PLoS ONE: Novel aptamer-Nanopartikel biokonjugater Forbedrer Levering af Anticancer Drug til MUC1-positive cancerceller in vitro

Abstrakt

MUC1 protein er et attraktivt mål for anticancer drug delivery grund af sin overekspression i de fleste adenokarcinomer. I denne undersøgelse, er en rapporteret MUC1 protein aptamer udnyttet som targeting agent for en nanopartikel-baserede lægemiddelafgivelsessystem. Paclitaxel (PTX) indlæst poly (mælke-co-glycol-syre) (PLGA) nanopartikler blev formuleret af en emulsion /fordampning metode, og MUC1 aptamerer (APT) blev konjugeret til partikeloverfladen gennem en DNA spacer. Aptameren konjugeret nanopartikler (Apt-NPS) er omkring 225,3 nm i størrelse med en stabil

in vitro

lægemiddelfrigivelsesprofil. Brug af MCF-7 brystcancer celle som et MUC1-overekspression model, den MUC1 aptamer øgede optagelsen af ​​nanopartikler i målcellerne som målt ved flowcytometri. Desuden PTX indlæst Apt-NP’er forstærket

in vitro

lægemiddelafgivelse og cytotoksicitet til MUC1

+ cancerceller sammenlignet med ikke-målrettede nanopartikler, der mangler MUC1 aptamer (P 0,01). Virkemåden af ​​denne nye aptamer-nanopartikler biokonjugaterne tyder på, at MUC1 aptamerer kan have potentiel anvendelse i målrettet drug delivery mod MUC1-overekspression tumorer

Henvisning:. Yu C, Hu Y, Duan J, Yuan W, Wang C, xu H, et al. (2011) Novel aptamer-Nanopartikel biokonjugater Forbedrer Levering af Anticancer Drug til MUC1-positive cancerceller

In Vitro

. PLoS ONE 6 (9): e24077. doi: 10,1371 /journal.pone.0024077

Redaktør: Tarl Wayne Prow, University of Queensland, Australien

Modtaget: Maj 2, 2011; Accepteret: 29 Juli 2011; Udgivet 1. september, 2011

Copyright: © 2011 Yu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne anerkende finansieringen støtte fra det kinesiske ministerium for videnskab og teknologi (2011CB911003, 2011CB911004, 2011CB933504) og Natural Science Foundation of China (81.071.870). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kemoterapi er en primær behandling for kræft, men dens effektivitet er ofte begrænset på grund af tilknyttede bivirkninger. Målrettet lægemiddeltilførselssystem kan overvinde den ikke-specifikke toksicitet kemoterapi, fordi det kan dirigere anticancerlægemidler til tumorceller og undgå toksicitet over for normale celler. I mange tilfælde har nanopartikel (NP) bevist store muligheder for lægemiddeladministration på grund af den passive tumor-targeting effekt af øget permeabilitet og retention (EPR), der udvises af de fleste nano-bærere [1]. Desuden kunne en aktiv målretning virkning realiseres, hvis en målsøgende middel er konjugeret til nanopartikel overflade. I fortiden, monoklonale antistoffer (mAb’er) var de foreslåede målrettende midler [2]. Sidst, roman målrettede midler, herunder aptamerer [3], korte peptider [4] og andre små molekyler [5], er blevet den nye generation målrette molekyler. Aptamerer er små strenge af DNA eller RNA, der kan danne unikke 3-dimensionelle strukturer, der specifikt tilsammen molekylære mål med høj affinitet. Sammenligning med andre målretning agenter, aptamerer besidder karakteristiske fordele: lave syntese omkostninger, lav immunogenicitet, lille størrelse, der gør det nemt at trænge igennem solide tumorer, og høj affinitet sammenlignelig med monoklonale antistoffer til binding til næsten alle molekyler. Tidligere har aptamerer held været anvendt som målrettede midler til at forbedre drug delivery til prostatakræft [6], [7], [8] og lymfoblastisk leukæmi celler [9].

Ovenstående studier har banet vejen for udnytte aptamer-konjugeret nanopartikler til at udvikle målrettede drug delivery-systemer. Men studerede fleste aptamer-guidede nanopartikler hidtil rettet mod prostatakræft [6], [7], [8], og aptamer-styrede nano-bærere til lægemiddelafgivelse til andre kræftformer er ikke blevet rapporteret i litteraturen. Det ville være at foretrække, hvis en aptamer over for en bred vifte af cancere anvendes til at konstruere en målrettet lægemiddelafgivelsessystem. MUC1 mucin er en stor transmembrant glycoprotein, hvis udtryk steget mindst 10 gange i de fleste maligne adenokarcinomer, hvilket gør det til et ideelt målmolekyle for kemoterapeutika [10]. Glycosyleringen og distribution af proteinet på celleoverfladen er unormale i æggestokkene, lunge, pancreas og prostatacancer, såvel som i primære og metastatiske brystcancer, som er den mest almindelige cancer hos kvinder med 1,4 millioner tilfælde rapporteret i 2008 [11 ]. For nylig blev flere MUC1 aptamerer udviklet af C.S.M. Ferreira et al. [12], og en af ​​dem blev anvendt til selektivt at levere fototoksin til kræftceller

in vitro

[13]. Men indtil videre, nanopartikel-baserede anticancer drug delivery system rettet mod MUC1 protein er ikke blevet rapporteret i litteraturen. Blandt de offentliggjorte MUC1 aptamerer, S2.2 er en 25-base-oligonucleotid, der binder til MUC1 protein med relativ høj affinitet og specificitet [12], [13]. I denne undersøgelse konstruerede vi et MUC1 aptamer-konjugeret nanopartikel med S2.2 til administration af paclitaxel til MUC1-positive tumorceller, der kombinerer fordelene ved aptamer som målsøgende middel og styrkerne ved nanopartikel som lægemiddelbærer. Vi undersøgte sine grundlæggende egenskaber og evalueret levering effektivitet

in vitro

ved hjælp af et MUC1-overekspression model MCF-7-cellelinje. Vi rapporterer nu, at MUC1 aptamer-nanopartikel forbedrer leveringen af ​​anticancer stof til MUC1-positive MCF-7 celler

in vitro

.

Materialer og Metoder

Materialer

MUC1 aptamer S2.2 (5′-GCA GTT GAT FTT TTG GAT ACC CTG G-3 ‘) blev syntetiseret af Invitrogen (Shanghai, Kina). En modificeret aptamer S2.2-spacer, lavet af S2.2 og et designet DNA spacer (5’-GCA GTT GAT FTT TTG GAT ACC CTG GTT CCC TTC CTT CTC TCT TCC TCT CTC CTT CTC TCT TCC TCT CTC CTT C-3 ‘) blev også syntetiseret. Nogle aptamerer blev ændret med 3’-NH

2 eller 5′-FITC på en som nødvendige base. Poly (mælke-co-glycol-syre) (PLGA, 50:50, MW = 16.000),

N

-hydroxysulfosuccinimide (NHS), 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimid-hydrochlorid (EDC ), paclitaxel (PTX), 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI), fluoresceinisothiocyanat (FITC) og poloxamer 188 var alle af analytisk kvalitet.

MCF-7 og HepG2-cellelinier blev opnået fra Cell center of Chinese Academy of Medical Sciences (Beijing, Kina). Celler blev dyrket i DMEM-medium suppleret med 100 enheder /ml vandig penicillin G, 100 mg /ml streptomycin og 10% FBS ved koncentrationer for at tillade 70% konfluens i 24 timer.

nanopartikler forberedelse

paclitaxel indkapslede nanopartikler blev fremstillet ved anvendelse af en emulsion /fordampningsteknik. Kort fortalt blev 0,1 mg PTX og 2,0 mg PLGA opløses i 0,2 ml ethylacetat og blandes med 1,0 ml 5% poloxamer vandig opløsning i 30 s med lydbehandling (200 w) i et isbad. Emulsionen blev forsigtigt omrørt og opløsningsmidlet afdampet ved 40 ° C i 2 timer. Efter inddampning blev suspensionen centrifugeret ved 100.000 g i 30 min. Supernatanten blev fjernet, og udfældningen blev resuspenderet i dobbeltdestilleret vand. Til bedømmelse af den cellulære optagelse af Apt-NP, blev FITC indkapslet i nanopartikler i stedet for PTX, i en koncentration på 0,25 mg /ml.

Karakterisering af nanopartikler

Partikelstørrelsen blev bestemt ved dynamisk lysspredning (Malvern Zetasizer Nano ZS, UK). 1,0 mg NP eller apt-NP’er blev opløst i 1,0 ml dobbeltdestilleret vand. De partikelstørrelsesfordelinger blev målt ved en spredningsvinkel på 90 °. Intensiteten-vægtede middelværdi blev registreret som gennemsnittet af tre målinger.

For at bestemme PTX lastning, 1,0 mg lyofiliseret PTX-Apt-nationale parlamenter blev lyseret i NaOH (1 M) og UV-absorbans (Thermo NanoDrop 1000, US) blev målt ved en bølgelængde på 227 nm. 1,0 mg frysetørret almindeligt NP’er blev brugt som parallelle kontroller for at eliminere virkningerne af baggrunden. Den PTX blev kvantitativt bestemt ved sammenligning med en standardkurve.

Konjugation af aptamerer til nanopartikler

Konjugeringen af ​​aptamerer eller tilfældige DNA til nanopartikler blev gennemført via tværbinding af -COOH og -NH

2. Kort beskrevet blev 50 pi PTX-NP’er (10 ug /ml i DNase RNase-frit vand) inkuberet med 100 pi af 40 mM 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimid-hydrochlorid (EDC) og 100 pi 10 mM

N

-hydroxysulfosuccinimide (NHS) i 15 minutter ved stuetemperatur under forsigtig omrøring. Så de aktiverede partikler blev kovalent bundet til 50 pi 3′-NH

2-modificeret MUC1 aptamer (1 ug /ml i DNase RNase-frit vand) eller 3′-NH

2, 5′-FITC- modificeret MUC1 aptamer på en efter nødvendige base, i 2 timer ved stuetemperatur. De resulterende aptamer-nanopartikel biokonjugater blev vasket, resuspenderet, og bevaret i DNase RNase-frit vand. Konjugeringen af ​​5′-FITC, 3′-NH

2-modificeret MUC1 aptamer til PLGA-mikropartikler (0,5 mg /ml) blev analyseret ved flowcytometri (Accuri C6, US).

Cellular binding af aptamerer

Den cellulære binding af aptamerer blev bestemt ved flowcytometri (FCM) analyse af celler efter inkubation med FITC-mærket tilfældige DNA (Ran), S2.2 aptamer eller S2.2-spacer. MCF-7 og HepG2-celler blev forsigtigt skrabet og vasket med D Hanks to gange. Cellerne blev suspenderet i bindingspuffer (100 mM NaCl, 5 mM MgCl

2, pH 7,2) og inkuberet med Ran, MUC1 aptamer S2.2 eller S2.2-spacer ved en koncentration på 300 nM i 30 minutter. FCM-analyse blev udført for at undersøge bindingen af ​​tilfældige DNA eller aptamerer til begge cellelinier.

In vitro

release profil PTX fra Apt-nationale parlamenter

in vitro

frigivelse af PTX fra Apt-NP’er blev detekteret ved membranen diffusion teknik. PTX-apt-NP’er blev suspenderet i phosphatbuffer saltvand (PBS, pH 7,4) indeholdende 0,5% (vægt /volumen) poloxamer. 5 ml af suspensionen (2 mg /ml) blev indført i en dialysepose (MWCO 3500) og derefter nedsænket i 95 ml frigive medium i en inkubator-ryster sat til 120 rpm ved 37 ° C. Ved de forudbestemte tidsintervaller blev prøver udtaget og erstattet med frisk frigivelsesmedium. Nanopartikler og frigivet PTX blev separeret ved ultracentrifugering ved 100.000 g i 30 minutter ved 4 ° C. Den PTX i supernatanten blev bestemt ved UV-spektrofotometer ved en bølgelængde på 227 nm. Procenterne kumulative release af PTX fra Apt-nationale parlamenter blev beregnet som følger og plottet mod tid.

Cellular optagelse eksperiment

cellulære optagelse af partiklerne blev bestemt ved FCM-analyse af celler efter inkubation med FITC indkapslede partikler. MCF-7 og HepG2-celler blev dyrket i plader med 24 brønde i 24 timer. Cellerne blev derefter inkuberet med 50 pg /ml FITC indkapslede NP’er eller Apt-NP’er i 2 timer ved 37 ° C. FCM-analyse blev derefter udført for at undersøge den cellulære fluorescens optagelse af både cancer cellelinjer.

Konfokal fluorescens scanning mikroskopi

cellulære optagelse af nationale parlamenter eller Apt-nationale parlamenter af MCF-7 blev yderligere undersøgt ved konfokal fluorescens scanning mikroskopi (Perkin Elmer Ultraview, US). MCF-7-celler fik lov til at klæbe til et glas dækglas i 6-brønds plade i 24 timer. Cellerne blev derefter inkuberet med 100 ug /ml NPs eller Apt-NP, begge indeholdende FITC, i 2 timer ved 37 ° C. Derefter blev cellerne vasket med D Hanks og behandlet med 0,25% trypsin i 1 minut. De suspenderede celler blev overført til et centrifugerør og vaskes to gange. Cellerne blev derefter fikseret med 4% formaldehyd i 10 minutter ved 4 ° C og analyseret ved konfokal fluorescens scanning mikroskopi.

In vitro

cytotoksicitet

For at evaluere cytotoksiciteten virkninger af PTX-Apt-NPs mod MCF-7 og HepG2-celler, blev begge cellelinier dyrket i plader med 96 brønde. Cellerne blev behandlet med glatte NP’er, fri PTX, PTX-loaded NP’er (PTX-NP’er) og PTX-loaded Apt-NP’er (PTX-Apt-NP’er). PTX-loaded NP’er konjugeret til tilfældig DNA (PTX-R-NP’er) blev også anvendt til at tjene som en anden kontrol. MCF-7 og HepG2-celler blev co-dyrket med de respektive stoffer på en ækvivalent PTX dosis på 0,05 ug /ml i 4 timer ved 37 ° C, derefter vasket med D Hanks (2 × 500 pi per brønd). Celler blev dyrket i yderligere 48 timer og derefter MTS assay (Promega, USA) blev anvendt til at bestemme levedygtigheden celle pr standardprotokol skitseret af fremstillingen.

Udførtes

Statistisk analyse

Statistisk analyse hjælp Statistisk analyse System (SAS, Version 9.2). En-vejs ANOVA med Fishers mindste signifikante forskel (LSD) post hoc sammenligninger på 99% konfidensintervallet blev brugt til statistiske sammenligninger. Alle data præsenteres som en middelværdi med sin standardafvigelse angivet (middelværdi ± SD).

Resultater

Udarbejdelse af Apt-nationale parlamenters

PTX-Apt-nationale parlamenter blev bygget som skitseret i fig. 1 under anvendelse af en rutinemæssig emulsion /fordampning metode. PTX blev inkorporeret i NP’er ved fysisk indfangning gennem hydrofobe interaktioner mellem PTX og PLGA (fig. 1B). For at lette polyvalent binding mellem aptamer og målet er et afstandsstykke ofte indsat mellem aptamer og nanopartikel køretøjet. Derfor konstrueres vi et DNA spacer ved at udvide 3′-enden af ​​det oprindelige S2.2 aptamer med 48 yderligere baser (fig. 1A), hvilket giver en spacer længde tæt på den for PEG 3400, som er en almindeligt anvendt afstandsstykke i målrettet lægemiddelafgivelse systemer [14], [15]. Den udstrakte del af DNA vil ikke påvirke den sekundære struktur af S2.2 aptamer pr beregningsanalyse (RNAstructure, version 4.5). At konjugere aptamer-spacer-kompleks til PTX-fyldte NP’er, blev EDC og NHS tilsættes for at katalysere dannelsen af ​​kovalente par mellem -COOH PLGA på nanopartikel overflade og 3′-NH

2 MUC1 aptamer (fig. 1B). Den med lægemiddel fyldte nanopartikel størrelse er 164,0 ± 7,6 nm før kobling til aptamerer, og steg til 225,3 ± 9,2 nm efter konjugeringen, formentlig på grund af den ekstra størrelse af aptameren og afstandsstykket. Den PTX indkapsling Effekten var 83,6 ± 1,7% med et lægemiddel belastning på 4,2 ± 0,1%.

(A) Struktur af MUC1 aptamer S2.2-spacer. Den S2.2-spacer er fremstillet af det MUC1 aptamer S2.2 (som det målsøgende middel) og en konstrueret sekvens af enkeltstrenget DNA (som forbinder afstandsstykket). (B) som forberedelse til PTX-Apt-NP hjælp emulsionen /fordampning metode.

Affinity af MUC1 aptamer til MCF-7 og HepG2 cellelinjer

aptamer S2.2 rapporteres til specifikt at binde til MUC1 protein med høj affinitet [12]. For at teste om S2.2 differentielt ville binde til MUC1-positive og MUC1-negative celler, bindingen af ​​S2.2 til MCF-7 og HepG2-celler blev vurderet ved FCM-analyse. En tilfældig DNA (RAN) blev anvendt som kontrol. Tidligere undersøgelse har fastslået, at MCF-7 er en human brystcancer cellelinje, der overudtrykker MUC1 protein på overfladen [16], og at HepG2 er et MUC1-negative human hepatisk cancer cellelinje [17]. I overensstemmelse med den oprindelige rapport, aptameren S2.2 (gul kurve) demonstrerede en højere binding til MUC1-positive MCF-7-celler end de MUC1-negative HepG2-celler (figur 2 A . B). Den tilfældige DNA (blå kurve) havde en meget lavere binding til både MCF-7- og HepG2-celler, formodentlig skyldes ikke-specifik binding. Endvidere at undersøge, om S2.2-spacer havde en lignende bindende præference for MUC1-positive celler, blev den bindende eksperiment gentages for S2.2-spacer. Resultaterne udviste at S2.2-spacer (rød kurve) havde lignende interaktion med begge celler som S2.2 (fig 2 A . B), hvilket antyder, at S2.2-spacer opretholdt den selektive bindingsevne af den oprindelige aptamer. Den gennemsnitlige fluorescerende intensitet af FITC-mærket S2.2-spacer binding med MCF-7 er 3,5 gange højere end med HepG2, gør det en kvalificeret målsøgende middel til selektivt rettet mod den MCF-7-celler. Da en spacer kan lette polyvalent binding mellem aptamer og målet blev S2.2-spacer påført som targetingmidlet at konstruere medicinindgiftssystemet i denne undersøgelse.

(A) Histogrammer fra FCM-analyse. FITC-mærket tilfældig DNA, S2.2, S2.2 eller-spacer blev inkuberet separat med MCF-7 (til venstre) og HepG2 (højre) celler. (B) Den gennemsnitlige fluorescerende intensitet MCF-7 og HepG2-celler inkuberet med tilfældige DNA og forskellige aptamerer.

Evaluering af konjugation mellem aptamerer og nanopartikler

MUC1 aptamer-spacer var konjugeret til nanopartikel i reaktionen katalyseret af EDC og NHS. For at sikre at DNA-aptamer faktisk var knyttet til overfladen af ​​partiklen, blev udført to eksperimenter. I det første eksperiment, blev FITC-mærket aptamer co-inkuberet med mikropartikler (MP’er) enten i nærvær eller i fravær af katalysatorer EDC og NHS, og derefter analyseret ved FCM. Som vist i fig. 3A, partiklen fluorescensintensiteten i fravær af EDC og NHS var næsten identisk med den for de tydelige MP’er, mens et positivt fluorescens blev observeret i nærvær af EDC og NHS. Resultaterne antydede konjugeringen mellem aptamerer og partikler blev uomgængeligt aktiveret som katalysatorerne, og at aptamerer blev stabilt konjugeret til partiklerne gennem kovalent binding. Det andet eksperiment undersøgte tilstedeværelsen af ​​DNA aptamer på nanopartikler ved UV-spektroskopi og evaluerede konjugerende virkning. Svarende til FCM resultater blev flere aptamerer forbundet med nanopartikler i nærværelse af EDC og NHS (fig. 3B). Mængden af ​​konjugerede aptamerer om nationale parlamenter blev også estimeret. I dette reaktionssystem, ca. 0,1 nmol aptamerer blev kovalent koblet til 1 mg PLGA NP’er, eller omkring 120 aptamerer for hver nanopartikel.

PLGA mikropartikler (MP) eller nanopartikler (NPS) omsat med aptamerer i fravær ( -EDC NHS) eller tilstedeværelse (+ EDC NHS) af katalysatorerne. (A) Histogrammer fra FCM-analyse af MP omsættes med FITC-mærkede aptamerer i fravær (-EDC NHS, venstre) eller nærvær (+ EDC NHS, højre) af katalysatorerne. Plain mikropartikler, som ikke havde reageret med aptamerer blev anvendt som kontrol. (B) UV absorption af DNA ved 260 nm (n = 3) på partiklerne, der undergik konjugering proces med aptamerer. Kontrolgruppen (NP) angiver almindeligt nanopartikler, der ikke har reageret med DNA aptamerer.

In vitro

release profil PTX fra Apt-nationale parlamenter

Vi næste studerede

in vitro

release profil PTX fra Apt-NP, en nødvendig egenskab for anticancer aktivitet. Mængden af ​​PTX frigivelse i PBS blev analyseret overtid med UV-absorption ved 227 nm. En typisk kinetik for frigivelse proces forhalet blev observeret for PTX, med ca. 65% af lægemidlet frigives gradvist i løbet af de første 48 timer (fig. 4). Andelen af ​​PTX udgivet her var i overensstemmelse med de frigivende profiler af mange PLGA drug carrier systemer rapporteret i litteraturen [18], [19], [20].

Forsøget blev udført i fosfatbuffer saltvand (PBS , pH 7,4) indeholdende 0,5% (vægt /volumen) poloxamer hjælp membranen diffusion teknik, (n = 3).

cellulær optagelse eksperiment

den vigtigste egenskab ved en målrettet lægemiddelafgivelsessystem er dens specificitet mod målcellerne. At udforske

in vitro

kræft målretning af den Apt-nationale parlamenters mod MUC1-overekspression celler, vi sammenlignet den cellulære optagelse af MCF-7 (MUC1

+) og HepG2 (MUC1

-) anvendelse af FCM-analyse (fig. 5). NPs og Apt-NP, både indkapslende FITC, blev co-dyrket med MCF-7 og HepG2. Fluorescensintensitet af MCF-7 og HepG2-celler inkuberet med NP’er var ens i amplitude. Men for Apt-NP behandlede MCF-7 celler, den fluorescerende intensitet steget med 71%, mens den for HepG2-celler næsten ikke ændret. Sondringen blev formentlig forårsaget af de konjugerede aptamerer, som bandt til MUC1 proteinet på overfladen af ​​MCF-7-celler, hvilket resulterer i flere nanopartikler er fastgjort til celleoverfladen og internaliseres i cellen.

Cellerne blev inkuberet med FITC indkapslet Apt-NPs eller nationale parlamenter på 50 pg /ml i 2 timer før underlagt analyse.

Konfokal fluorescerende scanning mikroskopi

ovenstående resultater viste, at Apt-nationale parlamenter genereret øget fluorescensintensitet i MUC1-positive MCF-7-celler, der sammenlignes med NP’er. Det var imidlertid ikke helt klart, om de apt-NP blev fæstnet til celleoverfladen eller internaliseres i cellerne. For yderligere at undersøge interaktionen ordningen mellem apt-NP’er og målcellerne blev konfokal fluorescerende scanning mikroskopi udføres for at bestemme placeringen af ​​Apt-NP’er. Flere billeder scanning gennem forskellige niveauer af MCF-7-celler blev opnået. Det centrale niveau scanninger, der gik gennem midten af ​​cellen og kernerne blev vist i fig. 6. Billederne klart tilkendegivet, at de apt-nationale parlamenter primært blev akkumuleret i cytoplasmaet omkring kernen. Følgelig kunne apt-NP’er internaliseres ind målcellerne og bære anticancerlægemidler i cytoplasmaet. Sammenlignet med Apt-NP, mængden af ​​NP’er indtastede MCF-7-celler var meget mindre; tyder igen at MUC1 aptamer lettet optagelsen af ​​nanopartikler i cellerne.

grønt fluorescerende FITC blev indkapslet i Apt-NPs og NPs. Kernerne blev farvet blå med DAPI. Den højre kolonne viser de fusionerede billeder af FITC og DAPI kanaler. MCF-7 celler blev udsat for FITC-indkapslet Apt-NPs eller nationale parlamenter på 100 mg /ml i 2 timer.

In vitro

cytotoksicitet

Den cellulære optagelse forsøget viste, at Apt-nationale parlamenter øgede optagelsen af ​​nanopartikler ved MUC1-overekspression tumorceller. Det er imidlertid uvist, hvor dette vil påvirke leveringen af ​​anticancermiddel til cellerne. For at undersøge spørgsmålet,

in vitro

cytotoksicitet gratis PTX, plain nationale parlamenter, PTX-loaded NP’er (PTX-NPS), PTX-loaded NP’er konjugeret til tilfældige DNA (PTX-R-NP), og PTX- lastet NP’er konjugeret til MUC1 aptamerer (PTX-Apt-NPS) blev sammenlignet under anvendelse MCF-7 (MUC1 +) og HepG2 (MUC1-) som målceller. Resultaterne er vist i fig. 7. Plain NP viste lidt cytotoksicitet, hvilket tyder på, at levering køretøjer er relativt ikke-toksiske for cellerne og at cytotoksicitet oftest skyldes den indkapslet PTX. Fri PTX genereret lignende grader af cytotoksicitet i begge cellelinier. PTX-Apt-NP’er produceret en mere potent cytotoksicitet end PTX-NPs eller PTX-R-NP’er i MCF-7-celler (P 0,01). Imidlertid blev cytotoksiciteten forskelle ikke observeret i HepG2-celler. Dette stemmer overens med resultaterne vist i fig. 5, i hvilken MUC1 aptamer øgede optagelsen af ​​apt-NP’er i MCF-7-celler (MUC1 +), men ikke HepG2 celler (MUC1-). Resultaterne tyder på, at MUC1 aptamer selektivt kan forøge leveringen af ​​anticancer lægemiddel til MUC1-positive cancerceller.

Cellerne blev efterfølgende vasket og inkuberet i kulturmedier i i alt 48 timer, før cellelevedygtighed i hver gruppe blev vurderet med en standard MTS-assay (n = 6, middelværdi ± SD).

diskussion

Målrettede lægemiddeladministrationssystemer er blevet foreslået at løse problemet, at de fleste anticancer terapeutiske midler undlader at handle specifikt på cancerceller og forårsage toksicitet over for normale celler. I denne undersøgelse, vi designet et MUC1 aptamer-baserede målrettet drug delivery system (fig. 1) for at forbedre leveringen af ​​paclitaxel til MUC1-overekspression tumorceller. MUC-1 aptamerer demonstrerede højere affinitet og selektivitet mod MCF-7-celler (MUC1

+) i løbet af HepG2-celler (MUC1

-) (fig. 2). For at konstruere Apt-nationale parlamenter blev MUC1 aptamerer konjugeret aptamererne til nationale parlamenter overflade ved kemisk covalent kobling (fig. 3). APT-NP viste en profil vedvarende medikamentfrigivelse (fig. 4). Den targeting aptamer øgede optagelsen af ​​nanopartikler i MUC1-overekspression tumorceller (Fig 5 . 6). Desuden Apt-NP’er forøgede PTX levering til MUC1-positive tumorceller (fig. 7) samtidig viser nogen effektivitet mod kontrolceller.

Tidligere undersøgelser af aptamer-konjugeret NP’er for lægemiddelafgivelse har forbedret virkning mod prostatacancer via en aptamer af prostataspecifikt membran-antigen (PSMA) [6], [7], [8], [21]. Imidlertid ville det være ideelt at konstruere en aptamer-baserede lægemiddelafgivelsessystem målretning et bredt spektrum af cancerformer. MUC1 protein er overudtrykt og afvigende glycosyleret på overfladen af ​​de fleste adenocarcinomaceller [10], hvilket gør det et meget attraktivt mål for kræftbehandling. I denne undersøgelse for første gang, er MUC1 aptamer udnyttes som et målsøgende middel i en nanopartikel-baserede lægemiddelafgivelsessystem. Den MUC1 aptamer (S2.2) anvendt i denne undersøgelse viste høj bindingsaffinitet til MUC1, der er sammenlignelig med den anti-MUC1 antistof C595 [12], [22]. Den målrettede nanopartikel levering system baseret på dette MUC1 aptamer blev evalueret for sin målrette evne mod MCF-7 celler

in vitro

. Svarende til lægemiddeltilførselssystemet baseret på PSMA aptamer, vi observeret forbedret optagelse af apt-NP’er af MUC1-overekspression MCF-7-celler (fig. 7). Da MUC1 protein overudtrykt på overfladen af ​​flere typer af kræftceller, kan et sådant lægemiddeltilførselssystem potentielt forbedre leveringen af ​​anticancer midler til flere maligniteter, såsom kræft i bugspytkirtlen [23], prostatacancer [24], ovariecancer [25 ] osv

som diskuteret ovenfor er forstærket tilførsel af anticancer lægemiddel blev hovedsagelig induceret af MUC1 aptamer. De konfokale scanning mikroskopi billeder (fig. 6) og forøgede cytotoksicitet sammenligne at befri PTX (fig. 7) viste, at NPS blev internaliseret i cellerne. Det menes generelt, at lægemiddel-tilførte PLGA NP’er optages af celler gennem internalisering, og slip derefter lægemidlet inde i cellerne [26]. De S2.2 aptamerer konjugeret til NPS sandsynligvis fremmet samspillet mellem NP’er og MCF-7-celler via ligand-receptor anerkendelse. Specifikt S2.2 bundet til MUC1 handlet formodentlig som et anker og trak nanopartikel til i nærheden af ​​cellen, og forbedret chancerne for nanopartikel bliver internaliseret af MCF-7-celler. For MUC1-negative HepG2-celler, aptameren undladt at forbedre optagelsen af ​​nanopartikel (fig. 5), formentlig fordi det ikke forbedre samspillet mellem nanopartikel og cellen.

En spacer-molekyle er ofte nødvendig mellem det målsøgende molekyle og bæreren nanopartikel: længden og fleksibilitet af spaceren tillader målretning aptamerer trænge igennem celleoverflademolekyler og binde til målene i en polyvalent måde [14]. I denne undersøgelse har vi forsøgt en ny tilgang til at konstruere et afstandsstykke, som kan forenkle fremstillingen procedure. Vi udvidede 25-base-S2.2 aptamer ved tilsætning af en 48-base-DNA-sekvens til 3′-enden af ​​aptameren, at lave en 73-base-streng. DNA spacer er designet til at undgå dannelse af sekundære struktur og havde omtrent samme længde som det mest anvendte spacer PEG-3400 (25 nm). Den bindende eksperiment (fig. 2) viste, at aptamer S2.2 og S2.2-spacer havde lignende bindende profiler med MUC1-positive målceller og MUC1-negative kontrol celler. Disse resultater tydede på, at den udvidede DNA-streng ikke påvirkede bindende evne S2.2 og kunne tjene som en gennemførlig afstandsstykke. Ved at undgå PEG spacer, denne konstruktion metode forenklet kemi konjugere målsøgende middel og spacer til nanopartikel. Da fordelene ved afstandsstykket er blevet godt godkendt [27], [28] og S2.2-spacer demonstrerede god affinitet til MUC1-positive målceller, aptamerer med DNA spacer blev anvendt til at konstruere den målrettede medicinindgiftssystemet i denne forskning . Som forventet S2.2-spacer konjugeret Apt-NP’er viste høj specificitet og affinitet over for MUC1-overudtrykkende celler

in vitro

.

MUC1 protein er en vigtig tumor-associeret antigen (TAA) påvist i de fleste adenocarcinomer. For nylig har en gruppe af MUC1 aptamerer blevet identificeret, herunder aptamer S2.2 [12], som har potentiale til at tjene som målrette agent for MUC1 protein. Det primære mål med denne undersøgelse er at undersøge muligheden for at udvikle en nanoskala drug delivery system baseret på S2.2 og foreløbigt evaluere kræft-targeting kapacitet

in vitro

. Her konstrueres vi en hidtil ukendt PTX-loaded nanopartikel konjugeret til MUC1 aptamer S2.2 gennem en DNA spacer. Aptameren fandtes at øge optagelsen af ​​nanopartikler i MUC1-positive MCF-7-celler. Desuden PTX-loaded Apt-NP’er forøgede cytotoksicitet over MCF-7-celler

in vitro

. Ikke desto mindre, med henblik på at stort set realisere MUC1 målrettet drug delivery, omfattende fremtidig forskning på Apt-nationale parlamenters stadig berettiget, herunder detaljerede

in vivo

evaluering af farmakokinetik, farmakodynamik, bivirkninger og langsigtede biokompatibilitet i dyr undersøgelser.

Konklusion

I sammendrag, en MUC1 aptamer-styrede nanoskala drug delivery system blev udviklet med en roman konjugation strategi. Resultaterne viser, at systemet effektivt kan øge PTX levering til MUC1- overudtrykker MCF-7-celler

in vitro

. Da mange kræftformer overudtrykker MUC1 protein, vi postulerer, at målrettet drug delivery sigter mod MUC1 kan tjene som en potentiel strategi til forbedring af behandlingen resultatet af disse tumorer.