PLoS ONE: Fucoidan inducerer Cancer Cell Apoptose ved at modulere endoplasmatisk reticulum Stress Cascades

Abstrakt

Baggrund

Kræft metastaser er den vigtigste årsag, der fører til sygdom tilbagefald og høj dødelighed hos kræftpatienter. Derfor inhibering metastase proces eller dræbe metastatiske cancerceller ved at inducere apoptose, er af klinisk betydning for forbedringen kræftpatient overlevelse. Tidligere undersøgelser afslørede, at fucoidan, en fucose-rige polysaccharid isoleret fra marine brune alge, er et lovende naturligt produkt med signifikant anti-cancer-aktivitet. Men lidt er kendt om den rolle, endoplasmatisk reticulum (ER) stress i fucoidan-induceret celle apoptose.

vigtigste resultater

Vi rapporterede, at fucoidan behandling hæmmer cellevækst og inducerer apoptose i cancerceller . Fucoidan behandlinger resulterede i nedregulering af glukose reguleret protein 78 (GRP78) i metastatisk MDA-MB-231 brystkræftceller, og af ER protein 29 (ERp29) i metastatisk HCT116 kolon kræftceller. Imidlertid fucoidan behandling fremmes ER Ca

2 + -afhængige calmodulin-afhængig kinase II (CaMKII) phosphorylering Bcl-associeret X protein (Bax) og caspase 12 Ekspression i MDA-MB-231-celler, men ikke i HCT116-celler. I begge typer cancerceller, fucoidan aktiveret phosphoryleringen af ​​eukaryot initieringsfaktor 2 alpha (p-eIF2α) \\ CCAAT /enhancer binding protein homologt protein (CHOP) pro-apoptotisk kaskade og inhiberede phosphorylering af inositol-krævende kinase 1 (p- IRE-1) \\ X-box-bindende proteiner 1 splejsning (XBP-1s) pro-overlevelse kaskade. Desuden CHOP knockdown forhindret DNA-skader og celledød induceret af fucoidan.

Konklusion /Betydning

Fucoidan udøver sin anti-tumor-funktion ved at modulere ER stress kaskader. Bidrag af ER stress til fucoidan-induceret celle apoptose øger vores forståelse af de molekylære mekanismer bag sin anti-tumor aktivitet og beviser for den terapeutiske anvendelse af fucoidan i kræft

Henvisning:. Chen S, Zhao Y, Zhang Y Zhang D (2014) fucoidan inducerer Cancer Cell Apoptose ved at modulere endoplasmatisk reticulum Stress Cascades. PLoS ONE 9 (9): e108157. doi: 10,1371 /journal.pone.0108157

Redaktør: Yu-Jia Chang, Taipei Medicin University, Taiwan

Modtaget: April 18, 2014 Accepteret: August 17, 2014; Udgivet: 18 September, 2014

Copyright: © 2014 Chen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (81.370.524). Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kræft er en kronisk sygdom med høj dødelighed på grund af sin høje metastatisk evne og modstandsdygtighed over for kemo- og radio-terapi. På trods af de sophisticates af terapeutisk strategi til behandling af kræft, ingen behandling er 100% effektiv mod dissemineret /metastatisk cancer. Indtil for nylig er de fleste af de terapeutiske lægemidler målretter på de proliferative cancerceller til behandling af primære tumorer. I betragtning af at de fleste kræftdødsfald er resultatet af metastatisk sygdom, forstå mekanismer i kræft metastaser og udvikling af lægemidler til metastatisk kræft er faktisk nye områder i kræft cellebiologi og kræftbehandling.

Udvikling naturlige produkter til kræftbehandling er en lovende strategi for kræftbehandling og forebyggelse. For eksempel, fucoidan, en fucose-rige polysaccharid, isoleres fra brunalger sådan

Cladosiphon okamuranus

og

Fucus evanescens

[1], [2]. Fucoidan er strukturelt ligner heparin, med en betydelig procentdel af L-fucose [3], [4]. Nyere undersøgelser har vist sine forskellige biologiske aktiviteter, herunder anti-inflammatorisk, anti-koagulationsmiddel [5], anti-HIV og anti-cancer [6] – [9] aktiviteter. Betydeligt, fucoidan viser en høj effektivitet i behandlingen af ​​en række forskellige cancere, herunder brystcancer, prostatacancer, lungecancer, hepatom og leukæmi [7], [8], [10] – [12]. Dens antitumoraktivitet udøves ved at regulere flere signalveje i cancerceller. Det konstateredes, at fucoidan kan inducere celle apoptose

via

aktiveringen af ​​caspase-kaskader, ekstracellulært signal-regulerede kinase mitogenaktiveret proteinkinase (ERK1 /2 MAPK) og inaktivering af p38MAPK og phosphatidylinositol 3-kinase ( PI3 K) /proteinkinase B (AKT) [7], [11], [13]. Derudover fucoidan inhiberer også Wnt /β-catenin pathway at falde cyclin D1-ekspression, hvilket fører til standsning af cellecyklus

in vitro

in vivo

[7], [14].

in vivo Salg studier viste, at fucoidan undertrykte tumorvækst og væsentligt formindsket lunge metastase af 4T1-brystcancerceller [14] – [16]. Kollektivt, disse resultater understøtter den potentielle udvikling af fucoidan som anticancer narkotika. Omend dette, virkningsmekanismer, der Fucoidan udøver på kræft celle apoptose er ikke fuldt forstået. Især er lidt kendt om inddragelse af endoplasmatisk reticulum (ER) stress, en kommandopost der definerer celles skæbne, i fucoidan-medierede anti-tumor aktivitet.

ER spiller en afgørende rolle i Ca

2+ homeostase og celle patofysiologi. Ophobning af ufoldede eller fejlfoldede proteiner i ER eller Ca

2+ butik udtømning inducerer ER stress og udløser udfoldet protein reaktion at opretholde ER homeostase [17]. Under hvilende betingelser, ER chaperone protein, glukose reguleret protein 78 (GRP78), forsegler pore af translocon i ER og dermed reducerer ER Ca

2+ lække [18]. Under ER stress, er GRP78 frigøres fra translocon og udløser ER Ca

2+ udtømning [19]. Cytosoliske Ca

2+ binder til calmodulin at aktivere Ca

2+ \\ calmodulin-afhængig kinase II (CaMKII) signalering, hvilket fører til ER stress-induceret celle apoptose gennem aktivering af mitokondriske apoptose pathway [20].

ER stress fører også til dissociation af GRP78 fra komplekserne dannet med den luminale del af ER membranproteiner, protein kinase RNA (PKR) -lignende ER kinase (PERK), inositol-krævende kinase 1 (IRE1) og aktiverende transskriptionsfaktor 6 (ATF6), hvilket resulterer i autophosphorylering af PERK og IRE-1 og translokation af ATF6 til Golgi til spaltning [21]. Disse ændringer forårsager aktivering af deres nedstrøms signalveje. For eksempel den aktiverede PERK phosphorylerer eukaryot initieringsfaktor 2 alpha (eIF2α) til at dæmpe proteintranslation og reducere ER protein overbelastning [22]. Langvarig ER stress inducerer også ATF4 og CCAAT /enhancer binding protein homologt protein (CHOP) ekspression, hvilket fører til apoptose [17]. For at klare ER stress, aktiveret IRE-1 virker som en endonuklease til at forøge X-box-bindende protein 1 (XBP-1) splejsning, hvilket fører til opregulering af gener er vigtige for cellens overlevelse under ER stress [23]. ATF6 aktivering opstår efter proteolytisk spaltning i Golgi, efterfulgt af dets nukleare translokation for det adaptive stressrespons [24]. Til en vis grad, ER stress spiller en afgørende rolle i tuning disse signaling saldi til at manipulere cellens skæbne [17].

I denne undersøgelse undersøgte vi, om ER stress involverer fucoidan-induceret celle apoptose i den stærkt invasive og metastatiske MDA-MB-231 brystcancerceller [25] og HCT116 colon cancerceller [26]. Vi viste, at fucoidan behandling regulerer ER Ca

2 + -modulated phosphorylering af CaMKII i en celletype-afhængig måde. Imidlertid fucoidan behandling i begge typer cancerceller aktiverede p-eIF2 \\ CHOP pro-apoptotisk kaskade og inhiberede p-IRE-1 /XBP-1s pro-overlevelse kaskade. Derfor ER stress bidrager, i det mindste delvis, at fucoidan-induceret celle apoptose. Salg

Materialer og metoder Salg

Cellekultur

Humant MDA-MB-231 brystcancerceller og HCT116 colon cancerceller blev indkøbt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) og dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS, Invitrogen, Eugene, OR). Celler blev dyrket ved 37 ° C med 5% CO

2 i en fugtig inkubator

Antistoffer og reagenser

Følgende antistoffer blev anvendt i denne undersøgelse:. Kanin-anti-GRP78 og kanin anti-ERp29 fra Novus Biologicals (Littleton, CO); kanin-anti-eIF2a, muse-anti-phospho-eIF2a (S51), kanin-anti-P58

IPK, kanin-anti-spaltet PARP, kanin-anti-splejset XBP-1 (XBP-1s), kanin-anti-spaltet caspase 3og mus anti-GADD153 /CHOP fra Cell Signalling Technology (Beverly, MA); muse anti-β-actin fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO); kanin-anti-CaMKII, kanin-anti-Bax, kanin-anti-caspase 12 og kanin-anti-phospho-CaMKII (T286) fra Abcam (Cambridge, MA).

Fucoidan isoleret fra

blæretang

blev købt fra Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO). De fuldstændige, EDTA-fri proteaseinhibitor-cocktail tabletter blev opnået fra Roche Diagnostics (Indianapolis, IN). Phosphatase cocktail inhibitorer I og II og thapsigargin (TG) var fra Sigma-Aldrich (Steinheim, Tyskland). Lipofectamine 2000 transfektionsreagenser blev leveret fra Invitrogen (Eugene, OR). Salubrinal blev købt fra Tocris Bioscence (Ellisville, MO).

Cell vækst og levedygtighed

Cell vækst blev vurderet ved hjælp af CellTiter96 vandige One Solution Cell Proliferation Assay (Promega, Madison, WI). Kort fortalt blev celler podet tredobbelt i 96-brønds plader ved en densitet på 5000 celler per brønd i 100 pi af tilsvarende medium. Den følgende dag blev mediet aspireret og erstattet med frisk medium indeholdende de angivne koncentrationer af fucoidan (0, 10, 50 og 100 ug /ml). Celler blev inkuberet under standard dyrkningsbetingelser i op til 4 dage, og levedygtige celler blev vurderet. Absorbansen ved 492 nm blev målt under anvendelse af et Infinite F200 mikropladelæser (TECAN Austria GmbH, Grödig, Østrig). Tredobbelte forsøg blev udført for hver behandling. Cellelevedygtighed blev også undersøgt under anvendelse af trypanblåt-udelukkelse assay.

Cell apoptose

celle apoptose blev analyseret under anvendelse af terminal deoxynukleotidyltransferase-medieret dUTP nick-endemærkning (TUNEL) assay [27]. Kort beskrevet blev celler (2,5 x 10

4 per brønd) udsået i 6-brønds dyrkningsplader med dækglas og 24 timer senere, 2 ml frisk medium med fucoidan (slutkoncentration. 100 ug /ml) blev tilsat til hver brønd . Celler blev derefter behandlet i 3 dage efterfulgt af TUNEL-farvning under anvendelse af deadend fluorometrisk TUNEL-system (Promega, Madison, WI) ifølge producentens protokol. Objektglassene blev monteret ved hjælp antifade montering væske indeholdende DAPI. Grøn (apoptotisk cellekernen) og blå (DAPI, totale celler) fluorescerende signaler blev taget med et Olympus FluoView FV1000 konfokalt laserscanningsmikroskop (Olympus, Japan). Procentdelen af ​​apoptotiske celler blev udtrykt som et gennemsnit af fem tilfældigt valgte felter (300 celler pr). Desuden blev celleapoptose også undersøgt ved immunoblotting ekspressionen af ​​spaltet caspase 3 og spaltet Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP).

RNA-interferens Salg

Små interfererende RNA’er (siRNA’er) målretning CHOP (CHOP siGENOME SMARTpool, Dharmacon, Lafayette, CO) og siGENOME ikke-targeting siRNA blev anvendt til CHOP knockdown og kontrol hhv. Kort beskrevet blev celler dyrket i 6-brønds plader og forbigående transficeret ved 60-80% konfluens med siRNA ved en slutkoncentration på 25 nm ved anvendelse af Lipofectamine 2000 transfektionsreagens (Invitrogen, Eugene, OR) i overensstemmelse med producentens anvisninger. Otteogfyrre timer efter transfektion blev cellerne inkuberet med frisk medium alene eller medium med 100 ug /ml fucoidan. Efter 3 dage efter behandling blev celler høstet til analyse levedygtighed ved hjælp trypanblåteksklusion assay og vurdere niveauet af CHOP og kløvet PARP ved immunoblot.

Immunblotanalyse

Celler på 70-80% konfluens blev behandlet med fucoidan i forskellige koncentrationer (0, 1,0, 5,0, 10, 50 og 100 ug /ml) i 3 dage. Både de vedhæftede og suspenderede celler blev høstet for protein ekstraktion. Cellelysater blev ekstraheret med RIPA-buffer (1% Igepal, 1% natriumdeoxycholat, 0,15 M natriumchlorid, 0,01 M natriumsulfat, pH 7,2 og 2 mM EDTA), suppleret med proteaseinhibitorer (Roche Diagnostics) og phosphatase cocktail inhibitorer I og II (1:100, Sigma-Aldrich). Western blotting blev udført som beskrevet [28]. Kort beskrevet blev de samlede proteiner (30 pg /lane) adskilt af 10% SDS-PAGE og overført til PVDF-membraner. Membraner blev blokeret med 5% skummetmælk i Tris-saltvand-puffer med 0,1% Tween 20 i 1 time ved stuetemperatur og probet med de angivne primære antistoffer. Gede-anti-muse peberrodsperoxidase (HRP; Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) eller gede-anti-kanin-HRP sekundært antistof (Zymed Laboratories, San Francisco, CA) blev anvendt som sekundære antistoffer. Den kemiluminescerende signal blev fremkaldt med Supersignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce, Rockford, IL). Signal intensitet blev analyseret ved hjælp GeneTools software (Syngene, Frederick, MD). Niveauet af β-actin blev anvendt som en loading kontrol.

Statistiske analyser

envejs variansanalyse (ANOVA) og Student

t

tests blev anvendt til at analysere betydningen af ​​forskelle. p 0,05 blev betragtet som signifikant. Alle cellekultur eksperimenter blev udført tredobbelt. Data er præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse (SD) og leveres i tabel S1.

Resultater

Fucoidan behandling inducerer celle apoptose

Tidligere undersøgelser viste en signifikant inhibering af fucidan på tumorigenese og cancercelle metastase [14] – [16]. For at forstå virkningen af ​​fucoidan på cellevækst og apoptose, både de metastatiske MDA-MB-231-celler og HCT116-celler blev behandlet med fucoidan ved den angivne koncentration i op til 4 dage og cellevæksten blev analyseret. Som vist i fig. 1A, blev cellevæksten hæmmet signifikant, når cellerne blev behandlet med 50 pg /ml fucoidan på dag 3 for MDA-MB-231-celler og på dag 2 for HCT116 celler, sammenlignet med deres respektive kontrolceller. Desuden at bestemme, om celle apoptose attributter til inhibering af cellevækst, blev begge typer af celler behandlet med fucoidan (100 ug /ml) i 3 dage og celle apoptose blev vurderet ved at undersøge ekspressionen af ​​spaltet caspase 3 og TUNEL. Som angivet i figur 1B, behandling af fucoidan ved høje doser (

f.eks

., 100 ug /ml) forårsagede en høj ekspression af spaltet caspase 3 i begge typer af celler. TUNEL-analyse viste også en ca 25% celler, der undergår DNA-skader i fucoidan-behandlede celler (Fig 1C.). Derfor fucoidan behandling resulterede i bemærkelsesværdig DNA-skader i disse celler.

(A) Cellevækst. Celler blev behandlet med fucoidan ved den angivne koncentration og de levedygtige celler blev vurderet ved anvendelse af CellTiter96 vandige Solution Cell Proliferation Assay. (B) Caspase 3-aktivering. Cellerne blev behandlet med fucoidan i 3 dage, og ekspressionen af ​​spaltet caspase 3 blev undersøgt ved Western blot. (C) TUNEL. For TUNEL-analyse blev celler behandlet med fucoidan ved 100 ug /ml i 3 dage og celleapoptosen blev analyseret ved anvendelse TUNEL assay. Apoptotiske celler (grøn) blev talt i fem tilfældigt valgte felter (300 celler pr) og præsenteret som en middelværdi ± SD af procentdelen af ​​apoptotiske celler i de totale celler (DAPI, blue). Data udtrykkes som en middelværdi ± SD i tredobbelte eksperimenter. * P 0,05; ** P. 0,01

Fucoidan behandling fører til forskellige ER respons i MDA-MB-231 og HCT116 celler

For at undersøge om ER stress er involveret i fucoidan-induceret celle apoptose vi oprindeligt undersøgt ekspressionen af ​​ER stress markører herunder GRP78 og ERp29. Interessant, i modsætning til celler behandlet med ER stress inducer TG ,, ekspressionen af ​​GRP78 blev reduceret i fucoidan-behandlet MDA-MB-231-celler uden effekt på ERp29 ekspression i disse celler, i forhold til kontrolcellerne (intet fucoidan behandling ) (fig. 2A). I stedet blev ekspressionen af ​​ERp29 signifikant reduceret i de fucoidan-behandlede HCT116 celler, hvorimod ekspressionen af ​​GRP78 lidt blev forøget, når cellerne blev behandlet med 5 ug /ml, efterfulgt af reduktion med høje doser af behandlinger (fig. 2B). GRP78 har flere funktioner i cancerceller såsom at være ansvarlig for celleproliferation, beskyttelse af celler mod apoptose og fremskynde ER-associeret protein nedbrydning af fejlfoldede proteiner [29]. Nylige undersøgelser har også behandlet rolle ERp29 i kræft celle overlevelse mod kemo- og radio-terapi [27], [30]. Reduktionen af ​​GRP78 eller ERp29 i fucoidan-behandlede celler antyder, at fucoidan inducerer celledød ved at undertrykke ekspressionen af ​​disse overlevelse proteiner i MDA-MB-231 og HCT116-celler. Salg

Celler ved 70-80% konfluens var behandlet med fucoidan i de angivne koncentrationer i 3 dage, og begge de fastgjorte og suspenderede celler blev høstet til proteinekspression analyse. (A) Ekspressionen af ​​GRP78, men ikke ERp29, blev inhiberet af fucoidan i MDA-MB-231-celler; (B) Udtrykket af ERp29 blev signifikant svækket ved fucoidan i HCT116 celler, mens GRP78 kun var faldet lidt (~1.5 gange) i celler behandlet med fucoidan på 50 ug /ml. Som en positiv kontrol blev celler behandlet med ER stress inducer TG (2,0 uM) i 24 timer. Data repræsenterer gennemsnit ± SD i tredobbelte eksperimenter. * P 0,05; ** P. 0,01

Fucoidan behandlingsresultater i aktivering af p-CaMKII \\ Bax og caspase 12 udtryk i en celle-kontekst afhængig måde

Fordi GRP78 kan binde med translocon i ER membranen til at blokere Ca

2+ frigivelse til cytosolen [18], vi næste undersøgt, om reduktion af GRP78 i MDA-MB-231 celler kunne fremkalde Ca

2 + medieret aktivering af CaMKII og udtrykket af apoptose-relaterede proteiner Bax. Som vist i fig. 3A, den relative phosphorylering af CaMKII (p-CaNKII /CaMKII) blev gradvis forøget i de celler behandlet med fucoidan sammenlignet med kontrolcellerne (intet fucoidan behandling), hvilket indikerer en aktivering af Ca

2+ \\ CaMKII signalering. I tråd med dette, blev Bax udtryk også signifikant forøget og fastholdt på samme niveau i cellerne behandlet med fucoidan (10-100 pg /ml). I modsætning hertil sammenligne med kontrolcellerne, den relative phosphorylering af CaMKII (p-CaNKII /CaMKII) var moderat forøget (~1.5 gange) i HCT116-celler behandlet med 10 ug /ml fucoidan, efterfulgt af reduktion i de celler behandlet med 100 ug /ml fucoidan. Samlet, fucoidan behandling i HCT116 celler ikke forårsage betydelig ændring af den relative phosphorylering af CaMKII og Bax ekspression (fig. 3B). Vi fandt også, at ekspressionen af ​​caspase 12 blev stærkt forøget med fucoidan koncentration i MDA-MB-231-celler, men ikke i HCT116-celler (fig. 3C). Desuden blev ingen kløvning af caspase 12 observeret, når probing med antistof. Taget sammen antyder disse data, at fucoidan regulerer Ca

2+ \\ CaMKII signalering og caspase 12 i en celletype-afhængig måde.

(A) Relativ phosphorylering af CaMKII og Bax ekspression blev gradvis forøget med fucoidan i MDA-MB-231-celler; (B) Relativ phosphorylering af CaMKII var moderat stimuleret (~1.5 gange) ved 10 ug /ml, efterfulgt af inhibering (~1.4 gange) af fucoidan ved 100 ug /ml. Bax udtryk blev ikke påvirket af fucoidan i HCT116 celler. (C) Caspase 12 udtryk og spaltning. Fucoidan effektivt inducerer caspase 12 ekspression i MDA-MB-231-celler, snarere end i HCT116 celler. Nr kløvning af caspase 12 blev fundet i begge typer af celler. Data repræsenterer gennemsnit ± SD fra tredobbelte eksperimenter. * P 0,05; ** P. 0,01

Fucoidan behandling hæmmer p-IRE-1 \\ XBP-1 splejsning

Baseret på de ovenstående resultater, at fucoidan kan modulere ER stress respons i kræftcellerne , vi næste undersøgt, om fucoidan differentielt regulerer IRE-1 \\ XBP-1 s, en kaskade definerer celle overlevelse respons

via

opregulering af ekspressionen af ​​chaperoner for eR folde kapacitet [31], og PERK \\ P -eIF2α \\ CHOP pro-apoptotiske kaskade [17]. Sammenlignet med kontrollen, fucoidan inhiberede signifikant ekspressionen af ​​XBP-1s i begge typer af celler (fig. 4A, B). Dette var forårsaget af nedsat phosphorylering af IRE-1 i de fucoidan-behandlede celler, fordi de aktiverede p-IRE-1 fungerer som en endonuklease til at generere splejsede XBP-1s fra ikke-splejset XBP-1 mRNA under ER stress [32]. I modsætning til de TG-behandlede celler demonstrerer forbedret IRE-1 phosphorylering og XBP-1s ekspression (fig. 4A, B), indikerer disse resultater en inhiberende virkning ved fucoidan på ER stressrelateret celleoverlevelse kaskade. Men vi ikke oplever en betydelig ændring af P58

IPK, en af ​​de nedstrøms mål for XBP-1s og ATF6 [23], i fucoidan-behandlede celler.

Celler blev behandlet med fucoidan som beskrevet i “Materialer og fremgangsmåder” og i figur 2. phosphorylering af IRE-1 (p-IRE-1) og XBP-1 splejsning blev bemærkelsesværdigt reduceret med fucoidan som vurderet ved immunoblot. Dens nedstrøms mål, P58

IPK, blev ikke efterfølgende faldet. Data er udtrykt som middelværdi ± SD i tredobbelte eksperimenter. Bemærk, at TG-behandlede celler (2,0 uM, 24 h) viste en øget p-IRE-1 og XBP-1s i begge celler. * P 0,05; ** P. 0,01

Fucoidan aktiverer eIF2α phosphorylering og opregulerer CHOP udtryk

Phosphorylering af eIF2α er en klassisk mekanisme til at nedregulere global proteinsyntese at klare ER stress [33 ]. Ikke desto mindre, overdreven ER stress fremmer også celledød

via

opregulere ATF4 \\ CHOP kaskade [17]. Det er således overvejet, denne kaskade sandsynligvis aktiveres til at deltage i fucoidan-induceret celle apoptose. Faktisk overensstemmelse med TG-behandlede celler, phosphoryleringen af ​​eIF2α og ekspression af CHOP blev progressivt induceret i en dosis-afhængig måde i begge typer celler (Fig 5A . B). Derfor kan fucoidan inducere ER stressrelateret pro-apoptotisk kaskade i disse cancerceller.

Celler blev behandlet med fucoidan som beskrevet i “Materialer og metoder”, og i figur 2. Den relative phosphorylering af eIF2α (p -eIF2α /eIF2α) og CHOP udtryk blev bemærkelsesværdigt forøget med fucoidan som vurderet ved immunoblot. TG behandling (2,0 uM, 24 h) induceret aktivering af p-eIF2α og CHOP ekspression. Data er udtrykt som middelværdi ± SD i tredobbelte eksperimenter. * P 0,05; ** P. 0,01

Salubrinal behandling forbedrer fucoidan-aktiverede eIF2α phosphorylering og CHOP udtryk

Salubrinal er en selektiv hæmmer af eIF2α dephosphorylering og inducerer hyperphosphorylering af eIF2α ved at hæmme GADD34-PP1c kompleks [34], [35]. For at vurdere om salubrinal behandling letter fucoidan-induceret ER stress kaskade, blev MDA-MB-231 og HCT116-celler behandlet med salubrinal (50 uM) alene eller i kombination med fucoidan (100 ug /ml) i 48 timer og ekspressionen af ​​p- eIF2α og CHOP blev undersøgt. Som angivet i figur 6, celler behandlet med salubrinal og fucoidan viste højere ekspression af p-eIF2α phosphorylering og CHOP end celler behandlet med salubrinal eller fucoidan alene. Disse data indikerer en stimulerende virkning ved fucoidan på salubrinal-induceret p- eIF2α \\ CHOP kaskade.

Celler blev behandlet med salubrinal (50 uM) alene eller i kombination med fucoidan (100 ug /ml) i 48 timer . Cellelysater (30 ug) blev anvendt til analyse af ekspressionen af ​​p-eIF2α og CHOP ved immunoblot. ** P 0,01; *** P. 0,001

CHOP tavshed hæmmer fucoidan-induceret ekspression af spaltet PARP

For at vurdere, om fucoidan-inducerede CHOP i begge typer af kræftceller er knyttet til observerede celle apoptose blev celler behandlet med siRNA targeting CHOP at reducere sine endogene niveauer eller behandlet med scramble siRNA som kontrol. Vores foreløbige undersøgelser viste, at begge typer af celler behandlet med 25 nM siRNA i 48 h kunne føre til 70% undertrykkelse af CHOP udtryk i forhold til gruppen behandlet med kontrol siRNA. Disse celler blev derefter behandlet med fucoidan (ved 0 eller 100 ug /ml) i 2 dage og CHOP ekspression og DNA-beskadigelse (som vurderet ved spaltet PARP) blev analyseret. Som vist i fig. 7A, niveauet af CHOP blev reduceret med 70-90% af kontrollerne i begge typer af celler efter behandling. I cellerne forbehandlet med siRNA kontrol, fucoidan behandling markant forøget CHOP ekspression og PARP-spaltning over cellerne uden fucoidan behandling. I modsætning hertil fucoidan behandling var ikke i stand til at inducere CHOP ekspression og PARP-spaltning i CHOP-lyddæmpet celler, hvilket indikerer, at silencing CHOP er i stand til at blokere fucoidan-induceret ekspression af spaltet PARP. Disse data giver belæg for, at CHOP deltager i fucoidan-induceret DNA-skader.

(A) CHOP knockdown af siRNA hæmmer fucoidan-induceret ekspression af spaltet PARP. Celler ved 70-80% konfluens blev behandlet med CHOP siRNA eller scramble siRNA i 48 timer, efterfulgt af fucoidan behandling (0 eller 100 ug /ml) i 2 dage. Niveauerne af CHOP og kløvet PARP blev vurderet ved immunoblot. (B) Silencing CHOP antagoniserer fucoidan-induceret celledød. Celler forbehandlet med CHOP siRNA eller kontrol-siRNA blev behandlet med fucoidan (0 eller 100 ug /ml) i 2 dage og cellelevedygtigheden blev undersøgt under anvendelse af trypanblåt-udelukkelse assay. Cellelevedygtighed blev udtrykt som en procentdel af de siRNA kontrolceller uden fucoidan behandling (kolonne 3 i MDA-MB-231 celler; kolonne 7 i HCT116-celler). Bemærk, at CHOP knockdown alene ikke påvirker cellernes levedygtighed i begge typer af celler (kolonne 1

vs

3;.. Kolonne 5

vs

7). I stedet CHOP knockdown bemærkelsesværdigt forhindrer celle apoptose induceret af fucoidan ved 100 ug /ml (kolonne 2

vs

4 i MDA-MB-231 celler;. Kolonne 6

vs

8 i HCT116-celler. ). Resultater fortolkes som middel (± SD) af tredobbelte eksperimenter. * P 0,05; ** P. 0,01

CHOP undertrykkelse modvirker fucoidan-induceret celle apoptose

For at undersøge effekten af ​​CHOP knockdown på fucoidan-induceret celle apoptose, cellelevedygtigheden af ​​disse behandlede celler blev undersøgt. I forhold til den celle levedygtighed siRNA kontrol celler uden fucoidan behandling (Fig 7B, kolonne 3 i MDA-MB-231 celler. Kolonne 7 i HCT116 celler), cellen levedygtighed i CHOP-lyddæmpet celler var den samme som observeret i disse kontrol celler (.. figur 7B, kolonne 1

vs

3; kolonne 5

vs

7.), hvilket indikerer, at lukke munden på CHOP alene ikke kan påvirke cellernes levedygtighed. I cellerne forbehandlet med kontrol siRNA, fucoidan behandling medførte ca. 50-60% reduktion af cellelevedygtighed sammenlignet med dem uden fucoidan behandling (fig 7B, kolonne 4

vs

3;.. Kolonne 8

vs

7; p 0,01). Men fucoidan behandling kun forårsagede ca. reduktion 10-20% af cellelevedygtighed i CHOP-lyddæmpet celler (Fig 7B, kolonne 2

vs

1;… Kolonne 6

vs

5) . Notatet undertrykkelse af CHOP i begge typer af celler, førte til en betydelig forøgelse af cellelevedygtighed efter fucoidan behandling i forhold til de celler behandlet med kontrol siRNA og fucoidan (figur 7B, kolonne 2

vs

4;.. Kolonne . 6

vs

8; p 0,05). Taget sammen antyder disse resultater, at knockdown af CHOP kunne beskytte celler fra fucoidan-induceret celle apoptose.

Discussion

Fucoidan har vist sig at være et hidtil ukendt terapeutisk middel til behandling af cancer. Mekanistiske undersøgelser afslørede, at fucoidan kan undertrykke cancer celleoverlevelse, tumorgenese og metastase ved modulering multiple signalveje [5], [7], [11] – [14]. I den foreliggende undersøgelse viser vi, at fucoidan modulerer ER stress kaskader i cancerceller og det aktiverede CHOP-ekspression er ansvarlig for fucoidan-induceret celle apoptose.

ER stress udløser en række processer, der er nødvendige for apoptose. En af dem er frigivelse af ER Ca

2 + butikker i cytosolen at aktivere Ca

2 + -signal transducer CaMKII, hvilket fører til apoptose gennem: (

i

) aktivering af c-Jun N-terminal kinase (JNK) for at inducere dødsreceptor Fas (11); (

ii

) stimulering af Ca

2+ optagelse af mitokondrier og frigivelse af apoptogens [36]. Derfor CaMKII aktivering med ER Ca

2+ læk spiller en afgørende rolle i apoptose. observerede vi imidlertid, at fucoidan behandling induceret aktivering af p-CaMKII i MDA-MB-231-celler frem for i HCT116 celler. Konsekvent, blev den mitokondrielle apoptotisk protein Bax og ER-associeret caspase 12 signifikant forøget i fucoidan-behandlet MDA-MB-231-celler. I betragtning af at GRP78 kan bindes til ER Ca

2+ og translocon i ER-membranen til at blokere ER Ca

2+ lække [18], kan dette forklares ved, at fucoidan behandling i MDA-MB-231-celler , ikke i HCT116 celler, forårsaget reduktion af cytobeskyttende GRP78, hvilket fører til ER Ca

2+ lække ind cytosol at aktivere CaMKII fosforylering. I modsætning hertil var der ingen signifikant ændring af CaMKII phosphorylering og Bax og caspase 12 ekspression i fucoidan-behandlede HCT116 celler, selvom CaMKII phosphorylering var moderat forøget ved fucoidan ved 10 ug /ml og inhiberes ved 100 ug /ml. Dette er sandsynligvis i overensstemmelse med den observation, at ekspressionen af ​​GRP78 ikke var væsentligt påvirket af fucoidan i HCT116 celler. Imidlertid bør virkningen af ​​fucoidan-induceret nedregulering af ERp29 på den moderate reduktion af CaMKII phosphorylering i HCT116-celler ikke udelukkes. Desuden er det blevet rapporteret, at ER-associerede, Ca

2 + -induceret caspase 12 aktivering er også impliceret i ER stress-induceret apoptose [37], men vi ikke observeret aktivering af pro-caspase 12 ( kløvning af caspase 12) i fucoidan-behandlede celler, hvilket antyder, at denne caspasekaskaden ikke kan aktiveres. Fordi GRP78 og ERp29 er væsentlige ER proteiner i opretholdelse ER homeostase og funktioner som foldning og sekretion af proteiner og nedbrydning af fejlfoldede proteiner [29], [38], er det plausibelt, at fucoidan potenserer beskadigelse ER funktion gennem svækkelse af ekspressionen af GRP78 eller ERp29 i en celle kontekst afhængig måde, hvor de præcise mekanismer skal undersøges nærmere

eR stress-medieret signalveje er koblet til to kaskader:. celledød-relaterede PERK \\ P-eIF2α \\ CHOP kaskade og celleoverlevelse-relaterede AFT6 (IRE-1) \\ XBP-1 splejsning kaskade [17]. For at klare ER stress, er XBP-1 mRNA splejses af de aktiverede p-IRE-1 til dannelse XBP-1s [32]. XBP-1s er en meget aktiv transskriptionsfaktor og er en af ​​de vigtigste regulatorer af ER folde kapacitet [31]. Nylige undersøgelser har vist, at forlængelsen af ​​IRE-1-signalering under ER stress kan fremme celleoverlevelse [39]. Derfor kunne dæmpning af denne kaskade udløse celle apoptose. Faktisk vores undersøgelser vist, at fucoidan behandling signifikant forhindrede XBP-1 splejsning gennem hæmning af IRE-1 phosphorylering.