PLoS ONE: MicroRNA Expression og Klinisk Resultatet af småcellet Cancer

Abstrakt

rolle microRNA i småcellet carcinom (SCLC) er stort set ukendt. MIR-34a er kendt som en p53 reguleret tumorsuppressor microRNA i mange cancertyper. Imidlertid har sin terapeutiske konsekvenser aldrig blevet undersøgt i SCLC, en kræftform med hyppig dysfunktion af p53. Vi undersøgte ekspressionen af ​​et panel af 7 microRNA (MIR-21, MIR-29b, MIR-34a /b /c, MIR-155, og lad-7a) i 31 SCLC-tumorer, 14 SCLC-cellelinier, og 26 NSCLC celle linjer. Vi observerede signifikant lavere MIR-21, MIR-29b, og MIR-34a ekspression i SCLC-cellelinier end i NSCLC-cellelinier. Udtrykket af de 7 microRNA’er var relateret til SCLC patienternes kliniske karakteristika og hverken var prognostisk på sigt af den samlede overlevelse eller progressionsfri overlevelse eller prædiktiv af behandlingsrespons. Overekspression eller nedregulering af miR-34a påvirkede ikke SCLC cellernes levedygtighed. Ekspressionen af ​​disse 7 microRNA heller ikke forudsige

in vitro

følsomhed over for cisplatin eller etoposid i SCLC-cellelinier. Overekspression eller nedregulering af miR-34a havde ingen indflydelse følsomhed over for cisplatin eller etoposid i SCLC-cellelinjer. I modsætning til nedregulering af miR-34a målgener cMet og Axl ved overekspression af miR-34a i NSCLC cellelinjer, den iboende udtryk for cMET og Axl var lav i SCLC cellelinjer og var ikke påvirket af overekspression af miR-34a. . Vores resultater tyder på, at ekspressionen af ​​de 7 udvalgte microRNA’er er ikke prognostiske i SCLC patienter, og miR-34a er relateret til den maligne opførsel af SCLC celler og er usandsynligt, at være en terapeutisk target

Henvisning: Lee JH , Voortman J, Dingemans A-MC, Voeller DM, Pham T, Wang Y, et al. (2011) MicroRNA Expression og Klinisk Resultatet af småcellet lungekræft. PLoS ONE 6 (6): e21300. doi: 10,1371 /journal.pone.0021300

Redaktør: William C. S. Cho, Queen Elizabeth Hospital, Hongkong

Modtaget: 8. februar 2011; Accepteret: 25. maj 2011; Udgivet: 22 juni, 2011

Dette er en åben-adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Finansiering:. Undersøgelsen blev finansieret af National Institutes of Health, National Cancer Institute intramuralt program. Ingen yderligere ekstern finansiering blev modtaget til denne undersøgelse. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lille celle lungekræft (SCLC) tegner sig for omkring 10-20% af lungekræft tilfælde og er berygtet for sin aggressivitet og dårlig overlevelse [1], [2]. Trods moderat fremskridt i de seneste to årtier, overlevelsesraten for SCLC patienter er stadig meget dårlig [2], [3]. Delvist på grund af manglen på tilstrækkelige molekylære biomarkører til vejledning for behandling af SCLC, de kliniske resultater af molekylære målrettede behandlinger såsom imatinib, gefitinib, bcl-2 inhibitorer og mTOR inhibitorer i behandlingen af ​​SCLC patienter skuffende [4].

MicroRNA udtryk korrelerer med biologiske karakteristika af kræft, såsom celledifferentiering, aggressivitet, invasion, angiogenese, og metastatisk adfærd [5], [6], [7]. For eksempel MIR-34 familiemedlemmer, MIR-34a, MIR-34b, og MIR-34c, er direkte transkriptionelle mål for p53 og deres ekspression inducerer standsning af cellecyklus i cancercellelinier [8]. MIR-29b virker som en tumorsuppressor microRNA gennem genoprettelse af et normalt mønster DNA-methylering [9]. Klinisk har microRNA analyse blevet vist at hjælpe ved diagnose af cancer samt forudsigelse af prognose og behandlingsrespons [6], [10]. Roller microRNA i kræft biologi og prognose forudsigelse i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) er blevet bredt undersøgt. Øget MIR-34a var forbundet med færre tilbagefald i en lille retrospektiv undersøgelse af resektion NSCLC-patienter [11]. Overekspression af lad-7a, eventuelt gennem undertrykkelse af RAS onkogen [12], viste sig at være relateret til øget samlet overlevelse i NSCLC patienter [13], og var også blandt de beskyttende prognostiske faktorer forhindrer tilbagefald hos kirurgisk resektion NSCLC [14] . Overekspression af “oncomirs” MIR-21 og MIR-155 viste sig at være relateret til nedsat overlevelse hos NSCLC-patienter [13], [15]. Der er kun sparsomme oplysninger om betydningen af ​​microRNA ekspression i SCLC, og funktionen af ​​flere veldokumenterede kræftrelaterede microRNA i andre typer cancer er aldrig blevet behandlet i SCLC. For eksempel, selv om SCLC er kendetegnet ved hyppige p53 dysfunktion [16], rolle miR-34a, en p53 reguleret tumor suppressor microRNA [8], [17], er aldrig blevet undersøgt i SCLC.

Vi for nylig vist, ved hjælp af en real-time polymerasekædereaktion (PCR) -baseret plateform, at ekspression profiler af et panel af syv cancerassocierede microRNA (MIR-21, MIR-29b, MIR-34a /b /c, miR- 155, og lad-7a) hverken prædiktive eller prognostiske i NSCLC patienter, der fik platinbaseret adjuverende kemoterapi [18]. i opereret bugspytkirtelkræft ved hjælp af den samme panel af microRNA, viste imidlertid, at lav ekspression af miR-21 var forbundet med øget overlevelse efter adjuverende behandling i to uafhængige grupper af pancreas duktale adenocarcinom patienter [19], tyder på, at ekspressionen af ​​microRNA og deres prognostiske og prædiktive implikationer sandsynligvis vil være tumorspecifikke. I den aktuelle undersøgelse, udforskede vi microRNAers rolle til forudsigelse af både prognose og behandlingsresultater i SCLC hjælp patientprøver og SCLC-cellelinier. Vi yderligere undersøgt, hvordan udtryk for miR-34a påvirker den maligne opførsel af SCLC celler.

Resultater

microRNA udtryk i SCLC tumorer og lungekræft cellelinier

Tabel 1 viser i oversigtsform vigtigste patienters karakteristika, og tabel S1 viser microRNA udtryk i forbindelse med kliniske variabler. Tendenser blev observeret til fordel for højere lad-7a udtryk hos kvinder og hos yngre patienter (p = 0,07 og 0,13 henholdsvis ved Wilcoxon Rank-Sum test). Ingen signifikante korrelationer blev observeret mellem ekspression af microRNA og kliniske karakteristika. Vi sammenlignede ekspression af de 7 microRNA mellem SCLC-cellelinier og NSCLC cellelinier. Lavere udtryk for miR-21, miR-29b, og miR-34a blev fundet i SCLC cellelinjer end i NSCLC cellelinier (p 0,001 for alle tre microRNA, figur S1), som er i overensstemmelse med en tidligere rapport [20] . Vi udførte yderligere

in situ

hybridisering af miR-34b i en SCLC tumor prøve og observerede cytoplasmatisk udtryk for miR-34b og nuklear udtryk for nucleolar RNA U6 som forventet (Figur S2).

microRNA udtryk er ikke korreleret med overlevelsen af ​​SCLC patienter

Den mediane samlede overlevelse og progressionsfri overlevelse med denne undersøgelse kohorte var 49.1 og 35,7 uger hhv. Som forventet længere samlet overlevelse blev observeret i SCLC patienter, som havde begrænset sygdom og patienter, som opnåede komplet respons efter behandling (tabel 1 og tabel S2). Blandt de 7 microRNA’er undersøgt, var der ingen forskel i overlevelse mellem patienter med høj og lav microRNA ekspression, defineret af medianen ekspression af hvert microRNA i tumorprøver (tabel 2). Dette var tilfældet i både begrænsede og omfattende patienter sygdom (tabel S3).

p53 protein udtryk er relateret til miR-34a /b /c udtryk i SCLC tumorer

Som miR- 34a, miR-34b, og miR-34c er direkte transkriptionelle mål for p53 [8] og bcl-2 er et mål for miR-34a [21], vi udforsket, om p53 udtryk påvirker ekspressionen af ​​miR-34a /b /c og hvorvidt bcl-2-ekspression er relateret til mIR-34a. Brug prøver fra samme undersøgelse kohorte, Dingemans

et al

viste, at protein udtryk for p53 er relateret til overlevelse SCLC patienter og er relateret til protein-ekspression af bcl-2 samt [22]. Vi observerede, at protein ekspression af p53 i SCLC-tumorer var relateret til ekspression af MIR-34a, MIR-34b, og MIR-34c (fig S3A, B og C). Derudover udtryk for miR-34a var relateret til udtryk for bcl-2 i SCLC tumorer (Figur S3D).

miR-34a udtryk er ikke relateret til levedygtigheden af ​​SCLC

in vitro

for at udforske den rolle microRNA ekspression i maligne adfærd SCLC, vi fokuseret på miR-34a fordi miR-34a blev rapporteret at være en prognostisk overlevelse markør [11] og for at være en af ​​de få kandidater til microRNA udskiftning terapi i NSCLC [23], [24]. Vi overudtrykt eller nedreguleret miR-34a i SCLC celler. Ved hjælp af en Cy3-mærket miR precursor eller inhibitor at evaluere transfektion effektivitet, fandt vi, at 24 timer efter transfektion, transfektion effektivitet af MIR-precursor eller inhibitor i NCI-H82 SCLC-celler var næsten 100% (figur S4). Høj transfektion effekt blev også observeret i NCI-H146, NCI-N592, GLC4, A549, og NCI-H1299 celler (data ikke vist). Vi observerede højere modne MIR-34a-ekspression i celler transfekteret med MIR-34a precursor og lavere modne MIR-34a-ekspression i celler transfekteret med MIR-34a-inhibitor sammenlignet med celler transficeret med kontrol precursor og inhibitor, (figur 1A). Betragtninger overekspression af miR-34a inducerer G1 anholdelse i flere cancer cellelinjer [8], blev G1 anholdelse ikke blev observeret i NCI-H82 SCLC celle transficeret med miR-34a forløber (figur 1B). Nedregulering af MIR-34a i NCI-H146-celler, som udtrykte højere MIR-34a i sammenligning med den mediane ekspressionsniveauet af de 14 SCLC-cellelinier (Tabel S4), og i NCI-N592-celler, som udtrykte lavere miR -34a, havde ikke indflydelse levedygtighed SCLC celler (figur 1C og D). I modsætning til den almindeligt accepterede tumorsuppressor effekt af MIR-34a, overekspression af MIR-34a i NCI-82-celler ikke svækkede cellevækst (figur 1E), hvorimod der blev observeret dæmpning af cellevækst i NCI-H1299 NSCLC-celler (figur S5 ), som påvist i en tidligere rapport [23]. I modsætning til Wiggins

et al.

Som påviste, at gentagne transfektion og langsigtet inkubation af miR-34a falder NCI-H226 NSCLC kræftcelle levedygtighed [23], vi undlod at observere effekten af ​​gentagne transfektion af miR-34a om at nedsætte cellernes levedygtighed i NCI-N592-celler (figur 1F).

(A) miR-34a udtryk i NCI-N592 celler og NCI-H82-celler transficeret med miR-34a forløber eller inhibitor. Delta-delta Ct-værdi blev kalibreret til delta Ct værdi miR34a i celler transficeret med kontrol miR precursor eller inhibitor, henholdsvis. (B) cellecyklusfordeling af NCI-H82 celle transficeret med kontrol miR precursor, MIR-34a-precursor, styre miR inhibitor og MIR-34a-inhibitor. (C og D) Cellevækst assay af NCI-H146 (C) og NCI-N592 (D) celler transficeret med MIR-34a-inhibitor eller kontrol miR inhibitor. (E) Cellevækst assay af NCI-H82 celler transficeret med MIR-34a precursor eller kontrol miR precursor. (F) Cellelevedygtighed af NCI-N592 celler efter gentagen transfektion af kontrol miR precursor eller MIR-34a precursor. Celler blev talt og transficeret igen hver tredje dag. Fejlsøjler indikerer standardafvigelse. p-værdier blev beregnet ifølge cellelevedygtighed 5 dage efter transfektion med undtagelse af microRNA precursor i NCI-N592 celle, som blev beregnet i forhold til antallet af celler tælles 9 dage efter den første transfektion

microRNA udtryk påvirker ikke narkotika følsomhed SCLC celler

Vi først testet sammenhængen mellem microRNA ekspression og følsomhed af de 14 SCLC cellelinjer til cisplatin og etoposid. Ikke overraskende følsomhed SCLC celler til etoposid korrelerer med sensitivitet over for cisplatin (korrelationskoefficient = 0,74, p = 0,004). Vi observerede, at ekspressionen af ​​de 7 microRNA’er ikke var forbundet med kemosensitivitet af SCLC celler til enten agent (tabel 3).

Vi næste vurderet, om overekspression eller nedregulering af miR-34a i SCLC celler ville påvirke kemoterapi følsomhed, som mIR-34a-ekspression blev rapporteret at være relateret til kemoterapi resistens i en prostatacancer-cellelinie [25]. NCI-H82-celler, som bærer en tavs TP53 mutation (tabel S4) blev transficeret med kontrol miR forløber, miR-34a forløber, kontrollere miR-hæmmer og miR-34a-hæmmer, og efterfølgende behandlet med cisplatin eller etoposid. IC

50 værdier upon cisplatin behandling var 0,9 ± 0,02 uM, 1,19 ± 0,3 pM, 0,83 ± 0,15 uM, og 0,79 ± 0,13 uM (p = 0,1 ved envejs ANOVA) (figur 2A og B). IC

50 værdier upon etoposid behandling var 0,28 ± 0,05 uM, 0,31 ± 0,04 uM, 0,54 ± 0,40 uM, og 0,58 ± 0,07 uM (p = 0,24) (figur 2C og D). For GLC4 celler, som bærer K132E mutation i TP53 genet (tabel S4), IC

50 værdier, cisplatin behandling var 3,03 ± 0,87 uM, 2,56 ± 0,85 uM, 1,87 ± 0,30 uM, og 1,92 ± 0,61 uM, henholdsvis (p = 0,14) (Figur S6A); IC

50 værdier upon etoposid behandling var 0,19 ± 0,03 pM, 0,28 ± 0,01 uM, 0,20 ± 0,03 uM, og 0,19 ± 0,06 uM (p = 0,08) (Figur S6B). Sammenfattende transient overekspression eller nedregulering af MIR-34a i SCLC celler påvirkede ikke følsomheden over for cisplatin eller etoposid, uanset TP53 status.

Celler blev transficeret med de anførte oligonukleotider. Fejl søjler indikerer standardafvigelse på analyser i tre eksemplarer.

Angivelse af miR-34a målgener varierer blandt cancer cellelinjer

Vi evaluerede udtryk for udvalgte miR-34a target-gener i SCLC og NSCLC cellelinier. Gener udvalgte var opfyldt [8], MAP2K1 [26], BCL2 [21], og AXL [27]. Vi observerede en omvendt korrelation mellem MIR-34a og c-MET, men ikke Bcl-2-ekspression i 5 SCLC-cellelinier (figur S7A og B). Trods relativt lavere miR-34a udtryk i SCLC cellelinjer (figur S1), vi ikke observere forholdsvis højere c-MET-ekspression i SCLC cellelinjer end i NSCLC cellelinier (Figur S7A). Vi observerede imidlertid en nedsat protein ekspression af cMET i A549 og NCI-H1299 NSCLC cellelinier transficeret med MIR-34a precursor (figur 3A). Siden cMET ekspression i NCI-H82 var målbart, ektopisk ekspression af MIR-34a eller bekæmpelse forstadier havde ingen effekt på cMET ekspression, som forventet. Et fald af bcl-2-protein-ekspression blev observeret i NCI-N592 celler transficeret med MIR-34a precursor (figur 3A). Da kun MAP2K1 men ikke MAP2K2 genet er målet for miR-34a, vi ikke registrere reduceret protein udtryk for MEK1 /2 i celler transficeret med miR-34a forløber; dette skyldes formentlig afskedigede roller MAP2K1 og 2. Transfektion af forstadie nedreguleret miR-34a mRNA ekspressionen af ​​AXL gen i A549 og NCI-H1299 NSCLC celler med mere end 70% (ændring af delta Ct med mere end 1,7), hvorimod mRNA ekspression af AXL-genet i NCI-H82 og NCI-N592 SCLC-celler var for lav til at blive detekteret ved real-time PCR assay (figur 3B). Sammenfattende viste vi, at ektopisk udtryk for miR-34a kunne nedregulere miR-34a target-gener i celler, der udtrykker målene.

(A) protein udtryk for miR-34a mål i cancer cellelinjer transficeres med kontrol precursor (C) eller mIR-34a precursor (M). (B) mRNA ekspression af AXL-genet i cancerceller transficeret med kontrol precursor eller MIR-34a precursor. RNA blev opsamlet 24 timer efter transfektion. Udtrykket af genet i NCI-H82 og NCI-N592 celler målbart (UD).

Diskussion

Her er vi viste udtryk for 7 kendte cancer-associerede microRNA’er i SCLC tumorer og cellelinier såvel som i NSCLC cellelinjer. Vi observerede, at ekspressionen af ​​disse microRNA’er var relateret til kliniske karakteristika og udfaldet af SCLC patienter. Angivelse af disse microRNA’er var relateret til følsomheden af ​​SCLC celler til cisplatin eller etoposid. Endvidere har overekspression eller nedregulering af MIR-34a ikke påvirke SCLC cellelevedygtighed eller følsomhed over for cisplatin og etoposid. Vi bemærkede endvidere, at ekspressionen af ​​miR-34a target gener kan variere fra SCLC og NSCLC-cellelinjer.

Selvom microRNA er ofte blevet undersøgt i flere kræfttyper, er der kun nogle få publikationer rettet rolle microRNA i den maligne opførsel af SCLC [20], [28], [29], [30]. Miko

et al.

Sammenlignet microRNA ekspression mellem SCLC cellelinjer og tumor-fri lungevæv fra patienter med kronisk obstruktiv lungesygdom [28]. Du

et al.

Sammenlignede microRNA ekspressionsmønsteret mellem 9 SCLC og 7 NSCLC cellelinier, og én mesotheliom cellelinje [20], og Guo

et al.

Sammenlignet en SCLC cellelinie, NCI-H69, med sin doxorubicin-resistente delaktionslinje [30]. Ranade

et al

rapporterede den eneste undersøgelse, ved hjælp af SCLC tumor prøver [29].; 16 microRNAer blev undersøgt for overlevelse analyse i 25 patienter, og miR-92a-2 * blev identificeret som en potentiel dårlig prognostisk markør.

Selvom udtryk for de 7 microRNA’er i vores undersøgelse blev evalueret i mange cancertyper

in vitro

,

in vivo

, og tumor prøver, de er ikke blevet evalueret før i forhold til patientens overlevelse i SCLC. Selvom vores undersøgelse er retrospektiv og patienten kohorte er lille, det er langt den største SCLC patient kohorte og indsamling af SCLC-cellelinjer undersøger microRNA udtryk i denne tumortype. I tråd med vores tidligere rapport, en posthoc analyse af et stort prospektivt, randomiseret studie i NSCLC [18], et udtryk for de 7 microRNA’er var ikke prognostisk heller ikke gjorde de korrelerer til resultatet behandling SCLC patienter. Vi kan ikke udelukke, at andre end de 7 microRNA’er præsenteret her microRNA kan være vigtigt for SCLC, og derfor yderligere undersøgelser kan være berettiget i SCLC at vurdere den prognostiske værdi af microRNA ikke er medtaget i denne undersøgelse.

miR- 34a er en bredt studeret tumor suppressor microRNA, der medierer apoptose, cellecyklus arrest, hæmning af spredning, ældning, og hæmning af invasion og migration i forskellige cancertyper (gennemgang af Hermeking

et al

. [31]). Tumor suppressor effekt af MIR-34a på cancerceller, kan imidlertid være tumortype specifik; hvorimod miR-34a nedregulerer væksten af ​​IMR-90 fibroblast [8] samt flere NSCLC cellelinjer [23], Li

et al.

viste, at overekspression af miR-34a har hverken påvirker celleproliferation, cellecyklusfordeling eller apoptose i en hepatocellulært carcinom cellelinje [32], og Pang

et al.

påvist, at overekspression af mIR-34a har ingen effekt på proliferation af cervikal cancer cellelinjer Hela og SiHa samt choriocarcinom cellelinie JAR [33]. MIR-34a er en direkte transkriptionel mål af p53 [8], og mutationer af TP53 genet er blevet fundet i mere end 75% af SCLC prøver [16]. En tendens favorisere lavere ekspression af MIR-34a i SCLC-cellelinier sammenlignet med tumor-fri lungevæv er blevet observeret tidligere [28]. Efter aftale med vores konstatering af, at ektopisk miR-34a udtryk ikke nedregulere cellevækst eller fremkalde G1 anholdelse, gjorde miR-34a udtryk ikke korrelere med sygdomsstatus (tabel S1) og progression (tabel 2) i SCLC patienter. Interessant nok alle SCLC celler testet i denne undersøgelse linier udtrykte lave cMET og Axl, to MIR-34a målgener. Det er sandsynligt, at væksten undertrykkelse effekt af miR-34a kan være vævs- og sygdomsspecifikke, dikteret muligvis ved iboende miR-34a target-genekspression i hvilke celler med lave niveauer af miR-34a target-genekspression, såsom SCLC celler, kan gøre miR-34a funktionelt impotent.

som konklusion, gjorde udtryk for 7 cancer-associerede microRNAer ikke korrelerer til kliniske resultater af SCLC patienter. miR-34a udtryk blev også ikke relateret til ondartet adfærd SCLC cancerceller og er dermed usandsynligt, at være en kandidat terapeutisk mål for denne sygdom.

Materialer og metoder

Patienter og etik redegørelse

Enogtredive formalinfikserede, paraffinindstøbte indlejret (FFPE) tumor prøver fra patienter, der indgik i et fase III-forsøg med Nord-Holland Oncology gruppe [22] blev opnået fra VU University Medical center, Amsterdam, Holland efter godkendelse af Institutional Review Board [22]. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle deltagere.

Cellelinjer

Et panel af 14 SCLC og 26 NSCLC cellelinjer blev undersøgt og er angivet i Materials S1. Alle cancer cellelinjer blev opretholdt i RPMI-1640 suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), med undtagelse af NCI-H792, der blev holdt i DMEM suppleret med 10% FBS. Den TP53 genmutation i cellelinjer blev bestemt ved at søge på p53 hjemmeside (https://p53.free.fr/), IARC TP53 Database (https://www-p53.iarc.fr/), og COSMIC database (https://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/).

RNA-ekstraktion

Totalt RNA blev ekstraheret fra FFPE prøver under anvendelse RECOVERALL Total nukleinsyreisolering kit (Ambion, Austin, TX) og total RNA fra cellelinier blev ekstraheret med Trizol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) i overensstemmelse med producentens anvisninger.

Kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR)

Angivelse af modne miRNA, herunder miR-21, miR-29b, miR-34a /b /c, miR-155, og lad-7a, blev vurderet af QRT-PCR-analyse som tidligere beskrevet [18] . RNU6B snRNA blev anvendt som en endogen kontrol. Hver microRNA assay blev udført tre gange. Angivelse af microRNA blev rapporteret som delta Ct-værdi (Ct værdi RNU6B – Ct værdien af ​​target microRNA). Vi definerede grupper af tumorer eller celler med høj eller lav ekspression baseret på medianen ekspression værdi af hver microRNA.

Ekspression af AXL-genet blev udført ved anvendelse af Taqman genekspression assay (Applied Biosystems) og blev rapporteret som delta Ct-værdi. GAPDH genet blev anvendt som endogen kontrol.

Transfektion af microRNA precursor eller inhibitorer

MIR-34a forløber og inhibitor samt Cy3-mærket kontrol miR forløber og inhibitor blev købt fra Ambion. Transfektion af miR-forløber eller inhibitor blev udført ved hjælp af siPORT ™

NeoFX

™ Transfektion Agent (Ambion) efter producentens anbefaling på en endelig oligonukleotid koncentration på 30 nM.

Cell vækstanalyse

for at bestemme virkningen af ​​transfektion på cellevækst, 5.000-10.000 celler transficeret med den angivne microRNA precursor eller inhibitor blev udpladet i 96-brønds plader. Cellevækst blev bestemt ved CellTiter 96 AQueousOne Solution celleproliferationsassay (Promega Corp. Madison, WI) hver 24. time i 5 på hinanden følgende dage. Resultaterne blev præsenteret som den optiske densitet (OD-værdi) absorbans ved 490 nm.

Gentagne transfectin af N592 celle

100.000 NCI-N592 SCLC celler blev udsået i plader med 24 brønde og transficeret med miR -34a precursor eller kontrol precursor. Celler blev høstet, talt og transficeret igen med de respektive miRNA hver 72. time.

væksthæmning analyser

Cisplatin og etoposid blev opnået fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MI). 10.000 celler blev podet i 96-brønds fladbundede plader, der var transficeret med angivne precursor eller inhibitor microRNAer, dyrket i 24 timer før tilsætning af forskellige koncentrationer af cisplatin og etoposid og inkuberet i yderligere 72 timer. De cytotoksiske virkninger af cisplatin og etoposid blev bestemt ved CellTiter 96 AQueousOne Solution celleproliferationsassay. Eksperimenter blev udført tre gange. Procentdelen af ​​cellelevedygtighed bestemtes ved at dividere absorbansværdierne af de behandlede celler af dem med de ubehandlede celler, og koncentrationen af ​​cisplatin eller etoposid resulterer i 50% væksthæmning (IC

50) blev bestemt.

Immunhistokemi undersøgelse

Immunhistokemi undersøgelse af p53 og bcl-2 i SCLC tumorer blev udført og rapporteret tidligere [22].

Western blot

NCI-N592 og A549 celler transficeret med mIR-34a precursor eller kontrol precursor blev inkuberet i 48 timer. Celler blev høstet, lysater blev fremstillet, og Western blot blev udført som tidligere [34] beskrevne. Antistoffer blev opnået fra Sigma-Aldrich (actin), Santa Cruz Biotechnology Inc (c-MET), Cell Signaling Technology (MEK1 /2), og Dako (bcl-2). Intensiteten af ​​c-MET og bcl-2 blev vurderet ved hjælp af GeneTools software (SynGene), normaliseret ved intensiteten af ​​actin, og kalibreret til ekspressionsniveauet i A549 og NCI-H146 celle, henholdsvis.

Cell cyklus analyse ved flowcytometri

48 timer efter transfektion blev cellerne opsamlet, vasket med kold PBS, fikseret med kold 70% ethanol i PBS i mindst 24 timer, og mærket med propidiumiodid før tælling celler. Efter farvning blev cellerne talt på FACScalibur hjælp CellQuest Pro-software (Becton Dickinson and Company, Frankin Lakes, NJ). Cellecyklus fraktioner blev analyseret ved hjælp af Modfit v3.0 software.

In situ

hybridisering af microRNA

In situ

hybridisering af miR-34b blev udført som tidligere beskrevet [18]. Nucleolar RNA U6 blev anvendt som positiv kontrol.

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført under anvendelse af SPSS-version 17,0 (SPSS, Chicago, IL). Overlevelse blev beregnet under anvendelse af Kaplan-Meier-metoden. Sammenligningen af ​​overlevelse mellem forskellige grupper blev bestemt ved log-rank test. Forskellene i microRNA udtryk mellem grupper blev analyseret af Wilcoxon Rank-Sum test. Sammenhængen mellem narkotika følsomhed og microRNA ekspression blev analyseret ved Spearman rank korrelation. Sammenligning af lægemiddel følsomhed celler transficeret med forskellige oligonukleotider blev udført ved envejs-analyse af varians (envejs ANOVA). Alle p-værdier var to-sider og p-værdier mindre end 0,05 blev betragtet signifikante.

Støtte oplysninger

figur S1.

Angivelse af microRNA i SCLC versus i NSCLC cellelinjer. En delta Ct-værdi på -15 indikerer, at ekspressionen af ​​microRNA i cellen er for lav til at blive detekteret

doi:. 10,1371 /journal.pone.0021300.s001

(TIF)

Figur S2.

in situ

hybridisering af microRNA i en SCLC tumor. Nucleolar RNA U6 og MIR-34b blev påvist under anvendelse af en biotinyl tyramid-baseret system med vektor NovaRed som substrat (brun). Prøver til scramble negativ kontrol og miR-34b blev co-farvet med Mayers hematoxylin (blå)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0021300.s002

(TIF)

Figur S3.

Korrelation af ekspression af p53 og (A) MIR-34a, (B) MIR-34b, og (C) MIR-34c, og (D) korrelation af ekspression af MIR-34a og bcl-2. Ekspression af p53 og bcl-2 blev præsenteret som procent af farvede celler ved immunohistokemi. Korrelationskoefficient (r) og p-værdi blev bestemt ved Spearman metode

doi:. 10,1371 /journal.pone.0021300.s003

(TIF)

Figur S4.

NCI-H82 celle transficeret med (A) Cy3-mærket microRNA inhibitor og (B) Cy3-mærket microRNA precursor.

doi: 10,1371 /journal.pone.0021300.s004

(TIF)

Figur S5.

Cellevækst assay af NCI-H1299 NSCLC celler transficeret med miR-34a eller kontrol forløber. Fejl barer refererer til standardafvigelser

doi:. 10,1371 /journal.pone.0021300.s005

(TIF)

Figur S6.

Vækst inhiberingsassay af GLC4 celler behandlet med (A) cisplatin og (B) etoposid. Celler blev transficeret med de anførte oligonukleotider. Fejl søjler indikerer standardafvigelse på analyser i tre eksemplarer

doi:. 10,1371 /journal.pone.0021300.s006

(TIF)

Figur S7.

Protein ekspression af c-MET og bcl-2 i 5 SCLC og 3 NSCLC cellelinier. (B) Korrelation mellem MIR-34a og c-MET-ekspression samt bcl-2 i 5 SCLC-cellelinier.

doi: 10,1371 /journal.pone.0021300.s007

(TIF)

tabel S1.

MikroRNA’er og kliniske covariables.

doi: 10,1371 /journal.pone.0021300.s008

(DOC)

tabel S2.

Effekt af kliniske covariables på progressionsfri overlevelse (PFS).

doi: 10,1371 /journal.pone.0021300.s009

(DOC)

tabel S3.

Effekt af microRNA ekspression på progressionsfri overlevelse (PFS, uger) i SCLC patienter stratificeret af begrænset sygdom eller omfattende sygdom.

doi: 10,1371 /journal.pone.0021300.s010

(DOC)

Tabel S4.

TP53 status og MIR-34a ekspression i SCLC-cellelinier.

doi: 10,1371 /journal.pone.0021300.s011

(DOC)

Materialer S1.

cancercellelinjer.

doi: 10,1371 /journal.pone.0021300.s012

(DOC)