PLoS ONE: Folliculin Bidrager til VHL Tumor Undertrykkelse Aktivitet i nyrekræft gennem forordning af Autophagy

Abstrakte

Von Hippel-Lindau tumor suppressor (VHL) er tabt i de fleste klare celle nyrecellecancere (ccRCC). Folliculin (FLCN) er en tumorsuppressor, hvis funktion er tabt i Birt-Hogg-Dubé syndrom (BHD), en sygdom karakteriseret ved nyrecancer af multiple histologiske typer, herunder klart cellecarcinom, kutan fibrofolliculoma, og pneumothorax. Her udforskede vi, om der er forbindelse mellem VHL og FLCN i klar celle renale karcinom cellelinjer og tumorer. Vi viser, at VHL regulerer ekspression af FLCN på mRNA og protein niveauer i RCC-cellelinjer, og at FLCN proteinekspression er nedsat hos humane ccRCC tumorer med

VHL

tab sammenlignet med matchede normale nyrevæv. Knockdown af FLCN resulterer i forøget dannelse af tumorer ved RCC-celler med vildtype-VHL i ortotopisk xenotransplantater i nøgne mus, en indikation af, at FLCN spiller en rolle i det tumor-undertrykkende aktivitet af VHL. Interessant FLCN lighed med VHL, er nødvendig for aktiviteten af ​​LC3C-medieret autophagic program, som vi tidligere har karakteriseret som bidrager til tumoren undertrykke aktiviteten af ​​VHL. Resultaterne viser, at der findes funktionelle krydstale mellem to store tumorsuppressorer i nyrekræft, VHL og FLCN, konvergerende om regulering af autophagy

Henvisning:. Bastola P, Stratton Y, Kellner E, Mikhaylova O, Yi Y, Sartor MA, et al. (2013) Folliculin Bidrager til VHL Tumor Undertrykkelse Aktivitet i nyrekræft gennem forordning af Autophagy. PLoS ONE 8 (7): e70030. doi: 10,1371 /journal.pone.0070030

Redaktør: Rajvir Dahiya, UCSF /VA Medical Center, USA

Modtaget: 16. april, 2013; Accepteret: 14 Juni 2013; Udgivet: 29 juli 2013

Copyright: © 2013 Bastola et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Myrovlytis Trust , Research Grant; NIH /NCI CA122346; BLR D VAmerit AwardB101BX0011100-02; UC P30-ES006096CEG. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

nyrekræft udgør 2% til 3% af alle voksne maligniteter i USA. I 2011 blev der rapporteret mere end 64,770 nye tilfælde og 13.000 dødsfald, og forekomsten er støt stigende med 2,5% om året. ccRCC repræsenterer flertallet (85% til 90%) af voksne nyre kræft og er den mest maligne formular. Denne kræft er karakteriseret ved et tidligt tab af VHL tumor suppressor på den korte arm af kromosom 3 i de fleste tumorer (80%). Det er velkendt, at tab af VHL resulterer i øget akkumulering og aktivitet af hypoxi-inducerbare transkriptionsfaktor (HIF), der på skift aktiverer ekspression af gener, der fremmer tumorvækst. Blandt disse er angiogene faktorer, som fører til øget blodgennemstrømning gennem tumorerne og dermed at øge leveringen af ​​næringsstoffer og ilt til cancerceller. Gener, der stimulerer anaerob glykolyse er også aktiveret, og dette understøtter tilpasning til reduceret tilgængelighed af næringsstoffer og flytter kræftceller mod metaboliske veje, der fremmer tumorvækst. For nylig opdagede vi, at en anden tumor-undertrykkende pathway reguleres af VHL. Vi fandt, at VHL er en vigtig regulator af processen med macroautophagy (autofagi) [1]. Vi bestemt, at VHL, ved at inducere microRNA-204, hæmmet LC3B-medieret autophagy som er nødvendig for ccRCC tumorvækst. Desuden VHL, ved at hæmme HIF, inducerede ekspression og aktivitet af en LC3B paralog, LC3C. I modsætning til LC3B, LC3C virker som en tumorsuppressor [1].

I processen med at søge efter nye VHL-inducerede gener, der kunne deltage i det tumor-undertrykkende aktivitet af VHL, opdagede vi, at rekonstituering af vildtype -typen VHL i RCC celler med tabt

VHL

inducerede specifik og væsentlig berigelse for gener udtrykt fra Smith-Magenis locus (SM) på den korte arm af kromosom 17p11.2. Smith-Magenis syndrom er en kompleks adfærdsbetinget karakteriseret ved intellektuel svækkelse, kraniofaciale og skelet anomalier, og søvnforstyrrelser [2]. Interessant nok indeholder dette locus anden nyre tumor-suppressor-gen, folliculin (FLCN), hvis aktivitet er tabt i den genetiske autosomal-dominant sygdom, Birt-Hogg-Dubé syndrom (BHD) [3]. BHD er kendetegnet ved hud fibrofolliculomas, pulmonal cyster og spontan pneumothorax, samt nyrecancer af blandede histologiske typer, herunder kromofobt, oncocytic, klar celle, og papillær typen [3]. Formålet med dette arbejde var at bestemme, om FLCN bidrager til tumoren undertrykke aktiviteten af ​​VHL. Vi viser, at FLCN bidrager til VHL-medieret hæmning af tumorvækst ved at påvirke LC3B og LC3C autophagic veje.

Materialer og Metoder

Cell Culture Metoder og behandlinger

Vores metode til generering pools af humant VHL (-) og VHL (+) 786-O, A498 og Caki-1-celler blev beskrevet af os før [1], [4], [5]. RCC4 celler gave fra Dr. Jamie Kairo (Jefferson University) og blev beskrevet af os før [6]. Autophagic flusmidler blev udført som beskrevet før [1]. For protein eller RNA-ekstraktion blev celler udpladet, 24 timer senere blev mediet ændret til at med enten 10% eller 0,1% serum, og cellerne blev opsamlet 48 timer senere. Celler blev derefter lyseret i RIPA buffer med protease, phosphatase og proteasomalaktivitet inhibitorer for PAGE-analyse, eller i TRI Reagens til RNA-ekstraktion. For RNAi eksperimenter, pLKO.1-baserede shRNA konstruktioner til FLCN (TRCN0000005969, TRCN0000005970, og TRCN0000010979; Open Biosystems) blev VSV-G kuvert emballeret (Cincinnati Børnehospital Medical Center viral vektor Core) og inficeres i celler, som derefter blev behandlet med plasmid-relevant selektionsreagenser. VHL shRNA konstruktioner blev beskrevet før [5]. Transduktioner med lentiviral partikler blev udført under anvendelse af 2 ug /ml polybren.

Menneskelig RCC Tumorer

frisk frosset prøver af ccRCC tumorer (n = 128) og matches normale nyreprøver (n = 114 ) blev opnået og analyseret for

VHL

sekvens og proteinekspression, som tidligere beskrevet [4]. Prøver blev analyseret for ekspression af protein og mRNA, også som beskrevet før.

Kvantitativ RT-PCR

I mRNA analyse, blev prøverne først revers transkriberet under anvendelse af TaqMan microRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) og kvantificeres med real-time PCR på et Applied Biosystems 7900HT Hurtig real-Time CRSystem. QRT-PCR blev udført som beskrevet før, og anvendelse af primere, der er beskrevet i tabel S4. Beskrivelse af RNA mikroarrays er tilvejebragt i Supplemental Methods. Salg

Western blot analyse

Total cellelysater blev opnået ved lysering celler i RIPA-buffer indeholdende proteinase og phosphataseinhibitorer. 5 til 30 ug af ekstrakter blev separeret på 4% til 12% eller 10% polyacrylamidgeler og overført til PVDF-membraner. Semikvantitativ immunoblotting for humane RCC tumorer og matchede normale nyrer blev udført som tidligere beskrevet [4]. De følgende polyklonale antistoffer blev opnået fra Cell Signaling Technology (Danvar, MA): anti-FLCN, anti S6 kinase 1 og T

389 phosphorylering; anti S6 og S

240/244 phosphorylering; anti 4EBP og T

37/46 eller S

65 fosforylering. Polyklonalt anti-LC3B (Abcam, Cambridge, MA) og anti-LC3C (Abgent, San Diego, CA) blev anvendt. Følgende muse monoklonale antistoffer blev anvendt: anti-VHL (Pharmingen, San Jose, CA), anti-hæmagglutinin (Boehringer Ingelheim, Østrig); og anti-GAPDH (Abcam, Cambridge, MA).

Mus xenograft Eksperimenter

For de intra-nyre injektioner, 30.000 celler resuspenderedes i Matrigel til et endeligt volumen på 30 pi, og derefter injiceres langsomt nogle få millimeter under nyre capsula af 4- til 5-uger gamle athymiske nøgne mus. Efter 10 til 12 uger musene aflivet, blev tumorer med nyrer indsamlet og fikseret i 4% paraformaldehyd, paraffin indlejret, og H 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Etik Statement

Alle forsøg på mus blev udført i nøje overensstemmelse med den protokol, der er godkendt af University of Cincinnati Institutional Animal Care og brug Udvalg. (protokol nummer: 06-07-21-01). Alle operation blev udført under isofluran anæstesi og blev gjort alle bestræbelser på at minimere smerte. Alle humane prøver var anonyme og undtaget fra University of Cincinnati Intern Review Board protokol krav.

Resultater

Angivelse af FLCN er induceret af VHL

at identificere de VHL-inducerede gener som kunne deltage i det tumor-undertrykkende aktivitet af VHL, udførte vi mRNA microarray eksperimenter, hvor vi sammenlignede genekspression i humane RCC 786-O VHL (-) celler og de samme celler med rekonstitueret, vildtype-VHL (786-O VHL (+)). Statistisk analyse identificeret 1.310 udskrifter udtrykkes forskelligt i de to celletyper (FDR 0,1 og 50% ændring i udtrykket niveau). (Tabel S1)

Interessant, blandt de 588 udskrifter induceret af rekonstituering af VHL, vi fandt en signifikant berigelse i gener lokaliseret på den korte arm af kromosom 17 (10,71% af alle signifikant inducerede gener), og især i cytoband 17p11.2, som indeholder SM locus (1,7% af alle signifikant inducerede gener) (tabel 1 og S2). Der var også en koncentration af gener induceret af VHL på kromosom 14 (7,85% af alle signifikant inducerede gener) med de vigtigste cytoband bliver 14q22.1. VHL-medieret induktion af flere af SM-generne blev yderligere bekræftet ved kvantitativ RT-PCR (fig. S1). I modsætning hertil blev gener, blev undertrykt af VHL beriget på kromosom 7 (63 gener, 9,75% af alle signifikant undertrykte gener) og kromosom 9 (42 gener, 6,5% af alle undertrykte gener) (tabel S3).

SM locus indeholder et gen, der koder en anden renal nyre tumor suppressor, FLCN. Analyse af FLCN mRNA og protein afslørede forøget ekspression af både i 786-O og A498-celler med rekonstitueret VHL, sammenlignet med forældrenes VHL (-) celler (. Figur 1A og B). Derudover blev FLCN mRNA og proteinekspression undertrykkes i Caki1 renal cancerceller, hvor vi bankede ned endogen VHL-ekspression ved hjælp shRNA (fig. 1C og 1D). Ændringen i FLCN mRNA-ekspression var i området fra 1,5 til 2 gange, i lighed med andre SM gener (sammenlign med fig. S1). Men induktion på niveau af protein var i 3- til 4 gange rækkevidde, en indikation af, at posttranskriptionel mekanismer spiller en rolle i denne forordning. I disse studier har vi også observeret VHL-medieret induktion af p53, et andet gen lokaliseret på kromosom 17p13.1 i nærheden af ​​SM-locuset, således at validere en konstatering af, at der tidligere er blevet beskrevet af andre [7].

Rekonstituering af VHL i 786-O og A498-celler førte til induktion af FLCN og p53 mRNA’er (A) og proteiner (B). Knockdown af VHL i Caki-1-celler resulterede i nedsat FLCN mRNA (C) og protein (D) niveauer; *** P 0,001, ** P 0,01. Scr- scramble kontrol virus.

Fordi VHL er tabt i sporadisk klar celle renalcellecarcinom (ccRCC), målt vi udtryk for FLCN i lysater fra humane ccRCC tumorer sammenlignet med tilstødende nyrevæv i prøver med kendt

VHL

status. Vi har tidligere beskrevet population af humane ccRCC-normal nyre-par, som vi brugte til denne analyse [4]. Den FLCN protein blev analyseret ved semikvantitativ immunoblotting som beskrevet tidligere [4] og mRNA blev bestemt ved kvantitativ RT-PCR. Ekspression af FLCN protein blev markant nedsat i ccRCC tumorer sammenlignet med normale nyrer i populationen af ​​ccRCC med

VHL

udgår (fig. 2A og 2B). I modsætning hertil ser vi ikke signifikante forskelle i FLCN niveauer, når man sammenligner ccRCC med vildtype

VHL

til den tilsvarende normale nyrevæv (Fig. 2C). Interessant niveauerne af FLCN mRNA adskilte sig ikke mellem tumor-nyre par i enten gruppe af tumorer (fig. 2D), understøtter en rolle for posttranskriptionel mekanismer i reguleringen af ​​FLCN udtryk.

Analyse af FLCN protein (A C) og mRNA (D) i prøver af den menneskelige ccRCC med kendt

VHL

status, sammenlignet med tilstødende nyrevæv. A. En repræsentant western blot analyse af FLCN protein i par af nyre (K) og tumor med tabt

VHL

(VHL-DEL) adskilt på 10% SIDE. Den nedre bånd kan repræsentere en nedbrydning eller posttranslationel modifikation af FLCN. B og C. Kvantificering af FLCN proteinekspression i tumorer, der havde mistet

VHL

(VHL-DEL) og tumorer med vildtype

VHL

(VHL-WT). Boksene repræsenterer nedre og øvre kvartil adskilt af medianen (tyk vandret linje) og knurhår strække sig op til minimum og maksimum værdier, bortset fra punkter, der er uden for 1,5 interkvartile område fra kassen (markeret som cirkler). Betyder ± SD for hver fordeling er angivet med lukkede prikker og krydser på knurhår henholdsvis. D. Kvantitativ RT-PCR målinger af FLCN mRNA-niveauer i nyrer og ccRCC VHL-DEL og VHL-WT tumorer.

FLCN Bidrager til VHL-medieret Tumor Suppression

For at afgøre, om der var en funktionel forbindelse mellem FLCN og tumor-undertrykkende aktivitet af VHL, vi slået ned ekspression af FLCN i 786-O VHL (+) celler ved anvendelse af tre forskellige shRNAs (fig. 3A). Vi derefter injiceres disse celler under nyre kapsler af nøgne mus, hvilket resulterede i øget tumor forekomst og større tumorstørrelse, sammenlignet med tumorer afledt af injicerede kontrol celler, der blev transduceret med lentivirus indeholdende scramble sekvens (fig. 3B). De tumorer med FLCN knockdown havde en meget ondartet, dedifferentierede fænotype (fig. 3C).

shRNA-induceret knockdown af FLCN fremmer tumor dannelse ved 786-O celler med rekonstitueret VHL. A. Western blot der viser et fald i FLCN proteinekspression i celler, der stabilt udtrykker tre forskellige FLCN shRNAs sammenlignet med celler transficeret med scramble (SCR) kontrol. B. Kvantificering af forekomsten og vægten af ​​tumorer dannet af de angivne cellelinjer i ortotopisk xenotransplantater. NK- gennemsnitsvægt på normale nyrer. C. H & E farvning af repræsentative afsnit for tumorer dyrket af VHL (+) /kapløbet kontrol celler og VHL (+) celler med FLCN knockdowns. Skalapanelerne = 50 um.

Fordi FLCN blev vist at inhibere aktiviteten af ​​mTORC1 pathway i UOK257 celler og musemodeller for BHD nyrekræft [8], [9], analyserede vi virkningerne af FLCN knockdown på aktiviteten af ​​denne vej i cellerne anvendes til disse ortotopisk xenotransplantater. Vigtigere, knockdown af FLCN resulterede i nedsat mTORC1 aktivitet (fig. 4A), som målt ved phosphorylering af S6K, S6 og 4EBP, i dyrkede celler. Vi har også bestemt ekspression af S6 og S6-P er snit fra xenotransplantater tumorer dannet af VHL (+) /forvrænge transficerede celler vs. tumorer dannet af disse celler med FLCN slået ned. Konsekvent med resultaterne opnået fra celle kultur eksperimenter, sektioner fra VHL (+) /FLCNKD tumorer udviste lavere farvning for S6-P, som sammenlignet med kontrol væv, mens farvning for total S6 var ens (fig. 4B). Dette resultat tyder på, at augmented aktivitet mTORC1 vej ikke bidrager til øget tumorvækst i disse celler.

A. Western blot analyse af mTOR downstream mål i 786-O VHL (+) celler, der stabilt udtrykker enten scramble eller to forskellige FLCN shRNAs. GAPDH ladningskontrol er vist for hver gruppe af immunoblots forarbejdet fra den samme gel. B. Repræsentative snit af de angivet tumorer farvet for S6 og S6P. Scale bar = 50 um.

For nylig har vi beskrevet, at VHL undertrykker LC3B-medieret, pro-onkogen autophagy mens det stimulerer en roman tumor undertrykke autophagic program, medieret af LC3C [1]. LC3s er veletablerede autophagic regulatorer, der er nødvendige for dannelsen af ​​de dobbelte membran autophagosomes og for erhvervelse af lasten. Så undersøgte vi, hvis FLCN kan udøve sin tumor undertrykkende aktivitet nedstrøms fra VHL ved at regulere LC3C eller LC3B autofagi. LC3C induceres af sult i VHL (+) celler, hvilket således i disse forsøg blev VHL (+) 786-O og RCC4 celler udsultet i 0,1% serum i 48 timer og derefter behandlet i 1 time med chloroquin, en lysosomal inhibitor for at inhibere autophagic flow og akkumuleringen af ​​den hurtigere migrerende, lipideret form, (LC-II) ifølge LC3B og LC3C blev målt ved Western blotting. Vi fandt, at knockdown af FLCN resulterede i et betydeligt fald i ophobning af LC3C med en stigning i LC3B både cellelinjer (fig. 5). Ændringen i LC3B i VHL (+) RCC-celler var ikke forbundet med nogen konsistente ændringer i MIR-204 (data ikke vist). Dette resultat indikerer, at FLCN regulerer autofagi samme måde VHL, og dermed virkningerne på autophagy kan være delvist ansvarlig for bidrag FLCN til tumoren undertrykke aktiviteten af ​​VHL.

Knockdown af FLCN (shRNA 3) i 786- O (A) eller RCC4 (B) VHL (+) celler reducerer akkumulering af tumor undertrykkende LC3C-II, men inducerer ekspression af onkogen LC3B-II. Western blots blev probet med viste antistoffer. C. Kvantificering af 3 uafhængige forsøg som vist i panel A og B. LC3 proteinniveauer målt ved optisk tæthed blev først normaliseret til GAPDH. Så forholdet mellem LC3 blev beregnet mellem LC3 niveauer målt i chloroquin-behandlede prøver i celler med FLCN bankede og kontrolceller (sammenlign bane 6 til bane 3 i panel A og B). D. Model af den foreslåede forordning.

Diskussion

Her rapporterede vi, at VHL regulerer ekspressionen af ​​FLCN og at til gengæld FLCN deltager i tumoren undertrykke aktiviteten af ​​VHL. De observerede effekter af FLCN knockdown på tumorvækst er i overensstemmelse med den negative effekt af FLCN overekspression på dannelsen af ​​tumorer ved 786-O VHL (-) celler, som observeret af andre [10]. Vigtigere, FLCN regulerer LC3B og LC3C autophagic programmer på en måde svarende til VHL, dvs. FLCN inhiberer LC3B og stimulerer LC3C autophagic aktivitet (fig. 5D). Fordi vi viste, at både LC3B og LC3C motion vigtige og modsatrettede effekter på væksten af ​​ccRCC tumorer [1], foreslår vi, at bidraget fra FLCN til tumor-undertrykke aktiviteten af ​​VHL resultater, i det mindste delvist, fra dens virkninger på autofagi (Fig . 5D). Regulering af LC3B af FLCN sandsynligvis repræsenterer en mekanisme tillæg til den tidligere beskrevet af os VHL-medieret hæmning af LC3B gennem miR-204, da vi ikke måle konsistente effekter af FLCN på miR-204. Samtidig begge tumorsuppressorer kunne inducere ekspression af LC3C gennem undertrykkelse af HIF, eftersom LC3C er en HIF-inhiberet gen. VHL er velkendt for sin evne til at inhibere HIF-aS proteinekspression og aktivitet. Senest har FLCN også blevet rapporteret at formindske HIF aktivitet, selv om den ikke påvirker ophobning af HIF-aS underenheder [11].

Den særlige rolle FLCN i regulering af autofagi understøttes yderligere af den nyligt identificeret tilstedeværelse af Denn domæne i det carboxyterminale område af FLCN [12]. Dette motiv er også til stede i folicullin associeret protein-1 og 2 (FNIP1 og FNIP2 [13]), og interessant nok i et andet protein udtrykt fra SM locus, SMCR8 [13], som også vi fundet at blive induceret af VHL (Fig . S1). Disse proteiner fungerer som BNP-GTP exchange faktorer (GEFs) for RAB GTPaser, potentielt er nødvendige for autophagy forbundet menneskehandel og fusion [11], [13].

SM locus har ikke været forbundet med ccRCC. Tidligere kun ét gen fra dette locus, TNFSF13 (tumornekrosefaktor superfamilien 13), var blevet undersøgt i denne henseende. Det viste sig at udvise reducerede mRNA-niveauer i ccRCC sammenlignet med normal nyre. Desuden blev højere niveauer af denne receptor er vist at være korreleret med bedre samlet og sygdomsfri overlevelse [14]. Det er dog muligt, at yderligere analyse vil afsløre yderligere autofagi-funktioner af gener udtrykt fra SM locus.

FLCN bidrager til VHL-induceret tumor undertrykkelse af en mekanisme, der ikke synes at indebære aktivering af mTOR pathway. Faktisk, i 786-O celler med rekonstitueret VHL og FLCN bankede-down, vi faktisk viste en kraftig reduktion i flere phosphoryleringsbegivenheder, der anvendes som indikatorer for mTOR aktivitet. I overensstemmelse med inhibering af mTOR målte vi øget akkumulering af LC3B, et meget anvendt autophagic udlæsning, og denne øgede LC3B-medieret autophagy kan bidrage til tumorvækst. De observerede effekter af FLCN på mTOR aktivitet er i overensstemmelse med flere publikationer rapporterer en positiv sammenhæng mellem niveauer af FLCN og mTOR i U251, HEK293, HK-2, ACHN, 786-O VHL (-) celler [15]. Men den nuværende kanoniske forståelse af FLCN-mTOR forbindelse er, at FLCN negativt regulerer mTOR pathway [8], [9], [16]. I den forbindelse den menneskelige UOK257 cellelinie afledt af en BHD patient, der ikke udtrykker VHL, viser en høj grad af mTOR-aktivitet, og mus med FLCN knockout demonstrerer høje niveauer af S6 phosphorylering [8], [9]. Årsagen til denne uoverensstemmelse er i øjeblikket ikke forstået, men måske dataene peger i retning af en opdelte effekt af FLCN på mTOR, der er påvirket af den cellulære kontekst, såsom aktivitet VHL. Ikke desto mindre kan tilslutningen af ​​VHL til en tumor suppressor, der regulerer en metabolisk vej i nyrekræft afslører et nyt aspekt af VHL tumor-undertrykke aktivitet, der er et supplement til sine roller i reguleringen af ​​angiogenese og autofagi.

Vigtigere , FLCN protein niveauer er formindsket i menneskelig ccRCC med

VHL

tab, yderligere underbygger en rolle for denne tumor suppressor i væksten i ccRCC. Hidtil har ingen FLCN mutationer eller ændringer i mRNA-niveauer er målt i ccRCC. Denne konvergens i funktioner VHL og FLCN er af særlig interesse i betragtning af, at klare celle karcinom kan være en del af det multihistological type nyrekræft, der opstår i BHD syndrom.

Arten af ​​den direkte molekylære mekanisme som VHL inducerer FLCN renal tumorsuppressorer mangler at blive fastlagt, men vil sandsynligvis involvere flere mekanismer. Fordi vi målte en effekt af VHL på FLCN mRNA steady state-niveauerne i RCC-cellelinjer, forventer vi en vis grad af transskriptionel induktion eller stabilisering af FLCN mRNA. I den forbindelse har vi ikke finde nogen effekter af p53 knockdown på FLCN udtryk. Fordi vi ikke finde ændringer i FLCN mRNA niveauer mellem humane nyre-tumor-par, selvom vi fundet forskel i steady-state af FLCN protein, foreslår vi, at der også er en vigtig translationel komponent til denne forordning, eventuelt afhængig af specificitet forskellige nyre cellepopulationer. En forklaring er, at VHL kan undertrykke ekspression af specifikke microRNAer, hvilket igen undertrykker FLCN oversættelse.

Sammenfattende med den aktuelle undersøgelse, har vi givet første beviser for en direkte forbindelse mellem VHL og FLCN tumor-undertrykkende veje konvergerende om regulering af autophagy i nyrekræft.

Støtte Information

figur S1.

VHL inducerer ekspressionen af ​​flere gener udtrykt fra Smith-Magenis locus i 786-0 og A498 celler. Grafen viser ændringer i ekspression af individuelle mRNA baseret på kvantitative QRT-PCR målinger. Fold ændringer repræsenterer forskellen i ekspressionen af ​​mRNA’er i VHL (+) versus VHL (-) celler. Sekvensen af ​​primere findes i

doi:. 10,1371 /journal.pone.0070030.s001

(PDF)

tabel S1.

Liste over gener betydeligt undertrykt eller fremkaldt af VHL i 786-O celler. Fold ændringer repræsenterer VHL (+) /VHL (-) forholdet

doi:. 10,1371 /journal.pone.0070030.s002

(DOCX)

tabel S2.

Gener betydeligt fremkaldt af VHL og beriget for specifikke kromosom eller cytoband

doi:. 10,1371 /journal.pone.0070030.s003

(XLS)

tabel S3.

Gener betydeligt reduceret med VHL og beriget for specifikke kromosom eller cytoband

doi:. 10,1371 /journal.pone.0070030.s004

(DOCX)

Tabel S4.

Sekvens af primere for de angivne gener, der anvendes i QRT-PCR

doi:. 10,1371 /journal.pone.0070030.s005

(DOCX)

Tak

Vi tak G. Doerman for udarbejdelse af figurer og Dr. M. Daston til redigering af manuskriptet.