved 37 ° C i 30 minutter, og DNAse inaktiveres ved tilsætning af 1 l RQ1 stopopløsning og inkubering i 10 minutter ved 65 ° C. Komplementært DNA blev syntetiseret fra DNAse-behandlet RNA af M-MLV revers transkriptase i et totalt volumen på 20 l ifølge fabrikantens protokol (Invitrogen).

PCR primere Salg

Mindst én af PCR-primerne i hvert primerpar er designet til at spænde over exon /exon-grænser eller de var designet til at binde til forskellige exoner. Identiteten af ​​de evaluerede markør udskrifter og primersekvenserne er anført i tabel 2.

Kvantitativ PCR Salg

PCR-amplifikationer blev udført med qPCR SYBR Green Core kit (Eurogentec) ifølge fabrikantens anbefalinger. Revers transkriberet RNA (20 ng) blev amplificeret i et samlet volumen på 25 l indeholdende 1 × reaktionsbuffer, 0,2 mM dNTP, 0,75 l 1:200 SYBR Green I fortyndet i DMSO og MgCl, frem og bak primerkoncentrationer som vist i Tabel 2. termocykling og tidstro fluorescensmålinger blev udført i en Mx3000P real-time PCR instrument (Stratagene), med et aktiveringstrin på 10 minutter ved 95 ° C efterfulgt af 40 cykler af 30 sekunder ved 95 ° C og 60 sekunder ved 60 ° C. Efterfølgende blev PCR-produkter analyseret ved smeltekurver. Alle smeltekurver afslørede veldefinerede toppe med den forventede smeltetemperaturer, hvilket bekræfter specificiteten af ​​primerne under reaktionsbetingelserne. Amplikon identiteter blev også bekræftet ved sekventering. Reaktion set-up, skabelon tilsætning og termocykling blev udført i tre separate, dedikerede rum. Controls, der ikke indeholder skabelon blev inkluderet i hver kørsel for at overvåge potentiel forurening.

Relative niveauer af hver markør mRNA blev bestemt ved normalisering mod BCR henvisningen udskrift og en kalibrator prøve indgå i alle løb, ved hjælp af modellen [13] , [14]. Den kalibrator prøve blev fremstillet ved at blande RNA fra NCI-H441 (European Collection of Cell Cultures) cellelinie (50%) og to NSCLC tumorer (25% hver), valgt på grund af høje niveauer af alle potentielle markører. Reproducerbarheden af ​​analyserne blev bestemt ved at måle den samme referenceprøven i fem på hinanden eksperimenter. Koefficienterne af varians bestemt var 7,5%, 9,6%, 6,1%, 7,3% og 8,1% for

CK19

,

CEACAM5, DSG-3, SFTPA

, og

SFTPC Salg assays henholdsvis. Tærskelværdier for positivitet af hver markør i blod og lymfe blev sat til det højeste niveau i normale LN og PB prøver.

real-time PCR kvantificering blev udført af to personer (GS og ON), som blev blindet til de særlige kendetegn ved de patienter og primære tumorer.

Bioinformatik Marker Searches

udtrykt sekvens tag biblioteker (EST) og seriel analyse af genekspression (SAGE) biblioteker blev søgt efter kandidat markører af cDNA og SAGE digital genekspression displayer (DGED) værktøjer på Cancer Gene Anatomi Project (CGAP) webside (www.ncbi.nih.gov/cgap). I detaljer blev alle tilgængelige EST biblioteker fra normal voksen lungevæv og lungekræft (pool A) sammenlignet med biblioteker fra normale LN og normale mononukleære celler fra perifert blod (pool B). Den DGED værktøj producerede en scoring liste af gener bestilt efter udtryk niveauforskelle mellem de to bibliotekets pools, beregnet for hver udskrift som forholdet mellem sekvenser i pulje A versus pool B. SAGE DGED søgninger blev gjort på samme måde. Udskrifter med bopæl i toppen af ​​både high-score lister (EST og SAGE DGED) blev valgt til yderligere karakterisering. Høje niveauer i mange af puljen et biblioteker blev foretrukket til ekstremt høje niveauer i et begrænset antal af dem.

Statistisk analyse

mRNA niveauer blev normalt ikke fordelt og blev sammenlignet ved anvendelse af Mann-Whitney U test. Kategoriske data blev sammenlignet under anvendelse af Fishers eksakte test. Principal komponent analyse [15] blev udført af

prcomp

funktion i R [16], skalering de variabler, der har enhed varians før analysen. To-sidet statistiske test blev udført og p-værdier P0.05 blev betragtet som statistisk signifikant. Alle beregninger blev udført med R softwarepakke (www.r-project.org) version 2.13.1.

Resultater

Valg og Validering af kandidatlandene Markers

Vi systematisk søgte udtrykt sekvens tag (EST) og seriel analyse af genekspression (SAGE) biblioteker for mRNA’er der var potentielle markører for tumorceller i lymfeknuder (LN) og perifert blod (PB) fra NSCLC-patienter. Kandidat markører blev scoret efter forskellen ekspressionsniveauet mellem lungekræft og normal LN /PB. Fra listen over udskrifter med højeste score, valgte vi keratin 19 (

KRT19

), carcinoembryonisk antigen-relateret celleadhæsionsmolekyle (

CEACAM5

), epitelial celleadhæsionsmolekyle (

EPCAM

), overfladeaktive proteiner A (

SFTPA

) og C (

SFTPC

) for yderligere validering som kandidat markører.

KRT19, CEACAM5

EPCAM

mRNA var blevet rapporteret tidligere så lovende tumor celle markører i LN fra NSCLC patienter [17], mens

SFTPA

og

SFTPC

var nye gener i denne sammenhæng. Baseret på tidligere litteratur, vi også valgt desmoglein 3

DSG3

Surfaktantprotein B (

SFTPB

) mRNA for yderligere validering [17]. Tensidproteiner er væsentlige komponenter i det pulmonale overfladeaktive fluid, hvilket er vigtigt for funktionen og homeostase af lungen alveoler. SFTPA er primært involveret i forsvaret mod respiratoriske patogener [18], mens SFTPB og SFTPC opretholde præcise tilstand af lipid overfladeaktive film [19].

Som et første validering af de 7 ansøgerlande markører, vi målte deres niveauer i 16 NSCLC tumorbiopsier, 22 kræft-fri LN og 12 normale kontrol PB prøver ved kvantitativ RT-PCR (figur 1). Bortset fra

DSG3

, niveauet for alle markører var meget højere i tumorer sammenlignet med kontrollen LN og PB (P0.001).

CEACAM5

SFTPC

mRNA var målbart i normale blodprøver. Interessant niveauet af

SFTPA

mRNA i de 6 kontrol LN fra lunger var signifikant højere end i kontrolgruppen LN fra colon mesenteriet (P = 0,002). En tilsvarende tendens, men ikke statistisk signifikant, blev også observeret for

SFTPB

og

SFTPC

, men ikke for de resterende kandidatlande markører.

Median værdier er angivet med kort horisontale linjer, mens prøver med niveauer under detektionsgrænsen (LOD) er angivet nedenfor den stiplede vandrette linje. Niveauerne af de forskellige markører er i forhold til en kalibrator prøve og ikke direkte sammenlignelige.

Vi beregnede specificitet indekser for hver markør ved at dividere den mediane tumor for hver markør ved det højeste niveau i normale kontrol LN og PB prøver (data ikke vist) [20]. De tre højeste specificitet indekser blev opnået for

SFTPB

,

CEACAM5

, og

SFTPA

(faldende) i LN og for

SFTPA

,

KRT19

, og

SFTPB

i PB. Specificitet indekser for

CEACAM5

SFTPC

i blod kunne ikke beregnes på grund af målbart markør niveauer i normalt blod. Vi konkluderede, at alle evaluerede kandidater undtagen

DSG3

syntes at have et godt potentiale som tumor celle markører i patientens LN og PB prøver, i henhold til udtryk niveauforskelle mellem tumorer og prøven type interesse.

specifikke epiteliale mRNA’er kan nedreguleres i delmængder af tumorer, hvilket reducerer deres anvendelighed som metastase markører i de tilsvarende patienter. Derfor udførte vi principalkomponentanalyse af markør niveauer i 16 undersøgte NSCLC-tumorer for at identificere covariations. De to første hovedkomponenter forklarede 62% af variansen i datasættet. En biplot af de oprindelige variabler (relativ mRNA koncentrationer) og tumor prøver projiceret op de to første hovedkomponenter viste, at

SFTPA

,

SFTPB

og

SFTPC

mRNA niveauer blev korreleret med hinanden (pile peger i samme retning), hvorimod

EPCAM

CEACAM5

KRT19

mRNA også covariated (figur 2). For at vælge et sæt af kandidat markører optimalt dækker spektret af NSCLC kræftformer, valgte vi to markører fra hver af disse samvariation grupper til yderligere validering i tillæg til

DSG3

, som syntes at have en uafhængig primær tumor udtryk mønster. Den resulterende markørpanel bestod af

KRT19

,

CEACAM5

,

DSG3

,

SFTPA

, og

SFTPC

mRNA.

de sorte cirkler viser stikprøvedataene projiceret op på første og anden hovedkomponenter. De røde pile viser de gamle variable akser forventede til hovedkomponenterne.

Marker Niveauer i tumorer, LN, og blodprøver fra NSCLC patienter

For yderligere at validere de 5 markører i raffineret panel, vi bestemt deres relative niveauer i tumorer (herunder 16 fra den indledende validering), regionale LN og PB prøver fra 55 NSCLC patienter, der gennemgår kirurgisk behandling (figur 3). I alt 84 LN fra de 55 patienter blev undersøgt (middel 1,5 LN /patient, interval 1-3). Nogle af patienternes LN og PB prøver havde forhøjede niveauer i forhold til de normale kontroller. Imidlertid markør niveauer i LN hentet fra patienter med positiv knude status (pn +) ifølge rutinemæssige histologisk vurdering var ikke signifikant forskellig fra de andre LN, selv om der var klare tendenser for nogle af markørerne (data ikke vist). Vi anvendte det højeste normale niveau for hver markør som en tærskel til at definere patologi i LN og Pb prøver, da forhøjede niveauer mest sandsynlige var på grund af tilstedeværelsen af ​​tumorceller. Baseret på disse tærskler, vi bestemt antallet af patienter positive for hver tumorcellemarkøren i LN og PB prøver (tabel 3). I alt 39 (71%) af de 55 patienter var positive for mindst én markør i de undersøgte LN, mens 26 (47%) af patienterne havde positive PB prøver. For LN, alle fem markører bidrog væsentligt til identifikation af patienter med molekylær tegn på LN-metastaser. I PB prøver,

KRT19

mRNA spillede en fremtrædende rolle i at identificere potentielle cirkulerende tumorceller. Betydelig overlapning mellem de forskellige markører blev observeret. Der var ingen statistisk signifikant sammenhæng mellem LN og PB markør status.

Median værdier er angivet med korte vandrette linier, mens prøver med niveauer under detektionsgrænsen (LOD) er angivet nedenfor den stiplede vandrette linje. Niveauerne af de forskellige markører er i forhold til en kalibrator prøve og er ikke direkte sammenlignelige.

Sammenligning med klinisk-patologisk data

molekylært bestemt LN og PB tumor celle status og klinisk-patologisk patientdata (tabel 1) blev sammenlignet, men kun en statistisk signifikant sammenhæng blev identificeret. En signifikant højere antal LN-positive patienter havde adenokarcinomer i forhold til andre histologiske tumortyper (P = 0,004). Vi testede, om dette fund var relateret til den primære tumor niveauer af de individuelle markører, og fandt, at

SFTPC

niveauer signifikant højere i adenokarcinomer end ved andre tumorer undertyper (P = 0,005). Men

SFTPA

,

CEACAM5

DSG3

udstillet lignende tendenser, med borderline signifikans (P = 0,06, P = 0,07, og P = 0,09, henholdsvis).

for yderligere at undersøge forholdet mellem primære tumor niveauer af hver markør og histologi undertype oplysninger blev principal komponent analyse udført (figur 4). Den resulterende biplot viste at primære

SFTPA

og

SFTPC

niveauer blev korrelerede, samt

KRT19

og

DSG3

niveauer. Planocellulært karcinom syntes at have høje niveauer af begge disse markør grupper, men ikke af

CEACAM5

mRNA. Mann-Whitney U test bekræftede betydeligt lavere

CEACAM5

mRNA-niveauer og højere

DSG3

mRNA-niveauer i squaumous celle carcinomer (P = 0,003 og P = 0,002, henholdsvis).

sorte tal angiver histologi typen (1 = adenocarcinom, 2 = adenosquamøst carcinoma, 3 = bronchioloalveolar carcinoma, 4 = carcinoid, 5 = storcellet carcinom, 6 = småcellet carcinom, 7 = pladecellecarcinom).

diskussion

for at undersøge den kliniske betydning af spredning af tumorceller til regionale LN og PB i NSCLC patienter, der kræves optimale påvisningsmetoder. I vores undersøgelse valgte vi en indirekte påvisning tilgang, der anvender epitel-specifikke transkripter som surrogatmarkører for tumorceller. Følgelig blev flere lovende markører for tumorceller i regionale LN og PB identificeres og vurderes i den foreliggende undersøgelse. Grundig validering i kliniske prøver viste, at

KRT19

,

CEACAM5

,

SFTPA

,

SFTPC

og

DSG3

var lovende markører for tumorceller i LMS, og PB fra NSCLC-patienter.

KRT19

,

CEACAM5

DSG3

markører er blevet rapporteret tidligere [9], mens

SFTPA

og

SFTPC

var roman i denne sammenhæng.

på baggrund af resultaterne fra vores valideringer og den vigtigste komponent analyse af primære tumor niveauer vist i figur 4, foreslår vi at bruge en multimarkør panel bestående af

KRT19

,

CEACAM5

SFTPA

. Disse tre markører repræsenterer de tre grupper i biplot analyse, hvilket tyder på, at alle 55 tumorer i vores validering kohorte havde høje niveauer af mindst én markør. Alle markører blev fundet i meget lave niveauer i normale LN og PB, mens alle undtagen

DSG3

blev udtrykt ved høje niveauer i de fleste tumorer.

DSG3

blev udtrykt ved høje niveauer i de fleste planocellulært karcinom (figur 4 og [9]), men det samme gjaldt også for

KRT19

. Fordi

KRT19

var også allestedsnærværende i andre histologiske undertyper, og havde en større udtryk niveauforskellene mellem tumorer, LN, og PB, vi foretrækker denne markør fra

KRT19

/

DSG3

gruppe. Den foreslåede multimarkør panel skal undersøges til klinisk effekt i fremtidige studier.

Alle markører evalueret i nærværende undersøgelse var relateret til en epitelial fænotype, som en konsekvens af vores inital søgekriterier. De seneste data tyder på, at nogle CTCs gennemgå en epitelial-til-mesenkymale overgang (EMT), der kan lette deres migration og evne til at invadere andre organer [21], [22]. Denne overgang er til en vis grad forbundet med en nedregulering af epiteliale gener, hvilket betyder, at de berørte CTCs vil være vanskeligere at påvise ved assays afhængige af epiteliale transkripter og proteiner. På trods af dette, er de fleste for tiden tilgængelige CTC berigelse og detektionsmetoder baseret på epitel markører [23], [24]. For at reducere problemet, foreslår vi, ved hjælp af en kombination af flere epitel markører, ligesom multimarker analysen foreslås i nærværende dokument. Sådanne analyser vil være mindre sårbar over for nedregulering af specifikke epitelial udskrifter end enkelt markør analyser.

Vi forventede højere positivitet satser af vores molekylære markører i LN fra patienter med LN metastaser identificeret ved rutinemæssig undersøgelse af alle hentede knuder (PN1 ), sammenlignet med node-negative patienter (PN0). Denne forventning er baseret både på vores tidligere molekylære analyser af sentinel LN fra kolon kræftpatienter [25], [26] og på tidligere rapporter om formidling af tumorceller i NSCLC patienter [4], [27]. Men vi ikke observere nogen signifikant sammenhæng mellem pN scenen og vores molekylære LN analyse i nærværende undersøgelse. En forklaring på dette kan være det lave antal knudepunkter analyseret fra hver patient i vores undersøgelse (gennemsnitlig 1,5), hvilket forøgede den relative sandsynlighed for tilstedeværelsen af ​​metastaser i knudepunkter ikke analyseret. For at afklare dette spørgsmål ville det være interessant at sammenligne rutine histologisk analyse af enkelte LN til vores molekylære analyser. Men histologisk fastslået, metastase status for enkelt knudepunkter ikke var tilgængelige i denne undersøgelse. På den anden side, ni af de 12 node-positive patienter havde LN positive ved vores markører, hvilket er acceptabelt at tage antallet af LN analyseret i betragtning. Den væsentligste årsag til den manglende statistisk signifikans synes at være det store antal positive fund i ellers node-negative patienter, der kan skyldes okkulte metastaser.

Ligeledes observerede vi ikke signifikant sammenhæng mellem klinisk fase og cirkulerende tumorceller (CTC) status. Dette står i kontrast med studiet af Krebs et al, hvor der blev fundet signifikant flere CTC positiv stadie IV lungekræftpatienter sammenlignet med dem med stadium III kræft [6]. Vores undersøgelse omfattede meget få fase III og ingen trin IV patienter, hvilket gør vanskelig en direkte sammenligning. Det forventes, at antallet af CTCs at være lavere i fase kræftformer tidligt, som observeret i brystkræft [23]. Endvidere Krebs et al. brugte CellSearch system til sporing CTCs, mens vi anvendte real-time kvantitativ RT-PCR, også reducere sammenlignelighed. Endvidere markør niveauer i vores blodprøver var knap over detektionsgrænserne (figur 3), især i tilfælde af

CEACAM5

og SFPTC. På grund af potentielt lav reproducerbarhed nær detektionsgrænsen, vi analyseres igen alle

CEACAM5

SFTPC

positive blodprøver for bekræftelse (data ikke vist). De lave markør niveauer formentlig svarede til temmelig lave CTC numre. Dette er i overensstemmelse med observationer hos patienter tidlig brystkræft [28]. I princippet påvisning af 1-2 CTCs er tilbøjelig til lav reproducerbarhed. Den CellSearch systemet er baseret på 7,5 ml blodprøver. Blodprøven volumen i vores undersøgelse var begrænset til 2,5 ml, hvilket yderligere reducerer sandsynligheden for at opdage CTCs.

Tilgængeligheden af ​​hilar LN fra patienter uden kræft var lav. Derfor har vi også analyseret 16 LN fra colon mesenterium som normal referencemateriale. Det kan hævdes, at mesenteriske LN er ikke helt sammenlignelige med LN fra lungerne. Derfor har vi faktisk observere højere niveauer af det overfladeaktive protein mRNA i de seks mediastinale LN. En simpel forklaring på dette kan være, at de mediastinale LN blev forurenet med epitelceller fra lungerne, enten ved et kirurgisk håndtering eller den normale fysiologiske aktivitet af LN. det faktum, at de andre markører havde lignende niveauer i både LN grupper synes dog at modsætte denne forklaring. På den anden side er de overfladeaktive mRNA’er var ikke til stede i tyktarmsepitel. Ikke desto mindre, fordi vi brugte de højeste markør niveauer i kontrolgruppen som en tærskel for positivitet, de mediastinale LN fastsætter grænsen for

SFTPA

,

SFTPB

og

SFTPC

markører.

Vi fandt ingen sammenhæng mellem LN og PB prøveniveauer vores markører. Dette kan skyldes forskellige ruter af metastatisk spredning, da nogle tumorer spredes gennem lymfesystemet mens andre spredes via blodet. Høje LN niveauer af epitel-specifik mRNA menes at repræsentere tumorceller med metastatisk potentiale. Imidlertid kan sådanne niveauer repræsentere celler oprindelse fra tumoren, men som er i færd med at blive udryddet af immunsystemet, eller cellerester. En sådan forskelsbehandling kan ikke bestemmes i denne undersøgelse, og den kliniske effekt skal evalueres i fremtidige studier.

Ingen signifikant forskel blev identificeret i positivitetsrater mellem forskellige kræft stadier, eller mellem mænd og kvinder. Flere patienter med adenokarcinomer havde høje tumor niveauer af nogle af de undersøgte markører, sammenlignet med dem med planocellulært karcinom, men dette bør interpreteded forsigtigt på grund af den lille stikprøve.

Klinikere har brug for forbedringer i, hvordan man stratificere patienterne for adjuverende behandling. Vores guldstandarden, TNM-klassifikationssystem, giver ikke tilfredsstillende og præcise estimater af overlevelsesrater. Dette indikerer, at patienter, der kunne drage fordel af adjuverende behandling ikke vil blive tilbudt en sådan, mens nogle patienter helbredes ved kirurgi alene modtager unødvendig adjuverende behandling. Forbedret forskelsbehandling af patienter med resterende tumorceller, potentielt behov for yderligere behandling, og dem uden dette behov, ville gavne patienterne.

konklusion, data understøtter den kliniske relevans af okkulte lymfeknude metastaser og cirkulerende tumorceller i lungekræftpatienter dukker [5], [29]. Forudsigelse af udfald og behandlingsrespons er blandt de potentielle kliniske anvendelser. I den foreliggende undersøgelse identificerede vi et panel af lovende tumor cellemarkører i LN og Pb prøver fra patienter med tidligt stadium lungekræft. Yderligere karakterisering er nødvendig for at klarlægge den kliniske effekt af vores resultater og identificere nye mål for forebyggelse og skræddersy terapi forbedret risiko.

Tak

Vi vil gerne anerkende Ingjerd Solvoll for praktisk bistand.