PLoS ONE: Nikotin Aktiverer YAP1 gennem nAChR’er medieret signalering i spiserøret pladecellekræft (ESCC)

Abstrakt

Cigaretrygning er en etableret risikofaktor for esophageal kræft. Ja-associeret protein 1 (YAP1), nøglen transkriptionsfaktoren af ​​pattedyrs Hippo pathway, er blevet rapporteret at være et onkogent faktor for mange cancerformer. I denne undersøgelse finder vi nikotinindgivelse kan inducere nuklear translokation og aktivering af YAP1 i ESCC. Konsekvent, observerede vi nuklear translokation og aktivering af YAP1 ved knockdown af CHRNA3, som er en negativ regulator af nikotin signalering i bronchiale og esophageal cancerceller. Nikotin administration eller CHRNA3 udtømning væsentligt forøget proliferation og migration i esophageal kræftceller. Interessant, finder vi, at YAP1 fysisk interagerer med nAChRs, og nAChR’er-signalering dissocierer YAP1 fra dens negative regulatoriske kompleks sammensat med α-catenin, β-catenin og 14-3-3 i cytoplasmaet, hvilket fører til opregulering og nuklear translokation af YAP1. Denne proces sandsynligt kræve PKC-aktivering, som PKC specifik inhibitor Enzastaurin kan blokere nikotin induceret YAP1 aktivering. Derudover finder vi nikotin signalering inhiberer også interaktionen af ​​YAP1 med P63, som bidrager til den hæmmende virkning af nicotin på apoptose. Brug af immunhistokemi-analyse observerede vi opregulering af YAP1 i en betydelig del af esophageal cancer prøver. Konsekvent, har vi fundet en signifikant sammenhæng mellem YAP1 opregulering og cigaretrygning i de kliniske esophageal kræft prøver. Sammen disse resultater tyder på, at nikotin aktiverede nAChR’er signalvejen som yderligere aktiverer YAP1 spiller en vigtig rolle i udviklingen af ​​kræft i spiserøret, og denne mekanisme kan være af generel betydning for carcinogenese af rygerelaterede kræftsygdomme.

Henvisning: Zhao Y, Zhou W, Xue L, Zhang W, Zhan Q (2014) Nikotin Aktiverer YAP1 gennem nAChR’er medieret signalering i spiserøret pladecellekræft (ESCC). PLoS ONE 9 (3): e90836. doi: 10,1371 /journal.pone.0090836

Redaktør: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina

Modtaget: 9. januar 2014 Accepteret: 6 feb 2014; Udgivet: 12 marts 2014

Copyright: © 2014 Zhao et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse er blevet støttet af midler fra 973 National Key Fundamental Research Program Kina (2009CB521801) og National Natural Science Foundation of China (81.021.061). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Cigaretrygning er forbundet med en øget risiko for både pladecellekræft og adenocarcinom i spiserøret [1] – [3]. Nylige resultater antyder nikotin og dets derivater, såsom NNN (N-nitrosonornicotin) og NNK ((4-methylnitrosamino) -1- (3-pyridyl) -1-butanon) kan direkte aktivere nicotinacetylcholinreceptorer (nAChR’er) at stimulere væksten og angiogenese og undertrykke lægemiddelinduceret apoptose af cancercellerne [4]. Nicotinacetylcholinreceptorer (nAChRs) er en familie af ligand gate ionkanaler, der fungerer som de store regulatorer af nikotinsyre og acetylcholinergic signalering i cellerne. a-nAChRs og β-nAChRs er de mest almindelige nAChRs. Ubalancerede udtryk for forskellige undertyper af nAChRs i cellerne bidrager til patogenesen af ​​sygdomme, såsom cancer [4]. nAChRs er også kendt for at regulere cellulær adhæsion og migrering gennem deres interaktion med RapSyn og herparansulphate proteogly kan f.eks agrin [5] -. [7]

blevet observeret Overekspression og øget kernelokalisering af hippo pathway transkriptionsfaktor YAP1have i flere typer af humane cancere, herunder leverkræft, coloncancer, ovariecancer, lungecancere og prostatakræft [8]. Og amplifikationer af YAP1 genlocus observeres i intrakranielle ependymomas, orale planocellulært karcinom og medulloblastomer [8]. YAP1 blev rapporteret at være kræft drivende genet i det humane hepatocellulært carcinom (HCC) og brystcancer 11q22 amplikoner [9], [10]. Desuden YAP1 blev bestemt til at være en uafhængig prognostisk markør for samlet overlevelse af hepatocellulært carcinom og esophageal planocellulært karcinom [11], [12].

Dasgupta et al. rapporterede nikotin kan fremkalde op regulering af XIAP og Survivin (BIRC5) i ikke-småcellet lungekræft at hæmme apoptose induceret af kemoterapeutiske stoffer [13]. Og nikotin er kendt for at inducere ekspressionen af ​​CTGF (bindevæv vækstfaktor) i gingivale fibroblaster og i periodontale ligament celler, som bidrager til patogenesen af ​​periodontal fibrose [14]. Især Survivin og CTGF er to af de konserverede nedstrøms gener reguleret af transskriptionsfaktoren YAP1 af Hippo pathway [8], [15]. For nylig, Yu et al. rapporterede regulering af Hippo-YAP pathway af G-protein-koblet receptor signalering [15]. Og β2-nAChR blev rapporteret til at være fysisk forbundet med G-protein, αG protein-reguleret inducer af neurit ud vækst 1 og G-protein-aktiverede K (+) kanal 1, hvilket indikerer en mulig forbindelse mellem nAChR’er signalering og cellulære G-protein veje [ ,,,0],16]. Desuden blev YAP1 rapporteret at være opreguleret i esophageal kræftformer og bestemmes som et onkogen i esophageal cancer [11], [17]. forsøgte vi således at undersøge mulig sammenhæng mellem nikotin eksponering og YAP1 aktivering i kræft i spiserøret i denne undersøgelse.

Metoder

vævsprøver

Vores ESCC vævsprøver fra 83 patienter med patologisk T3 fase esophageal planocellulært karcinom blev indsamlet. Patienterne blev konsekutivt rekrutteret på det kinesiske Academy of Medical Sciences Cancer Hospital (Beijing, Kina). Ved rekruttering blev informeret samtykke opnået fra hver emne. De tilladelser blev i skriftlig form, blev hver patient informeret at underskrive samtykke til at bruge deres vævsprøver erhvervet fra kirurgi for forskning, før prøverne blev taget. Vi bevarede samtykke tabellen i vores medicinske database, og den etiske komité /IRB of Cancer Institute of Chinese Academy of Medical Sciences godkendte godkendelsesproceduren og undersøgelsen.

Cell Kultur og transfektion and Drug Administration

Humant ESCC cellelinier blev dyrket i RPMI 1640 medium suppleret med 10% føtalt bovint serum ved 37 ° C under 5% CO2 og mættet fugtighed. Esophageal cancer cellelinjer KYSE510, KYSE30 blev leveret generøst af Dr. Yutaka Shimada (Kyoto University). For de transiente transfektioner af plasmid og siRNA blev celler dyrket på 60-mm plader i 50-90% konfluens og transficeret med 200 p mol af siRNA anvendelse af lipofectamin 2000 (Invitrogen). Tre Stealth siRNAs målrettet til CHRNA3 designet og bestilt fra Invitrogen blev TureClone plasmid af TGFP-CHRNA3 købt fra OriGene. Celler blev transficeret med TGFP-CHRNA3 plasmid eller CHRNA3 siRNA anvendelse af lipofectamin 2000 (Invitrogen) ifølge producentens anvisninger. Frisk medium blev tilsat 6 timer efter transfektion. For nikotinindgivelse blev celler inkuberet i medium indeholdende 80 nM af nikotin i 48 timer eller længere. For Enzastaurin administration blev Enzastaruin tilsat til mediet i en koncentration på 500 uM i 48 timer.

Cell Growth Curve

Vækstkurve målt ved xCELLigence RTCA MP E-plade med 96 brønde, 3 × 10

3-celler blev tilsat til hver brønd ifølge protokollen af ​​xCELLigence System, blev cellevæksthastigheden overvåget i 81 timer. For celle vækstkurver læses af MTT-assay, 100 pi cellekultur indeholdende 3 × 10

3 celler blev tilsat til 30 brønde i en plade med 96 brønde. 20 pi methanethiosulfonate reagens (Promega) blev tilsat til 6 brønde hver gang ved 24 timer interval i 5 dage, efterfulgt med 1 timers inkubering ved 37 ° C og 5% CO

2, absorbansen blev aflæst ved 490 nm med en mikropladelæser.

Transwell migration og invasion assays Salg

Migration og invasion-assays blev udført med Cornings 80 pm 24 brønde transwell plade overtrukket med 30% Matrigel (300 pl /brønd, Falcon) . I alt 1 × 10

5-celler i 100 pi serumfrit medium blev tilsat til det øvre kammer af anordningen, og det nedre kammer blev fyldt med 600 pi kulturmedium med 20% føtalt bovint serum. Efter 6 timers inkubation ved 37 ° C blev ikke-migrerende celler fjernet fra den øvre overflade af membranen med en vatpind. Filtrene blev derefter fikseret i methanol i 10 minutter, farvet med Giemsa-opløsning i 1 time og talt. Fem tilfældige mikroskopiske felter (× 100) blev talt per brønd, og den gennemsnitlige blev bestemt.

Antistoffer og Special Reagenser

Kanin YAP1 antistof blev CHRNA3 antistof købt fra Proteintech gourp (Chicago, IL 60612, USA), muse YAP (63,7), blev GAPDH antistof indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Dallas, Texas 75220U.SA), Phospho-YAP (Ser127) antistof og β-catenin antistof, blev β-actin-antistof erhvervet fra Cell Signaling teknologi (Danvers, MA 01923), blev CHRNB4 antistof, CHRNA5 antistof og 14-3-3-antistof fremskaffet fra Abgent. TGFP antistof, P63 antistof, TGFP mærket CHRNA3 Tureclonevector blev købt fra OriGene (Beijing, Kina 101.111), blev α-cateninantistof købt fra LifeTechnologies (Carlsbad, CA 92008). Rekombinant GST mærket YAP1 protein blev købt fra Abnova (Taipei City Taiwan114). PKC-inhibitor Enzastaurin blev købt fra Selleck kemikalier (München, Tyskland 81829). Nikotin blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO 63103). Salg

immunofluorescensbestemmelse Salg

KYSE510 celler blev podet på dækglas i en 6-brønds plade i 24-48 timer, celler blev fikseret med methanol i 10 minutter ved stuetemperatur og vasket med PBS. Efter inkubation med tilhørende antistof i 1 time ved stuetemperatur blev pladerne vasket og incu1’bated med FITC-konjugeret gede anti-kanin IgG. Efter at være blevet vasket med PBS blev cellerne farvet med DAPI og undersøgt med en laser-scanning konfokal mikroskop (Leica Microsystems Heiderg GmbH, Am Friedensplatz 3, Tyskland).

Kvantitativ Real Time PCR

I alt RNA fra KYSE510 celler blev ekstraheret med TRIzol (Life technologies (Carlsbad, CA 92008)). Første-streng cDNA blev syntetiseret ved anvendelse af Superscript II-revers transkriptase-kit (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. Real-time PCR (qPCR) blev udført ved anvendelse SYBR Premix Ex Taq (Takara) på en ABI 7300 Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Alle prøver blev normaliseret til GAPDH

De gen-specifikke PCR-primerpar anvendt i denne undersøgelse:.

YAP1 (GGCGCTCTTCAACGCCGTCATGAAC /CCTGTCGGGAGTGGGATTT)

CTGF (CCAATGACAACGCCTCCTG /TGGTGCAGCCAGAAAGCTC) ;

Cyr61 (AGCCTCGCATCCTATACAACC /TTCTTTCACAAGGCGGCACTC)

EDN1 (TGTGTCTACTTCTGCCACCT /CCCTGAGTTCTTTTCCTGCTT)

PPP1ReB (GGACACGTTCTCCTTCGAC /AGATTTTAACTCAGCCCGGAT)

survivin (CCTGGCTCCTCTACTGTT /CTCTATTCTGTCTCCTCATCC)

GAPDH (GCTGAGAACGGGAAGCTTGT /GCCAGGGGTGCTAAGCAGTT)

Western blotting, Immunoprecipitation, og GST Pull-down analyser

Western blot analyse blev udført som følger. Celler blev opsamlet og centrifugeret til høst. Celler blev lysedon is i 40 min i RIPA-buffer (10 mM Tris, pH 7,4, 150 mMNaCl, 1% Triton X-100, 0,1% natriumdeoxycholat, 0,1% SDS og 5 mM EDTA) indeholdende Complete Protease Inhibitor Mixture (Sigma). Lysater blev klaret ved centrifugering ved 12,000relative centrifugalkraft i 20 minutter ved 4 ° C. Til Western-blotting blev 40 ug totalt protein suspenderet i prøvepuffer. For immunopræcipitation blev lysater inkuberet med primaryantibody efterfulgt af inkubation med protein A-agarose-perler (Invitrogen). Immunkomplekserne blev vasket og suspendedin prøvepuffer. I GST pull-down assay blev glutathionperler (Sigma) inkuberet med Escherichia coli-udtrykte GST-YAP1or GST alene i 4 timer. Glutathionebeads blev derefter vasket og inkuberet i 4 timer med lysater af KYSE510 celler. Efter vask blev protein-komplekser suspenderet i prøvepuffer. Alt protein blev fyldt i hver wellof en 15% SDS-PAGE. Geler blev overført til PVDF-membraner (Bio-Rad), blokeret med 5% mælk /PBS og inkuberet natten over ved 4 ° C med primære antistoffer. Efter vask og inkubering med sekundære antistoffer i 5% mælk blev membranen vasket, og de positive signaler blev udviklet med kemiluminescens-reagens (Amersham). Membranen blev eksponeret for medicinsk røntgenfilm (Fuji Ltd., Tokyo, Japan).

Flowcytometrisk analyse

vitale, apoptotiske og beskadigede celler blev separeret ved flowcytometri. Den kvantitative bestemmelse af procentdelen af ​​celler, som undergår apoptose blev udført under anvendelse af en annexin V-FITC apoptosis afsløring kit (Cliniscience S.A.) ifølge producentens instruktioner. Kort fortalt, 48 timer efter behandling med nikotin, 2 × 10

5-celler blev mærket fluorescerende til påvisning af apoptotiske og nekrotiske celler ved tilsætning 195 pi annexin V bindingsbuffer og 5 pi af annexin V-FITC til hver prøve. Prøver blev blandet forsigtigt og inkuberet ved stuetemperatur i mørke i 3 min, 10 pi propidiumiodid (PI; Sigma) blev tilsat til hver prøve og inkuberet ved stuetemperatur i 10 min. Før cytometrisk analyse blev cellesuspensionen tilsat 300 pi annexin V-bindingsbuffer. Et minimum af 10.000 celler i gated region blev erhvervet og analyseret med Cell Quest software.

immunhistokemisk farvning og vurdering

Alle væv blev fikseret i 4% neutraliseret formaldehyd, indlejret i paraffin. Blokke af paraffin-indstøbt donor væv blev udtaget ved hjælp af en manuel Tissue arrayer 1 instrument (Beecher Instruments, Silver Spring, MA, USA). To kerner blev skåret fra hver donor blok for TMA blokke. Sektioner (5 um) af vævsarray blokken blev skåret og anbragt på polylysin-coated objektglas og bearbejdet til IHC. Fra prøverne til rådighed, blev syv væv array-blokke forberedt, hver indeholdende 30 tilfælde med tumor, normal og lymfeknuder node væv hvis tilgængelig. De væv microarray dias blev afparaffiniseret i xylen og gradient ethanol. Antigen genfinding blev udført ved at anbringe objektglassene i et højt trykkoger i en 0,01 mM citratbuffer, pH 6,0, i 2,5 minutter ved 100 ° C; de blev derefter afkølet i 20 min. Endogen peroxidaseaktivitet blev blokeret ved at inkubere sektion i 3% H

2O

2 i 10 minutter, efterfulgt af skylning i PBS-opløsning tre gange. Snittene blev inkuberet med kanin-anti-YAP1 antistof (Proteintech) ved en fortynding på 1:50 ved 4 ° C natten over blev Objektglassene inkuberes derefter i 1 time i sekundært antistof. En EnVision kit (Dako, Carpinteria, CA, USA) blev anvendt til at visualisere antistofbinding, og objektglassene blev efterfølgende modfarvet med hematoxylin. En PBS-only farvning prøve blev anvendt som en baggrundskontrol. De væv array-slides blev scannet og analyseret med AperioScanScope CS. Baseret på immunfarvning intensitet blev esophageal væv opdelt i fire kategorier som YAP1 negative (-), svag positivitet af YAP1 (+), median positivitet af YAP1 (+ +), stærk positivitet af YAP1 (+ + +). Alle eksperimenter blev udført og gentaget mindst tre gange. Data blev analyseret med SPSS 11.5software. Korrelationer mellem undergrupper af farvning og cigaretrygning blev beregnet ved hjælp af Pearson χ2 test.

Resultater

Nikotin fremmer væksten og migration af kræft i spiserøret

Nikotin er kendt for at være en vigtig risikofaktor for kræft i spiserøret. De tidligere rapporter viser, at nikotin fremmer cellevækst og migration i forskellige typer af humane cancere [4], [18]. Således vi først testede vækststimulerende virkninger af nikotin i kræft i spiserøret KYSE510 cellelinje med xCELLigence RTCA MP E-plade med 96 brønde, og observeret, at nikotin administration væsentligt forbedret vækstraten på KYSE510 celler (figur 1 A). Derudover gennemførte vi transwell assay for at undersøge virkningerne af nicotin for migration af KYSE510 celle og også observeret en betydelig forøgelse af migrationen af ​​KYSE510 celle behandlet med nikotin (figur 1 B).

A. Nikotin administration stimulerer væksten af ​​kræft i spiserøret KYSE510 celle målt ved E-Plateofx CELLigence RTCA MP-system. B. Nikotin administration steg invasionen og migration af esophageal cancer KYSE30 celler i Transwell analyser. C. subcellulære lokalisering af YAP1 undersøgt med konfokal fluorescensmikroskop. Translokation af YAP1 (grøn) fra cytoplasmaet til kernen blev observeret efter nikotinindgivelse i KYSE510 celler i 48 timer. D. KYSE510 celler blev behandlet med nikotin i 48 hs, nedsat phosphorylering af YAP1 og øget dephosphoryleret YAP1 blev observeret ved Western blot analyse. E. Real-time PCR verifikation af induktion af mRNA’er af gener transkriptionelt aktiveret ved YAP1 ved nikotin administration. F. PKC-inhibitor Enzastaurin blokeret nikotin induceret upregualtion af YAP1 proteinniveau, og resulterede i reduktion af YAP proteinniveau, især dephosphorylerede form af YAP1 ved Western blot.

Nikotin inducerer YAP1 nukleare translokation og aktivering

Up regulering og øget nuklear lokalisering af Hippo pathway transskription faktor YAP1 blev rapporteret at være den uafhængige markør for dårligere overlevelse for kræft i spiserøret [11]. For at vurdere, om nikotin eksponering ville resulterede i aktivering af YAP1. Vi undersøgte den subcellulære lokalisering af YAP1 i kræft i spiserøret KYSE510 celle ved hjælp konfokal immunofluorescens mikroskop efter eksponering for nikotin. Efter cellerne blev dyrket i medier indeholdende nikotin i en koncentration på 80 nM i 48 timer, observerede vi en øget nuklear translokation af YAP1, som manifesteret ved YAP1 akkumulering i cellekernen efter celler behandlet med nikotin (Figur 1 C). Eftersom nuklear translokation og aktivering af YAP1 reguleres af phosphorylering af YAP1 på S127 website [8], derefter målt vi ændringerne i phosphorylering niveau af YAP1 før og efter nikotin behandling. Som vist i figur 1 D, nedsat phosphorylering af YAP1 og blev observeret øget protein niveau af dephosphoryleret YAP1 efter nikotin administration. Vi undersøgte yderligere mRNA-ekspression af CTGF, et YAP1 målrettet nedstrøms gen, og fundet, at mRNA-niveauer af CTGF var forhøjet ved nikotin administration. Men vi ikke observere signifikant opregulering af YAP1 mRNA efter nikotin administration (Figur 1 E). Disse resultater antyder, at efter nikotinindgivelse, YAP1 undergår nuklear translokation og til gengæld transkriptionelt aktiverer dens downstream gener herunder CTGF.

PKC er blevet rapporteret at være påkrævet for nAChR-aktivering ved at danne en auto-positiv feedback loop for aktiveringen af nicotinacetylcholinreceptorer [19], [20]. Det er også blevet identificeret som en YAP1 kinase [21]. Således behandlede vi cellerne med PKC specifik inhibitor Enzastaurin at se om YAP1 aktivering kan blokeres af PKC-inhibering. Vi observerede, Enzastaurin behandling væsentlige blokeret YAP1 aktivering induceret af nikotin som angivet ved et dramatisk fald i total protein niveau af YAP1, især dephosphoryleret YAP1 (figur 1 F). Dette resultat antyder, at aktiveringen af ​​YAP1 induceret af nikotin medieres gennem PKC.

Knockdown af CHRNA3 også induceret YAP1 aktivering

Det er blevet vist, at CHRNA5 (neuronal acetylcholin-receptor subunit a-5) og CHRNA3 (neuronal acetylcholin receptor subunit alfa-3) som negative regulatorer af nikotin signalering i bronkierne kræft og kræft i spiserøret celler [22]. Fordi knockdown af CHRNA3 og CHRNA5 øget spredning, migration og calcium tilstrømning af lungekræft-cellelinjer, som følge af en kompenserende stigning i samlingen af ​​α7-nAChR på cytoplasmaet membran, som havde højere permeabilitet til calcium som reaktion på nikotin. Således vi ansat siRNA tilgange til knockdown CHRNA3 i KSYE-510 celle og derefter undersøgt virkningerne af CHRNA3 udtynding på væksten og migration af KYSE510 celler, og om aktivering af YAP1 så godt. Vi observerede en stigning på væksthastigheden og migration i KYSE510 celler ved CHRNA3 knockdown, der ligner den, der ses i nikotinindgivelse (figur 2 A, figur 2 B). Konsekvent, blev et fald på YAP1 phosphorylering, især på S127-stedet i YAP1 vist ved western blot (figur 2 C). Med konfokal immunofluorescens mikroskop vi også observeret nukleare translokation af YAP1 i KYSE510 celler efter CHRNA3 knockdown (Figur 2 D). Desuden blev den transskriptionelle induktion af CTGF og andre YAP1 nedstrøms gener også observeret i cellerne tavse for CHRNA3 (Figur 2 E).

A. Cell vækstkurve målt med MTT assay angivet siRNA-medieret knockdown af CHRNA3 øget vækst på KYSE510 celler. B. Transwell assay viste, at knockdown af CHRNA3 øgede invasionen og migration af KYSE30 celler. C. Western blot analyse viste 3 Stealth siRNA konstruktioner effektivt slået ned CHRNA3. Udtømning af CHRNA3 førte til et fald i phosphoryleret YAP1 og en øget af dephosphoryleret YAP1, især en reduceret S127 fosforylering af YAP1. D. Observation af YAP1 subcellulære lokalisering med konfokal fluorescensmikroskopi efter udtømning af CHRNA3. Translokation af YAP1 (grøn) fra cytoplasmaet til kernen blev observeret efter siRNA-medieret knockdown af CHRNA3 i KYSE510 celler i 48 timer. E. Real-time PCR-test indikerede YAP1 målrettede gener blev induceret ved CHRNA3 knockdown i KYSE510 celle.

Fysiske interaktioner mellem nAChR’er og YAP1

For yderligere at udforske den regulerende rolle nAChRs med YAP1, gennemførte vi immunopræcipitationsforsøg at undersøge om nAChRs fysisk interagere med YAP1. Som vist i figur 3 A, blev de klare interaktioner mellem YAP1 og CHRNA3 /CHRNA5 /CHRNB4 identificeret. Samspillet mellem YAP1 og CHRNA3 blev verificeret med eksogent transficeret TGFP-mærket CHRNA3 i KYSE510 celler (Figur 3 B). Derudover gennemførte vi GST pull down assay til yderligere at samspillet mellem YAP1 og CHRNA3 med eksogent udtrykte GST-mærket YAP1 (Abnova). GST-pull down eksperiment viste også med et positivt samspil mellem endogen CHRNA3 og GST-YAP1 (Figur 3 C). Dernæst brugte vi konfokal immunofluorescens mikroskop for at undersøge colokalisering mellem CHRNA3 og YAP1. Vi fandt, at både CHRNA3 og YAP1 blev colocalized på membranen regionen og i cytoplasmaet af KYSE510 celler (figur 3 D). Kollektivt, disse observationer tyder nAChR’er fysisk forbinder med YAP1 i esophageal kræftceller. 14-3-3 er den bindende partner YAP1 i cytoplasmaet, vi også observeret positive interaktioner mellem 14-3-3 og CHRNA3 /CHRNA5 /CHRNB4 med immunopræcipitationsassay i KYSE510 celle (Figur 3 E).

EN. Endogen IP test viste positive protein interaktioner mellem YAP1 og CHRNA3 /CHRNB4 /CHRNA5 i KYSE510 celler. B. Positiv samspil mellem TGFP-CHRNA3 og YAP1 blev påvist i celler transficeret med TGFP-CHRNA3. C. GST Træk analysen indikeret positivt samspil mellem eksogent udtrykte GST-YAP1 med CHRNA3 i KYSE510 celle. D. Konfokal immunfluorescensmikroskopi observeret colokalisering af YAP1 og CHRNA3 i KYSE510 celle. De KYSE510 celler blev forbigående udtrykt TGFP mærket CHRNA3 af TureClone vektor (OriGene). YAP1 blev mærket med rød-FITC konjugeret gede-anti-kanin IgG. Cellekerner blev visualiseret med DAPI. E. endogene IP opdaget positive interaktioner mellem 14-3-3 og CHRNA3 /CHRNB4 /CHRNA5.

Dissociation af de negative regulatorer af YAP1 af nikotin behandling

transkriptionsaktivitet og protein niveau af YAP1 vides at være negativt reguleret af 14-3-3, α-catenin og β-catenin [8], [23], [24]. Phosphoryleret YAP1 kan binde med P63, og sådan forbindelse forøger stabiliteten af ​​P63 og bidrager til P63-medieret lægemiddel-induceret apoptose [21]. forsøgte vi således at undersøge effekten af ​​nikotin på interaktionerne mellem YAP1 med α-catenin, β-catenin, 14-3-3, og P63. Som vist i figur 4, blev interaktionerne mellem YAP1 med α-catenin, β-catenin, 14-3-3, og p63 sprængt ved nikotinindgivelse (figur 4 A), hvilket er i overensstemmelse med vores observationer, at nikotin behandling øgede nukleare translokation og aktivering af YAP1. Nedsat interaktion YAP1 med 14-3-3, α-catenin, ville β-catenin resultere i en forøgelse af total protein niveau af YAP1. Konsekvent, har vi observeret en betydelig stigning i YAP1 proteinniveauet ved langvarig nikotin behandling (figur 4 B). Som P63 er en vigtig regulator af apoptose, og ændret samspil mellem YAP1 og P63 ville forringe de apoptotiske responser medieret af P63. Konsekvent, observerede vi faldt apoptose af KYSE510 celler behandlet med nikotin (figur 5).

B. KYSE510 celler udsat for nikotin i mere end 4 dage førte til opregulering af totalt protein niveau af YAP1, herunder både den phosphorylerede YAP1 og dephosphoryleret YAP1 indikeret ved western blot-analyse.

Nikotin behandling faldt forælderen af ​​apoptotiske celler i nederste højre kvadrant.

Immunhistokemi analyse af YAP1 i kliniske prøver

det er påvist, at esophageal cancer patienter med opregulering af YAP1 havde en dårligere samlet overlevelse end dem med normal ekspression af YAP1 [11]. Således brugte vi kliniske kræft i spiserøret prøver at undersøge sammenhængen mellem opreguleret udtryk for YAP1 og cigaretrygning. Vi indsamlede esophageal kræft prøver fra 83 patienter på T3 stadium, herunder 29 ikke-rygere og 54 rygere. Vi har udført immunhistokemi eksperiment for at analysere ekspressionsniveauet af YAP1 i kræft i spiserøret prøver, og fandt, at kræftpatienter med rygning historie viste høj ekspression af YAP1 sammenlignet med de ikke-ryger patienter (

P

0,05) (figur 6 og tabel 1). Således disse konstatering gå sammen med vore observationer, som YAP1 blev aktiveret af nikotin administration in vitro. Men vi ikke oplever en betydelig forskel i den samlede overlevelse mellem YAP1-høje og YAP1-lave grupper, sandsynligvis på grund af disse kræft prøver var fra T3 fase esophageal kræft patienter.

Glassene blev scannet af AperioScanScope CS. Vævsprøver var inddelt i 4 kategorier baseret på intensiteten af ​​YAP1 farvning.

Diskussion

Nikotin er en etableret onkogen faktor, der bidrager til patogenesen af ​​talrige kræftformer, herunder esophageal kræft [3], [4]. Og nikotin er kendt for at fremme proliferation af cancerceller gennem aktivering af catecholamin signaleringskaskade [4], [25], [26]. Konsekvent vi observeret en øget vækstrate for esophageal kræftceller ved nikotin behandling eller ved knockdown af CHRNA3. Flere grupper har rapporteret, at nikotin eksponering og cigaretrygning kan fremme erhvervelse af kræft stamceller ud, og epitelial-mesenkymale overgang i oral cancer, hoved og hals pladecellekræft, lungekræft, og brystkræft [27] – [30]. Interessant Nallet-Staubet al. har vist, at YAP1 og TAZ bidrage til invasive og metastatiske kapacitet af melanomceller [31]. Og Chen et al. rapporterede YAP1 som en vigtig mediator af TLR4 /NANOG onkogen pathway i at opretholde tumorfremkaldende stamceller-lignende celler (TIC) population ved undertrykkelse af cytostatisk TGF-β-signalering i HCC [32]. Disse observationer er i overensstemmelse med den tidlige observation, at YAP1 homolog TAZ er påkrævet for at opretholde selvfornyelse og tumor-initiation kapacitet i brystcancer stamceller [33]. I denne undersøgelse har vi vist, at nikotin administration eller CHRNA3 udtynding fører til en stigning af cellevækst og migration, og inducerer resistens mod apoptose i esophageal kræftceller.

G-protein koblede receptorer (GPCR’er) kan aktivere eller hæmme Hippo-YAP pathway afhængigt af koblede G-proteiner. Og lysophosphatidsyre (LPA) og sphingosin-1-phosphat (S1P) blev rapporteret at være opstrøms agonister i denne signalvej for at aktivere YAP1 /TAZ gennem regulering lats kinaseaktivitet ved at modulere actin cytoskeleton dynamik [15]. GPCRs kan aktivere calcium signalering kaskade gennem PLC /IP3R /PKC vej [34]. Og calcium-signalering er kendt for at regulere actin dynamik og cellens motilitet gennem modulering af de nedstrøms Rho GTPase signalveje [34], [35]. Således nicotin kan aktivere YAP1 gennem nAChRs medierede calciumindløb. Interessant, vi observerede PKC specifik inhibitor Enzastaurin var i stand til at blokere aktiveringen af ​​YAP1 af nikotin administration, hvilket er i overensstemmelse med PKC rolle i potensere calciumkanaler at øge calcium tilstrømning [36].

I denne undersøgelse bestemt vi samspillet mellem nAChR’er og YAP1, indikerer nAChR’er medieret signalering kan have en direkte virkning på YAP1 aktivering, hvilket er yderligere understøttet af observationer, der CHRNA3 co-lokaliserer med YAP1. Endvidere observerede vi ændret fysiske associationer mellem YAP1 og α-catenin /β-catenin /14-3-3 ved aktiveringen af ​​YAP1 af nikotin indgivelse i esophageal cancer celle. Det er tidligere blevet rapporteret α-catenin og β-catenin interagere fysisk med YAP1 til negativt reguleret YAP1 aktivitet og dens nedbrydning [23], [24]. Associationen mellem YAP1 og α-catenin medieres af 14-3-3 og at IQGAP1 er en af ​​de høj konfidens bindingspartnere af YAP1 [23]. Interessant, 14-3-3 interagerer med nAChRs og bindsler nAChRs i specifikke membran domæner gennem en interaktion med et multi-subunit-kompleks, bestående af APC, EB1, IQGAP1 og MACF, som er forankret til mikrotubuluscytoskelettet [37]. 14-3-3 fremmer også den forreste transport af N-cadherin /p-catenin-komplekser fra ER [38]. Desuden β-catenin interagerer med RapSyn at regulere klyngedannelse af nAChR’er i muskelceller [39]. I denne undersøgelse, vi observerede positive interaktioner mellem 14-3-3 og CHRNA3 /CHRNA5 /CHRNB4 i KYSE510 celle. Disse resultater tyder nAChRs, 14-3-3, IQGAP1, α-catenin og β-catenin kan danne en cytoskelet forankret negative regulering kompleks med YAP1, og 14-3-3 tjener som den fælles binding adapter af komplekset. Dette kompleks regulerer negativt YAP1 aktivering og nuklear translokation og tøjr YAP1 til cytoskelettet i cytoplasmaet.