PLoS ONE: Non-Thermal Vindretning Plasma Forhindrer Thyroid papillære kræft Cell Invasion via cytoskeletale Modulation, Altered MMP-2 /-9 /uPA Activity

abstrakt

Plasma, den fjerde tilstandsform, er defineret som en delvist eller fuldstændigt ioniseret gas, der omfatter en blanding af elektroner og ioner. Fremskridt inden for plasmafysik har gjort det muligt at anvende ikke-termisk atmosfæretryk plasma (NTP) i cancerforskning. Imidlertid har tidligere undersøgelser fokuseret primært på apoptotisk celledød medieret af NTP som en potentiel cancerterapi. I denne undersøgelse undersøgte vi virkningen af ​​NTP på invasion eller metastase, samt den mekanisme, hvorved plasma inducerer anti-migration og anti-invasion egenskaber i humane skjoldbruskkirtel papillære cancercellelinier (BHP10-3 og TPC1). Sårheling, pull-down, og Transwell analyser viste, at NTP reduceret celle migration og invasion. Desuden NTP inducerede morfologiske ændringer og cytoskelet-omlejringer, som påvist ved scanning elektronmikroskopi og immuncytokemi. Vi undersøgte også matrixmetalloproteinase (MMP) -2 /-9 og urokinase-plasminogenaktivator (uPA) aktivitet under anvendelse gelatinezymografi, uPA assays og RT-PCR. FAK, Src, og paxillin ekspression blev detekteret ved anvendelse Western blot analyser og immuncytokemi. NTP faldt FAK, Src, og paxillin ekspression samt MMP /uPA-aktivitet. Afslutningsvis NTP inhiberede invasion og metastase af BHP10-3 og TPC1 celler ved at nedsætte MMP-2 /-9 og uPA aktiviteter og omarrangere cytoskelettet, som reguleres af FAK /Src kompleks. Disse resultater tyder på nye tiltag for NTP og kan støtte i udviklingen af ​​nye terapeutiske strategier for lokalt invasive og metastatiske cancere

Henvisning:. Chang JW, Kang SU, Shin YS, Kim KI, Seo SJ, Yang SS, et al. (2014) Ikke-Termisk Pres atmosfæriske Plasma Forhindrer Thyroid papillære kræft Cell Invasion via cytoskeletale Modulation, Altered MMP-2 /-9 /uPA aktivitet. PLoS ONE 9 (3): e92198. doi: 10,1371 /journal.pone.0092198

Redaktør: Jian Cao, Stony Brook University, USA

Modtaget: November 13, 2013; Accepteret: 19 Feb 2014; Udgivet: 25 Mar 2014

Copyright: © 2014 Chang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af Bio Medicinsk Teknologi Development Program af NRF finansieret af den koreanske regering (2012M3A9B2052870). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Keunho Lee er den administrerende direktør for PSM America Inc., dedikeret som teknisk høring på enheden, og det ændrer ikke vores tilslutning til PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Thyroid papillær karcinom er en af ​​de mest almindelige maligne sygdomme på verdensplan og generelt viser indolent karakter [ ,,,0],1]. Imidlertid kan det undertiden være aggressiv, med extracapsular spredning, rem muskel, tilbagevendende larynx nerve, og tracheal invasion samt metastase til lymfeknuder. I sjældne tilfælde kan skjoldbruskkirtlen papillær kræft metastaserer til lungerne eller ben [2], [3]. Tilstedeværelsen af ​​lokale eller fjernmetastaser påvirker tumor tilbagefald, patient overlevelsesrater, og livskvalitet, hvilket fører til dårlige prognoser [4]. Det er derfor nødvendigt at finde nye måder at forebygge de aggressive træk af invasion og metastase i skjoldbruskkirtlen papillær kræft.

Plasma medicin er et hastigt voksende område, der omfatter en ny behandling modalitet [5], [6]. Forskellige plasma kilder og plasma udstyr anvendes til flere forskellige indikationer, herunder desinfektion [7], sårheling [8], blodkoagulering [9], og cancercelledød [10]. Endvidere har teknologiske fremskridt muliggjort generering af plasma ved stuetemperatur og atmosfærisk tryk (ikke-termisk atmosfæretryk plasma, NTP) [10] – [12]. NTP’er er blevet rapporteret at have anti-cancer aktiviteterne i forskellige væv, herunder lungecancer [5], colorectal cancer [10] – [12], og melanom [13], hvilket tyder på en ny anti-tumor terapeutisk modalitet. Derudover vores gruppe tidligere viste, at NTP inducerede en vækst anholdelse og retarderede tumor invasion i kolorektal cancer celler [10], [11]. Imidlertid har anti-cancer mekanisme af NTP hovedsageligt fokuseret på apoptose-relaterede mekanismer med øget reaktive oxygenarter eller redox ubalancer [14].

Tumor invasion til omgivende væv eller metastase til fjerne organer er den overvejende årsag mortalitet hos patienter med cancer [15]. Derfor er der lagt vægt på at hæmme kræft invasion og metastase. Mange linjer af beviser demonstrerer, at en kompleks proces med indbyrdes afhængige foranstaltninger, herunder celle migration, invasion, overflade friktion, og nedbrydning af den ekstracellulære matrix (ECM), er nært beslægtet med tumor invasion og /eller metastase og reguleres af ekstremt komplicerede mekanismer [ ,,,0],16]. Tidligere foreslog vi, at NTP behandling faldt celle migration og invasion i kolorektal cancer celler [10]. Imidlertid er de mekanismer, der er involveret i plasma-induceret hæmning af cellemigration og invasion ikke fuldt klarlagt.

Formålet med denne undersøgelse var at undersøge de inhiberende virkninger af NTP på migration og invasion af human skjoldbruskkirtel cancercelle linjer. Så vidt vi ved, er dette den første undersøgelse, som evaluerer anticancervirkning af NTP på cellemigration og invasion forbundet med cytoskeletale graduering og ændringer af matrixmetalloproteinase (MMP) -2 /-9 /urokinase-plasminogenaktivator (uPA ) aktiviteter.

Materialer og metoder

cellelinjer og reagenser

de menneskelige skjoldbruskkirtlen papillær karcinom cellelinjer BHP10-3 og TPC1 blev købt fra American Type Culture Collection (Manassas , VA, USA). Den normal thyroid cellelinie Nthy-ori 3-1 blev venligst præsenteret af prof. Minho Song (Chungnam National University, Korea). BHP10-3 og Nthy-ori 3-1 celler blev opretholdt i RPMI 1640 medium (Gibco, Carlsbad, CA, USA), mens TPC1 celler blev opretholdt i Dulbeccos modificerede Eagles medium /Hams næringsblanding F-12 (DMEM /F12; Gibco ), suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 100 U /ml penicillin-streptomycin (Gibco). Cellerne blev opretholdt ved 37 ° C med 5% CO

2 under fugtige forhold.

Eksperimentelle systemspecifikationer

Som tidligere beskrevet [11], vi designet og fremstillet en spray-typen NTP-system med en nydesignet bue-fri og antistatisk plade, der giver en ensartet plasma jet for biomedicinsk forskning applikationer. Dette system viser høj effektivitet for overfladebehandling af bio-prøver ved lave temperaturer, som er afgørende for biologiske eksperimenter.

De tekniske specifikationer for plasma-systemet ( “fakkel med spray-type”) er vist i fig . 1A og B. Specifikationerne for strømforsyningen for dette system er 2 kV minimum, maksimum 13 kV, og en gennemsnitlig frekvens på 20-30 kHz; disse specifikationer, kan variere med typen og mængden af ​​gas, der anvendes. I denne undersøgelse helium (He) og oxygen (O

2) blev anvendt som bæregasser fordi vi tidligere vist sig, at tilsætningen af ​​O

2 til en He plasma forbedret effektiviteten af ​​cancercellen inhibering [10]. Emissionsspektret af plasmaet ifølge kraften anvendt i denne undersøgelse (2 eller 4 kV) er vist i fig. 1B.

(B) Optisk emissionsspektre af Han og O

2 gasblanding plasma ifølge den elektriske intensitet (2 eller 4 kV) i området fra 280 til 920 nm. (C) Billede af den “fakkel med spray-type” plasma jet med Han og O

2. Den synlige plasma havde en længde på ca. 2,5 cm, der varierede med gasstrømmen og spænding.

Scanning elektronmikroskopi (SEM)

I SEM blev celler dyrket på dækglas og fikseret i 1 time ved stuetemperatur i 4% paraformaldehyd i phosphatpufret saltvand (PBS) (pH 7,2). Dækglassene blev forarbejdet som tidligere [17] beskrevne. Cellerne blev undersøgt under anvendelse af et scanningselektronmikroskop. (S-4800, Hitachi, Tokyo, Japan), der opererer ved 10 eller 15 kV

Cytoskeleton farvning

Celler blev høstet og re-udpladet på fibronectin overtrukne dækglas. Efter 24 timer blev cellerne fikseret i 20 minutter i 3,7% formaldehyd og re-hydreret i PBS med 0,1% Triton X-100. Efter blokering i 45 min med PBS indeholdende 5% BSA blev objektglassene inkuberet med Texas-Red-konjugeret phalloidin (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) ifølge producentens anvisninger. Hoechst 33258 blev sat til modfarve kernerne. Objektglassene blev analyseret ved hjælp af fluorescens mikroskopi (Carl Zeiss, Oberkochen, Tyskland).

Pull-down assays (RhoA, Rac1, og Cdc42 GTPase aktivering analyser)

For yderligere at bestemme virkningen af ​​NTP på morfologiske ændringer, der påvirker cellemigration blev et RhoA /Rac1 /Cdc42 Activation Assay Combo Biochem Kit (Cytoskeleton Inc., York, UK) anvendt ifølge producentens instruktioner med 600 ug totalt protein. I korte, rhotekin-RBD effektordomæne affinitetsperler blev anvendt til at binde aktive RhoA, og PAK-PBD-effektordomæne affinitetsperler blev anvendt til at binde aktive Cdc42 og Rac1. Efter inkubation i 2 timer blev proteinerne elueret med Laemmli-buffer og separeret på 12% acrylamid /bis-acrylamidgeler. Negative og positive kontroller blev udført ifølge producentens anvisninger. For at bekræfte tilstedeværelsen af ​​GTPaser i celle proteinekstrakter blev 5% input kontrol også køre på gelerne. Gelerne blev overført til nitrocellulosemembraner, som blev inkuberet natten over med antistoffer mod Cdc42, Rac1, og RhoA (indeholdt i kittet) med forsigtig omrøring. Proteinerne blev detekteret ved anvendelse af et forøget kemiluminescens Western blotting kit.

Sårheling assays

For cellemigration assays celler blev udpladet i 12-brønds dyrkningsplader ved en tæthed på ca. 1 × 10

5 /brønd og dyrkes til konfluens. Sårheling assays blev udført som tidligere [10] beskrevne. Kort fortalt blev monolaget ridset med en steril pipettespids, efterfulgt af grundig vask til fjernelse af cellerester. Cellerne blev derefter udsat for gas (Han eller O

2 kun), 2 eller 4 kV af NTP, henholdsvis for 1 s. Sårheling forhold blev dokumenteret ved fotografering efter 24 timer, da fordobling tider for BHP10-3 og TPC1 var 30,0 ± 1,2 t og 29,7 ± 0,8 t. De fordobling gange blev beregnet ud fra kurven cellevækst over tre dage som følger: (t

2: sidste gang, t

1: indledende tid, q

2: sidste celle nummer, q

1 : indledende celleantal)

Western blot-analyser

Celler blev lyseret i lysisbuffer indeholdende 150 mM NaCl, 1,0% NP-40, 0,5% natriumdeoxycholat, 0,1% SDS, 50 mM Tris ( pH 8,0) og protease-inhibitor cocktail (pH 7,4; Roche Applied Science, Wien, Østrig) som tidligere beskrevet [18]. Følgende antistoffer blev anvendt til Western blotting: anti-fokal vedhæftning kinase (FAK), -Src, -Paxillin, -extracellular signal-reguleret kinase (ERK), -Akt og -α-tubulin (1:1000; Cell Signaling Technology , Danvers, MA, USA).

Immuncytokemi

Celler blev dyrket på mikroskop dækglas (Thermo Fisher Scientific, Rochester, NY, USA), og behandles med gas (Han + O

2 ) kun, 2 eller 4 kV af NTP, hhv. Efter 24 timer blev objektglassene vasket med PBS, fikseret i 20 minutter i 3,7% formaldehyd, og re-hydreret i PBS. Efter blokering i 45 minutter i BSA (i 5% PBS), blev objektglassene inkuberet i 1 time med polyklonale kanin-anti-p-FAK og-paxillin antistoffer (1:50; Cell Signaling Technology), vasket med PBS, og inkuberet i 45 min med Alexa 488-mærket gede-anti-kanin-antistoffer (1:250; Molecular Probes). Efter skylning i PBS, blev Hoechst 33258 tilsat i 15 min for at modfarve kernerne. Objektglassene blev vasket med PBS og monteret med Vectashield (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA) og derefter analyseret ved anvendelse af fluorescensmikroskopi (Carl Zeiss).

Invasion (Transwell) assays

Transwell (24 brønde) kammer (Costar, Cambridge, MA, USA) blev anvendt til at evaluere celleinvasion ifølge NTP behandling som tidligere [10] beskrevne. Oprindeligt fibronectin (2 ug /filter) blev opløst i 100 pi MEM og hældt i den øvre del af polyethylen (porestørrelse, 8 um) .De brønde blev coatet natten over i en laminær strømning.

Derefter 10

5-celler (i 100 pi vækstmedium) blev tilsat til toppen af ​​filtret i øvre brønd. Kammeret blev inkuberet i 24 timer i 5% CO

2 ved 37 ° C. Endelig blev vedhæftede celler i den nedre sektion farvet med H MMP-2-R, 5′-TGT GGC AGC ACC AGG GCA GC-3 ‘; MMP-9-F, 5’-GGG GAA GAT GCT GCT GTT CA-3 ‘; og MMP-9-R, 5′-GGT CCC AGT GGG GAT TTA CA-3’.After denaturering i 3 min ved 94 ° C, blev prøver amplificeret i 35 cykler af 30 sekunder ved 94 ° C, 60 ° C, og 72 ° C, med en 5-min forlængelse ved 72 ° C. Produkterne blev separeret ved elektroforese i 1,5% agarosegeler og påvist under anvendelse af ultraviolet lys (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

Zymografi

MMP-2 /-9 blev analyseret under anvendelse gelatinezymografi som tidligere beskrevet [19]. BHP10-3 og TPC1 celler blev behandlet med gas (Han + O2) udelukkende, 2, eller 4 kV af NTP i 1 sek, og inkuberet i yderligere 24 timer. Supernatanten (100 pi) fra hver prøve blev blandet med 1 pi 100 mM 4-aminophenylmercuriacetat, og prøverne blev aktiveret i 1 time ved 37 ° C. Dernæst blev hver prøve anbragt i prøvepuffer i 10 minutter og elektroforeret i polyacrylamidgeler ved 125 V i 120 min ved 4 ° C under anvendelse af en Novex Xcell II-system (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Gelerne blev inkuberet i renatureringsbuffer i 60 minutter ved stuetemperatur, efterfulgt af inkubation i 18 timer i 100 ml udvikle puffer ved 37 ° C med let rystning. Gelerne blev derefter farvet i 3 timer med Coomassie brilliant blue. Efter affarvning i 400 ml methanol, 100 ml eddikesyre, og 500 ml destilleret vand, blev billeder taget ved anvendelse af en billedanalysator.

Urokinase-plasminogenaktivator (uPA) assays

BHP10-3 og TPC1cells (3000 celler /brønd) blev tilsat til plader med 96 brønde i komplet medium indeholdende 10% FBS. Efter inkubation natten over blev cellerne behandlet med gas (Han + O

2) kun, 2 eller 4 kV af NTP, hhv. Pladerne blev derefter inkuberet i yderligere 24 timer. Cellerne blev derefter bearbejdet som tidligere [19] beskrevne. Kort fortalt blev cellerne vasket med DMEM mangler phenolrødt og anbringes i 200 pi reaktionsbuffer indeholdende 50% (v /v) på 0,05 U /ml plasminogen i DMEM (uden phenolrødt), 40% (v /v) af 50 mM Tris-puffer (pH 8,2) og 10% (v /v) af 2,25 mM chromozyme PL i 100 mM glycin. Blandingerne blev inkuberet i 3 timer ved 37 ° C i 5% CO

2. Absorbansen ved 405 nm blev målt under anvendelse af en automatiseret spektrofotometrisk pladelæser.

Statistiske analyser

envejs variansanalyse (ANOVA) efter post hoc Tukey test blev udført under anvendelse af SPSS 20.0 statistisk software ( SPSS, Chicago, IL, USA). Parametre af data fra tre uafhængige forsøg er udtrykt som middelværdi ± S.D. En

P

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant (*

P

0,05; **

P

0,01; ***

P

. 0,001)

Resultater

NTP inducerer ændringer i cellulær morfologi i humane skjoldbruskkirtlen papillære kræftceller

de overlevende celler, der klæbede til overfladen efter NTP behandling udviste en forskellig morfologi (fig. 2A og B). Thyroid papillære celler, der normalt vokser i en fladtrykt mønster, kendetegnet ved mange cytoplasmatiske fremspring (lamellipodia og filopodia) [20]. Efter NTP behandling, cellerne viste en meget anderledes morfologi, der var præget af en mindre og kontraheret udseende, og nedsat cytoplasmatiske microspikes resulterer i begrænset celle sprede (fig. 2A).

(A) Efter behandling med gas ( Han + O

2) kun, 2 eller 4 kV af NTP til 1 s, henholdsvis celler blev inkuberet i 24 timer. Morfologien af ​​begge cellelinier blev derefter undersøgt ved lysmikroskopi. I kontrolgrupperne og gas kun-behandlede grupper, cellerne var flade og aflange, med lamellipodia (stjerne) og filopodia (pil), der er indført celle-celle-kontakter lateralt. I modsætning hertil viste de NTP-behandlede celler morfologiske ændringer karakteriseret ved en kontraheret cytoplasma, inhiberede celle-til-celle-kontakt, og ophævede cytoplasmiske fremspring (lamellipodia og filopodia). (B) SEM billeder bekræftede virkningen af ​​NTP på cellemorfologi. Cytoplasmaet i de NTP-behandlede celler viste svind og tab af horisontal polarisation og cytoplasmiske fremspring. Endvidere overfladen af ​​celler behandlet med plasma var besværlige end hos kontrolgruppen og gassen kun-behandlede celler. (C) immunofluorescensassays ved hjælp Texas-Red-konjugeret phalloidin blev udført for at visualisere cytoskelettet (F-actin); Hoechst 33258 blev anvendt til at mærke cellekerner. I kontrol- og gas behandlede-celler, blev kontraktile actin bundter (stress fibre) og en diagonal glødetråd actin meshwork dannet. Men i de NTP-behandlede grupper, blev actinfilamenter fordelt i den sammentrukne cytoplasma ødelægge arkitekturen i cytoskelettet, og ingen markant stress fiber dannelse blev noteret. Scale bar = 50 um. Hvert tal var repræsentativt for tre forsøg med tre eksemplarer.

Scanning elektronmikrofotografier af begge cellelinier bekræftede ovenstående konklusioner, der styrer og gas kun-behandlede celler viste mesenkymale-lignende funktioner med mange cytoplasmatiske projektioner. I modsætning hertil NTP-behandlede celler havde mere kompakte cellelegemer og ru celleoverflader, hvor de fremstående cytoplasmatiske tilsyneladende faldt (fig. 2B).

NTP inducerer en dysreguleret cytoskelet arkitektur i human skjoldbruskkirtel papillær cancerceller

Vi brugte immunocytokemi mod intracellulære actin filamenter med farvestof konjugeret-phalloidin og fandt, at actin cytoskeletal strukturen i plasma-behandlede celler blev ændret. I kontrol og gas-behandlede celler, blev kontraktile actin bundter (stress fibre) og en diagonal glødetråd actin meshwork noteret. Imidlertid blev actinfilamenter fordelt i den sammentrukne cytoplasma, og dermed ødelægge arkitekturen i cytoskelettet, og ingen markant stress fiber dannelse blev observeret i NTP-behandlede celler (fig. 2C).

NTP hæmmer aktiviteten af Rho GTPaser (RhoA, Rac1 og Cdc42)

Rho familie af GTPaser er kendt for sit engagement i cellulære funktioner, såsom cellepolaritet, lamellipodia eller filopodia dannelse, og celle migration. Derfor undersøgte vi effekten af ​​NTP på Rho familie (RhoA, Rac1, og Cdc42) aktivitet. Som vist i fig. 3, NTP behandling faldt betydeligt de aktive former af RhoA og Rac1.

Rho familie (Rho, Rac1, og Cdc42) aktivitet blev evalueret ved hjælp af pull-down afsløring kits efter udsættelse for gas (Han + O

2) kun, 2 eller 4 kV af NTP i 1 sek. NTP behandling af BHP10-3 og TPC1 celler reducerede signifikant ekspressionen af ​​GTP-RhoA og GTP-Rac1 (de aktive former af disse proteiner). Hvert tal var repræsentativt for tre forsøg med tre eksemplarer.

NTP hæmmer cellemigration gennem FAK /Src kompleks i menneskelig skjoldbruskkirtlen papillær cancerceller

For at undersøge om NTP reducerer tumorceller migration, scratch sårlukning assays blev udført. Som vist i fig. 4A og B, vores resultater viser, at plasma behandling betydeligt undertrykt migrationen af ​​BHP10-3 (

P

0,01) og TPC1 (

P

0,001) celler i hele blottede zone. Den procentvise inhibering af den cellulære migration var 48,2 og 55,4% i BHP10-3 celler og 63,6 og 84,1% i TPC1 celler efter 24 timers inkubering med 2 og 4 kV af NTP, sammenlignet med kontrolceller. Gas eneste behandling påvirkede ikke signifikant celle migration i enten linje.

(A) BHP10-3 og TPC1 celler blev forgyldt med 12 brønde, der dyrkes til sammenflydning, og monolag blev såret med en pipettespids. Sårheling blev dokumenteret af fotografering efter 24 timer inkubation. Scale bar = 200 um. (B) Kvantificering af cellemigration. NTP hæmmede signifikant migrationen af ​​BHP10-3 (

P

0,001) og TPC1 (

P

0,001) celler i hele blottede zone. Dataene repræsenterer middelværdien ± S.D. af tre uafhængige forsøg. NS, ikke signifikant; **

P

0,01, ***

P

. 0,001

For yderligere at vurdere effekten af ​​NTP på cellulære migration, vi evaluerede protein lysater for phosphorylering af FAK, Src, og paxillin, som er kendt for deres tætte forbindelse med cellemigrering, invasion, og cytoskelet omlejring via FAK /Src-kinase-komplekset [21]. Efter NTP behandling, vi observerede inhibering af FAK phosphorylering og en vedvarende reduktion af phosphoryleringen af ​​Src og paxillin, som er nedstrøms for FAK (fig. 5A).

(A) Western blotting for p-FAK, p-Src, og p-paxillin. Immuncytokemisk assay for (B) p-FAK og (C) p-paxillin. I kontrolgrupperne og gas-behandlede celler, blev FAK lokaliseret i små vedhæftning strukturer på cellens periferi. Efter NTP behandling blev FAK fokal akkumulering signifikant reduceret i begge cellelinier. Endvidere p-paxillin farvning blev co-lokaliseret med p-FAK-farvning. NTP behandling faldt også p-paxillin ekspression. Scale bar = 50 um. Hvert tal var repræsentativt for tre eksperimenter med tre eksemplarer.

Vi analyserede også den intracellulære fordeling af fosforyleret (p-) FAK og phosphoryleres (p-) paxillin. I kontrol- og gas kun-behandlede celler, p-FAK akkumuleret i veldefinerede zoner, herunder cellens periferi, hvorimod efter NTP behandling blev p-FAK farvning faldt betydeligt (fig. 5B). Co-lokalisering af signalerne for p-paxillin og p-FAK blev bemærket (fig. 5B og C).

NTP inhiberer celleinvasion ved at reducere MMP-2 /-9 og uPA-aktivitet, og Akt og ERK signalering i humane skjoldbruskkirtel papillære cancerceller

Tidligere undersøgelser har vist, at FAK regulerer celleinvasion samt migration, overlevelse og metastase i mange forskellige celletyper, herunder kræft i skjoldbruskkirtlen [22], [23]. For at undersøge om NTP reducerer tumorinvasion, blev invasion assays udført under anvendelse af Transwell kamre og Matrigel. Tumor invasion kræver nedbrydning af basalmembranen og ECM, cytoplasmatisk forlængelse, og celle migration. Transwell assays efterligne dette miljø for tumorinvasion. De vedhæftede celler i den nedre sektion passerede gennem filteret af kammeret, hvilket indikerer invasive celler. Som vist i fig. 6A, H 0,001). (. Figur 6B)

(A) BHP10-3 og TPC1 celler blev podet på filtre (porestørrelse, 8 um) belagt med Matrigel i det øverste kammer og udsættes for han + O kun

2 gas, 2 eller 4 kV af NTP i 1 sek. Efter 24 timer blev cellerne i porerne eller cellerne fastgjort til undersiden af ​​membranen tælles, og de celler, der er knyttet til den nedre sektion blev farvet med H 0,001) og TPC1 (

P

0,001) celler, der trængte membranen. Dataene repræsenterer middelværdien ± S.D. af tre uafhængige forsøg. *

P

0,05, **

P

0,01, ***

P

. 0,001

For at forstå den mekanisme, hvormed NTP virkninger tumorinvasion

in vitro

, gelatinezymografi for MMP-2 /-9 aktivitet blev udført. Vores resultater viste en mærkbar reduktion i MMP-2 /-9 aktivitet, når BHP10-3 og TPC1 celler blev behandlet med NTP i 1 sek (Fig. 7A). For yderligere at identificere indflydelsen af ​​NTP på MMP’er blev RT-PCR anvendes til at vurdere mRNA ekspression af MMP-2 /-9. Som vist i fig. 7B, NTP behandling markant inhiberede MMP-2 /-9-mRNA-ekspression. Disse resultater antyder, at NTP inhiberede celleinvasion ved at reducere transkriptionen af ​​MMP-2 /-9 og inhibere aktiviteten af ​​den eksisterende enzym. NTP inhiberede også uPA-aktivitet som demonstreret ved uPA assays (fig. 7C).

(A) gelatinezymografi for MMP-2 /-9. NTP svækket MMP-2 /-9 enzymatisk aktivitet i begge cellelinier. (B) RT-PCR for MMP-2 /-9. MRNA-niveauerne af MMP-2 /-9 faldt efter NTP behandling i begge celler. Hvert tal var repræsentativt for tre forsøg med tre eksemplarer. (C) uPA assays. NTP behandling faldet betydeligt uPA aktivitet. Dataene repræsenterer middelværdien ± S.D. af tre uafhængige forsøg. NS, ikke signifikant, **

P

0,01, ***

P

0,001. (D) Western blotting. ERK og Akt udtryk blev signifikant nedsat efter NTP behandling i en intensitet-afhængig måde. Hvert tal var repræsentative for tre forsøg med triplikater.

Endelig blev proteinet ekspression af Akt og ERK undersøgt under anvendelse af Western blotting. NTP behandling inhiberede Akt og ERK ekspression i begge cellelinier sammenlignet med kontrollen eller gas eneste gruppe (fig. 7D).

Discussion

Vores nuværende data viser, at NTP udøvede en anti-tumor effekt ved at inhibere kræft cellemigration og invasion. NTP er en lovende og nye modalitet i kræftforskning, og vi tidligere rapporteret, at de anti-cancer effekter af NTP medieres gennem en vækst anholdelse og celledød [10], [11]. Men den første kontaktpunkt mellem en NTP og celler er cellemembranen, som indeholder forskellige proteiner, der udfører dynamiske funktioner. Derfor, i dette studie vi fokuseret på ændringer i celle udseende, der fandt sted på celleoverfladen efter NTP behandling. Vores data viser, at plasma-behandlede skjoldbruskkirtel cancerceller mistet deres flade, spindel-formet vandret polarisering og var faldet cytosoliske fremskrivninger, som er vigtige for cellulær mobilitet og miljø sensing, mens cellerne ikke viste signifikant apoptose ved NTP behandling (Supplerende figen . S1). Disse actin-baserede cellulære fremspring, kaldet lamellipodia (actin filament meshwork) og filopodia (radialt orienterede actinfilamenter), er styret af Rho familie små GTP-bindende proteiner (Rho-GTPaser; RhoA, Rac1, og cdc42) [24]. Disse stærkt regulerede proteiner styrer også mesenchymale-lignende polarisering af celler og cytoskeletale omrokeringer, som er det første skridt i migration [24]. Vi bekræftede induktion af morfologiske ændringer ved NTP gennem farvning af cytoskelettet, som viste, actin fiber omlejring. Tilsammen vores migration og pull-down assay data indikerer, at plasmaet inhiberes effektivt BHP10-3 og TPC1 cellemigration, således vedrører celle morfologiske ændringer cytoskelet omlejring.

FAK er en ikke-receptortyrosinkinase, der lokaliserer ved fokale sammenvoksninger. FAK mRNA og proteinekspression forøges i langt størstedelen af ​​invasive og metastatiske tumorer, herunder human thyreoideacancer [25]. Men FAK er knapt påviselig i normalt væv eller ikke-invasive tumorer [25] – [28]. Desuden er det en af ​​de mest fremtrædende phosphorylerede proteiner i skjoldbruskkirtlen papillære cancerceller [29]. Undersøgelser har vist, at FAK fremmer cellemigrering gennem kompleksdannelse med Src, og efterfølgende phosphorylering af cytoskeletale adaptormolekylet paxillin af FAK /Src-komplekset [30]. Desuden er paxillin associeret med Cdc42 /Rac target effektor, som kan forbinde Cdc42 og Rac til andre kinaser og downstream mål [31], [32]. FAK er også kendt at regulere cellemigration ved at modulere samling og adskillelse af actincytoskelettet gennem dets virkninger på Rho-underfamilien af ​​små GTPaser [33], [34]. Resultaterne af denne undersøgelse er i overensstemmelse med disse tidligere undersøgelser, fordi vi fandt, at NTP signifikant hæmmede celle migration ved at undertrykke udtryk for FAK /Src kompleks og paxillin signalering, som er relateret til cytoskeletal regulering.

Ud over dens velkarakteriseret rolle i celle migration, er FAK signalering relateret til tumor invasion af en række mekanismer [35], [36]. For eksempel spiller MMP /uPA systemet en stor rolle i ECM nedbrydning og er altafgørende for at lette tumor migration og invasion under metastase [37]. Derfor undersøgte vi virkningen af ​​NTP på tumorcelleinvasion og FAK og MMP /uPA-systemet. Forholdet mellem FAK og MMP-2 /-9-vejen er tidligere blevet undersøgt [22], [38]. FAK hæmning er blevet vist at reducere MMP-9-sekretion i carcinomceller [39]. Desuden uPA binding til urokinaseplasminogenaktivatorreceptorfunktion aktiverer omdannelsen af ​​plasminogen til plasmin. Aktiveret plasmin medierer omdannelsen af ​​pro-MMP til MMP. Derfor er MMP /uPA inhibering tæt forbundet med nedsat invasivitet af cancerceller. I denne undersøgelse, hvis resultater med zymografi og RT-PCR indikerer, at NTP behandling inducerede formindskelse i MMP-2 /-9 udtryk og deres aktiviteter, også. Disse data var i overensstemmelse med tidligere offentliggjorte undersøgelser, hvori udtrykkene for pro-MMP-2 /-9 og deres enzymatiske aktivitet er tæt korreleret med maligne og /eller metastatisk fænotype af cancer [40] – [42]. Samlet set vores nuværende resultater viser, at NTP effektivt reducerer cancercelle invasionsevne via MMP-2 /-9 /uPA-system, som er forbundet med Akt og ERK signalings. Tidligere data viste, at MMP /uPA-systemet er reguleret gennem PI3K-Akt og /eller ERK /p38 signalings [22], [43], [44].

Vi undersøgte også effekten af ​​NTP i normal thyroid cellelinje (Nthy-ori 3-1). NTP behandling inducerede ikke signifikant apoptotisk celledød på normale thyreoidea celler (Supplerende figner. S2 og S3). Endvidere i modsætning til tumorcellerne, normale skjoldbruskkirtelceller viste ikke signifikante morfologiske ændringer (Supplerende fig. S4) og reduktion i cellemigrering efter NTP behandling (Supplerende fig. S5) tyder forskellig sensitivitet til NTP behandling mellem cancerceller og normal thyroid celler. Disse resultater er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, der rapporteres den selektive anticancer effekt af plasma behandling [5], [45]. af tre uafhængige forsøg. Scale bar = 50 um.