PLoS ONE: CoCl2, en Mimic af Hypoxi inducerer Dannelse af polyploide kæmpeceller med Stem Karakteristika i Colon Cancer

Abstrakt

induktion af polyploidi anses den reproduktive ende af celler, men der er tegn på, at polyploid giant cancerceller (PGCCs) bidrager til cellerepopulation under tumor tilbagefald. Men den rolle, som disse celler i udvikling, progression og respons på behandling i tyktarmskræft forbliver udefineret. Derfor er det vigtigste formål med denne undersøgelse var at undersøge dannelsen af ​​PGCCs i kolon kræftceller og identificere mekanismer formation. Behandling af HCT-116 og Caco-2 colon cancerceller med hypoxi efterligne CoCl

2 inducerede dannelsen af ​​celler med større celle og nuklear størrelse (PGCCs), mens celler med normal morfologi selektivt blev elimineret. Cytometrisk analyse viste, at CoCl

2-behandling inducerede G2 cellecyklusstandsnings og frembringelsen af ​​en polyploid cellesubpopulation med forøget cellulær DNA-indhold. Polyploidi hypoxi-induceret PGCCs blev bekræftet ved FISH-analyse. Endvidere CoCl

2 behandling effektivt induceret stabilisering af HIF-1α, den differentielle ekspression af en trunkeret form af p53 (P47) og reducerede niveauer af cyclin D1, hvilket indikerer molekylære mekanismer associeret med standsning af cellecyklus ved G2. Generering af PGCCs bidrog også til udvidelse af en celle subpopulation med cancer stamceller (CSCS) egenskaber, som angivet ved colonosphere formation assays, og øget kemoresistens til 5-fluoruracil og oxaliplatin. Afslutningsvis den farmakologiske induktion af iltsvind i tyktarmskræft celler forårsager dannelsen af ​​PGCCs, udvidelse af en celle delpopulation med CSC karakteristika og kemoresistens. De molekylære mekanismer involveret, herunder stabilisering af HIF-1 α, inddragelse af p53 /P47 isoform og cellecyklusstop ved G2, foreslå nye mål for at forhindre tumor tilbagefald og behandlingssvigt i tyktarmskræft

Henvisning.: Lopez-Sánchez LM, Jimenez C, Valverde A, Hernandez V, Peñarando J, Martinez A, et al. (2014) CoCl

2, en Mimic af Hypoxi inducerer Dannelse af polyploide kæmpeceller med Stem Karakteristika i tyktarmskræft. PLoS ONE 9 (6): e99143. doi: 10,1371 /journal.pone.0099143

Redaktør: Carl G. Maki, Rush University Medical Center, USA

Modtaget: 31 Marts 2014; Accepteret: 9 maj 2014; Udgivet 16. juni, 2014

Copyright: © 2014 Lopez-Sánchez et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle data er inkluderet i manuskriptet

Finansiering:. Støttet af tilskud til A.R.-A. fra Programa de Promoción de la Investigación en Salud del Ministerio de Economía y Competitividad, Instituto de Salud Carlos III (PI10 /00428 og PI13 /00553) (https://www.isciii.es/). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er den anden mest almindelige kræftform med 1,234,000 tilfælde på verdensplan i 2008 i henhold til GLOBOCAN [1]. CRC tegner sig for 13% af alle kræfttilfælde og næsten 1000 nye CRC tilfælde blev diagnosticeret i 2012 i Europa [2], hvor er den tredje hyppigste kræftform og efter lungekræft er den næsthyppigste dødsårsag [3]. Selvom dødeligheden fra CRC er faldet en smule fra 1990 til i dag, og på trods af fremskridt i påvisning og kirurgisk behandling, er der ingen kendt kur mod metastaserende CRC, og 5-års overlevelsesraten for disse patienter er skuffende lavt (ca. 8%) . Eksistensen af ​​en forholdsvis sjælden langsomt prolifererende eller hvile celle delpopulation, meget modstandsdygtige over for medicin, med lignende egenskaber til stamceller og er kendt som cancer stamceller (CSCS), er blevet foreslået som en hovedårsag til den alarmerende ineffektivitet af standard behandlinger mod kræft [ ,,,0],4], [5]. I det sidste årti er det blevet vist, at disse CSCS kan formere og fremstille hele tumormasse. Dette har ført til at foreslå en model af CSCS, eller tumor hierarkisk model, hvor tumorceller er heterogene, og kun en lille cellepopulation, som er i toppen af ​​den hierarkiske pyramide, er ansvarlig for at initiere og opretholde tumorvækst [5] . nyere undersøgelser tyder imidlertid på, at kræft stemness kan erhverves ved at ændre genekspression programmer og derfor CSC biologi skal skifte fra en stiv hierarkisk til en mere fleksibel model [6], [7]. CSCS er meget mere modstandsdygtige end differentierede tumorceller til terapier, der anvendes i klinikken [4], [8], og selv om behandlingen er i stand til effektivt at fjerne de fleste af de tumorceller og tumorvolumen aftager, CSCS påvirkes ikke, og når terapien stopper de er i stand til at genoptage tumorvækst og differentiering, forklarer begivenheder som tumor tilbagefald. Således er det blevet vist, at risikoen for fornyet CRC er proportional med ekspression i den primære tumor af gener specifikke for intestinale stamceller, som også identificere en CSC befolkning i tumoren [9]. Desuden, CSCS synes at spille en vigtig rolle i formidlingsprocessen, tumor hviletilstand og metastase [10].

Hypoxi er en af ​​de vigtigste patologiske træk ved de faste tumorer, fordi det er et resultat af en ubalance mellem proliferation af tumorceller og iltforsyning [11]. Tumor hypoxi repræsenterer ikke kun et stort problem, der berører terapeutiske indsats, men der er eksperimentelt bevis, der udgør en fysiologisk selektivt pres fremme tumor aggressivitet [12]. Vigtigere, er hypoxi forbundet med vedligeholdelse og dannelsen af ​​CSCS [11], [13], fremme deres fænotype og tumorigenese [14]. Mange af de cellulære reaktioner på hypoxi medieres gennem ændringer i genekspression er reguleret af hypoxi inducerbare faktor (HIF-1α), som er blevet en meget attraktivt mål for udvikling af nye behandlinger mod kræft [11]. Under normoksiske betingelser HIF-1α protein løbende nedbrydes efter hydroxylering ved prolyl hydroxylaser af to centrale prolin rester i sin ilt afhængige nedbrydning domænet [15]. Men under hypoxiske betingelser HIF-1α er stabiliseret, translokerer til kernen og, efter binding til HIF-1β-underenhed, danner en aktiv transkriptionsfaktor stand til at aktivere ekspression af målgener lette cellulær tilpasning til hypoxi [13]. Cobalt chlorid (CoCl

2) er en mimetisk stof, der anvendes

in vitro

at fremkalde cellulære responser medieret af hypoxi. Det menes, at CoCl

2 stabiliserer HIF-1α ved inhibering prolyl hydroxylase-enzymer [16].

Det er blevet foreslået, at i lighed med normale stamceller, den lokale mikromiljø er kritisk for at opretholde overlevelse CSCS i deres “niche”, hvor modtagelsen af ​​de specifikke molekylære signaler regulere deres proliferation og differentiering [17]. Overraskende, selv om flere undersøgelser for nylig har vist en vigtig rolle, endotelceller (EC’er) og perivaskulær niche i reguleringen af ​​normale stamceller og CSCS, andre undersøgelser viser, at hypoxi også spiller en vigtig rolle [17]. Vigtigheden af ​​en perivaskulær niche i reguleringen CSCS på den ene side og den rolle, iltsvind i den anden kan synes ved første øjekast paradoksalt. Ikke desto mindre kan EC’er i tumormikromiljøet undergå funktionelle ændringer, der fører til dannelsen af ​​et hypoxisk mikromiljø. Således er glioblastom CSCS findes i intim kontakt med den afvigende tumorvaskulatur [18]. For nylig blev det rapporteret, at hypoxi kan vælge polyploide gigant kræftceller, (PGCCs), der bidrager aktivt til tumorvækst ved at generere CSCS [19]. Faktisk er størstedelen af ​​humane tumorer er cellulær heterogene [20], og i over et århundrede, har patologer observeret giant celletumorer, signifikant oftere efter en form for terapeutisk intervention [19]. Disse celler bidrager til tumor heterogenitet men de fleste af deres funktioner er endnu ikke defineret. Skønt induktion af polyploidi har sædvanligvis fundet den reproduktive ende af celler, der er tegn på, at kæmpeceller bidrager til cellerepopulation under tumortilbagevenden [21], [22].

Selv om der er data om frembringelsen af PGCCs i æggestokkene og brystkræft, stadig udefineret rolle disse celler i udvikling, progression og respons på behandling i CRC. Derfor er det vigtigste mål med denne undersøgelse var at undersøge

in vitro

generation PGCCs i kolon kræftceller og identificere mekanismer formation.

Materialer og metoder

Cell Kultur og colonosphere formation assay

Caco-2-celler (ECACC, Salisbury, UK) blev dyrket i MEM med Earles salte (PAA Laboratories GmbH, Pasching, Østrig) indeholdende 15% føtalt bovint serum. HCT-116-celler (DSMZ, Braunschweig, Tyskland) blev dyrket i McCoys 5A-medium (Biowest, Nuaille, Frankrig) indeholdende 10% føtalt bovint serum (PAA Laboratories). Dyrkningsmedier blev suppleret med 2 mM glutamin, 1% ikke-essentielle aminosyrer, penicillin (100 U /ml), streptomycin (100 ug /ml) og amphotericin B (2,5 ug /ml). Celler blev holdt i en fugtig atmosfære ved 37 ° C og 5% CO

2. En frisk stamopløsning 0,4 M cobaltchlorid (CoCl

2) blev fremstillet i vand og tilsættes til mediet for at opnå de ønskede endelige koncentrationer.

For colonosphere dannelse analysen, efter behandling med forskellige doser af CoCl

2 i 48 timer blev celler tripsinized, talt og re-podet ved klontæthed (1 celle /pl) i 96-brønds plade med ultralav fastgørelsesflade (Costar, Corning, NY, USA) med serumfrit Dulbeccos MEM Nutrient Mixture F + 12 Ham medium suppleret med 10 ng /ml basisk fibroblastvækstfaktor, 20 ng /ml epidermal vækstfaktor og 1% v /v methylcellulose (R 0,05

Resultater

CoCl

2 behandling inducerer dannelsen af ​​PGCCs i kolon kræftceller

Når HCT-116 og Caco- 2 tyktarmskræft cellelinjer blev dyrket under normale forhold nogle store celler med forstørrede kerner (PGCCs) blev sporadisk observeret. Men når cellerne blev behandlet med CoCl

2 disse PGCCs steg tydeligt i antal, mens celler med normal morfologi selektivt blev elimineret (figur 1A). De PGCCs induceret af CoCl

2 behandling var 3-10 gange større end normale celler, og med en karakteristisk morfologi afhængigt af cellelinjen (figur 1A). Således i HCT-116 celler behandlingen med CoCl

2 genererede PGCCs med cytoplasmatiske extensions minder om celler af neuronal type (figur 1A), mens de inducerede PGCCs i Caco-2 celler blev rundet og havde ingen grene (fig. 1A) . Stigningen i nukleare størrelse efter behandling også varierede mellem de to cellelinier, og selv om der blev observeret en klar stigning i begge cellelinier, det nukleare udvidelse var mere udtalt i tilfælde af Caco-2 celler (figur 1b).

A) Både HCT-116 og Caco-2-cellelinier blev behandlet med 300 pM CoC

2 i 48 timer. Alle mikrofotografier blev opnået ved anvendelse den samme endelige forstørrelse (x 200). Scale bar svarer til 20 mikron. Farvning af cellekerner med DAPI blev udført for at vurdere den gennemsnitlige nukleare størrelse (Final forstørrelse, × 200). Skalapanelerne svarer til 20 mikron. B) ændringer i nukleare størrelse efter CoCl

2 behandling. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± SD af tre uafhængige forsøg (* p 0,05, sammenlignet med kontrollen)

PGCCs dannelse i colon cancerceller er associeret med cellecyklus ændringer og polyploidi

for yderligere at udforske de mekanismer, der er ansvarlige for induktion af PGCCs blev cellecyklus analyseret ved anvendelse af flowcytometri. I begge cellelinier CoCl

2-behandling forårsagede klare ændringer i forskellige faser af cellecyklussen (figur 2). En tydelig reduktion i antallet af celler i G1-fasen, samt en stigning af celler i S og G2 faserne blev observeret. Endvidere flowcytometrisk analyse bekræftede, at behandling med CoCl

2, der efterligner hypoxi kan generere en celle subpopulation med en stor stigning i DNA-indhold og derfor svarer til PGCCs. Den polyploid karakter af disse celler blev bekræftet ved fluorescens in situ hybridisering (FISH) til at detektere tilstedeværelsen af ​​multiple kopier af DNA i individuelle PGCCs. For Caco-2 celler FISH analyser givet overbevisende resultater, muligvis fordi denne cellelinie allerede har et alvorligt ændret karyotype. Imidlertid kan som det fremgår af figur 3, mens HCT-116 kontrolceller viste normale nuklear størrelse og markører indikeret normal disomi for kromosomer X (grøn), 18 (blå) og 21 (rød), behandling med CoCl

2, inducerede PGCCs viser en øget nuklear størrelse ledsaget af polyploidi for de tre kromosomale markører, der anvendes.

Både HCT-116 (A) og Caco-2 (B) celler blev behandlet med de angivne doser af CoCl

2 for 6 eller 48 timer. Dernæst blev en cellecyklus analyse udført ved flowcytometri. Søjlediagrammerne til højre viser de relative ændringer med kontrolceller i procentdelen af ​​celler i forskellige faser af cellecyklussen. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± SD af tre uafhængige kulturer.

HCT-116-celler blev dyrket i nærvær af 300 uM CoCl

2 og derefter en FISH-analyse under anvendelse af prober til kromosomer X (grøn) , 18 (blå) og 21 (rød) blev udført.

Molekylære mekanismer involveret i dannelsen af ​​PGCCs i tyktarmskræft

En række forsøg blev næste udført for at analysere den mulige molekylære mekanismer involveret i frembringelsen af ​​PGCCs i tyktarmskræft celler. Først blev ekspression af HIF-1α protein analyseres for at bekræfte, at behandlingen med CoCl

2 effektivt kan inducere dets stabilisering. Som vist i figur 4, selvom ekspressionen af ​​HIF-1α var ikke påviselig i kontrolceller, behandling med CoCl

2 induceret i begge cellelinier, og i en dosis-afhængig måde, en stigning i ekspressionsniveauerne af dette protein . Derfor efterligner af hypoxi i colon cancerceller er associeret med ændringer i cellecyklus og frembringelsen af ​​PGCCs.

A) HCT-116 og Caco-2-celler blev behandlet med de angivne doser af CoCl

2 til 6 timer, og derefter ekspression af HIF-1α, p53 og cyclin D1-proteiner blev evalueret under anvendelse af specifikke antistoffer. B) Den tilsvarende densitometrisk analyse af proteinbåndene påvist i de immunblots og normaliseret til signalet for β-actin er også vist. Data er middelværdier ± SD af tre uafhængige forsøg. (* P 0,05, sammenlignet med kontrollen)

På den anden side er ekspressionen af ​​cyclin D1 er afgørende for cellecyklussen at gå fra G1 til S-fasen, et punkt, hvor cellen. har allerede forpligtet sig til at færdiggøre en ny runde af celledeling. Når cellen “beslutter” for at starte denne S fase, er høje niveauer af cyclin D1 nedreguleret til at tillade DNA-syntese. Hvis forholdene fortsat tillader cellevækst, cyclin D1 niveauet stige igen under G2 fasen. Men hvis cellecyklussen er kompromitteret på dette tidspunkt, cyclin D1 niveauer forbliver lave. Som vist i figur 4, lavere niveauer af cyclin D1 observeret ved behandling af HCT-116 eller Caco-2-celler med CoCl

2 også foreslået en cellecyklusstandsning ved G2, hvilket bekræfter resultater opnået i flowcytometrianalyse.

Det er kendt, at p53 spiller en vigtig rolle i reguleringen af ​​cellecyklusprogression på G1 og G2 checkpoints. Specifikt som respons på DNA-skade, aktivering af molekylære veje reguleret af p53, fører til standsning af cellecyklus ved G1 [23]. Endvidere nylig er det blevet rapporteret, at ekspression af et p53-isoform mangler de første 39 aminosyrer og betegnet P47, er involveret i standsning af cellecyklus ved G2 i respons på forskellige celle stressbetingelser, herunder endoplasmatisk reticulum stress, udfoldet protein reaktion og hypoxi [24]. Derfor vi næste analyserede ekspression af begge p53-isoformer i tyktarmskræft celler efter behandling med CoCl

2. Som vist i figur 4, har behandling med CoCl

2 ikke ændre ekspressionen af ​​fuldlængde p53 (p53FL), men inducerede ekspressionen af ​​det trunkerede isoform (p53 /P47). Disse resultater antyder, efterligner af hypoxi i colon cancerceller inducerer ekspressionen af ​​p53 /P47 isoform negativt regulerer cellecyklusprogression ved G2. Derfor blev rollen af ​​p53 /P47 nærmere ved at behandle kolon kræftceller med pifithrin-α (PFT-α), som specifikt undertrykke p53-medieret transaktivering. Behandling af Caco-2-celler med PFT-α forårsagede en uventet cytotoksicitet der udelukkede efterfølgende morfologiske og cellecyklus analyser. Men, og som vist i figur 5A, behandling af HCT-116 celler med 10 pM PFT-α reducerede virkningen af ​​CoCl

2 på cellecyklus Desuden er denne forbehandling, som specifikt blokerer den transskriptionelle aktivitet af p53, ophævede dannelsen af PGCCs induceret af CoCl

2 i HCT-116-celler (figur 5B). Derfor transkriptionelt aktiv p53 /P47 er nødvendig for hypoxi-induceret cellecyklus ændringer og dannelsen af ​​PGCCs i tyktarmskræft celler.

HCT-116 celler blev behandlet med 300 pM CoC

2 i tilstedeværelse eller i fravær af 10 uM pifithrin-α (PFT-α), som er en specifik inhibitor af den transkriptionelle aktivitet af p53. Dernæst blev en cellecyklus analyse udført ved flowcytometri. (A) Dataene repræsenterer middelværdien ± SD af tre uafhængige kulturer. (* P 0,05 sammenlignet med celler udsat for CoCl

2 i fravær af PFT-α), og (B) ændringer i cellemorfologi blev undersøgt ved hjælp af synligt mikroskopi. Scale barer svarer til 50 mikrometer.

PGCCs generation i tyktarmskræft er forbundet med en stigning i subpopulationen af ​​cancer stamceller

Det er blevet foreslået, at hypoxi genererede PGCCs kan bidrage aktivt til tumorvækst ved generering af CSCS [19]. Derfor besluttede vi at analysere derefter dannelse af colonospheres

in vitro

, som er en funktionel analyse af selvfornyelse capbility af CSCS. Til dette formål efter berigelse i PGCCs ved behandling med CoCl

2 i 48 timer, overlevende celler blev dyrket ved klonal tæthed med serumfrit medium i lav adhærens plader, der forhindrer cellulær adhæsion. Under disse betingelser, differentierede epiteliale tumorceller dø ved anoikis og kun en subpopulation af tumor udifferentierede celler med stamceller egenskaber (CSCS) overlever, der er i stand til at generere tumorospheres (colonospheres) i suspension ved selv-fornyelse. Tidligere forsøg under anvendelse lipofile fluorescerende pletter blev udført for at bekræfte, at de enkelte colonospheres blev afledt af enkeltceller. Således blanding af lige mange Dil (Red) – eller DiO (Grøn) -mærkede celler før udførelse af colonosphere dannelse assayet resulterede i dannelsen af ​​kugler kun indeholder én eller anden etiket (fig S1)

som vist i figur 6, forbehandling med CoCl

2 efterfulgt af opkoncentrering af PGGCs steg i både HCT-116 og Caco-2-celler evnen til at danne colonospheres, hvilket antyder, at dannelsen af ​​PGCCs bidrager til udvidelse af CSC subpopulationen i begge cellelinier. Derefter blev de dannede colonospheres opdelt, og den resulterende cellepopulation blev dyrket igen ved klontæthed for dannelsen af ​​sekundære colonospheres. (Figur 6). Celler afledt af primære colonospheres dannet af CoCl

2-behandlede tyktarmscancerceller bevaret en højere evne til at danne colonospheres, bekræfter en overlegen selvfornyelse kapacitet. Endvidere sekundære colonospheres afledt af colonospheres dannet af celler udsat for hypoxi var signifikant større i størrelse sammenlignet med dem afledt fra kontrolceller (figur 7). Denne stigning i størrelse bekræftet, at CSCS genereres i en celle population beriget med PGCCs også besad en større evne til selv-fornyelse, og derfor havde de mere markante stemness egenskaber [25].

Efter berigelse i PGCCs ved behandling for 48 uM CoC

2, overlevende celler blev dyrket ved klonal tæthed med serumfrit medium i lav-vedhæftningsegenskaber plader og antallet af primære dannede colonospheres blev evalueret efter syv dage. Primære colonospheres var opdelt, og den resulterende cellepopulation blev dyrket igen ved klontæthed for dannelsen af ​​sekundære colonospheres. Grafik viser antallet af primære (grå søjler) og sekundære (sorte søjler) colonospheres dannet af HCT-116 og Caco-2 celler efter hver behandling. Dataene repræsenterer middelværdien ± SD af tre uafhængige kulturer. (* P 0,05, sammenlignet med kontrol)

Den sekundære colonosphere dannelse assay blev udført som beskrevet i figur 6 forklaring og under Materialer og Metoder. (Final forstørrelse, × 200). Scale bar svarer til 10 mikrometer.

Produktion af PGCCs i kolon kræftceller er associeret med resistens over for 5-fluorouracil og oxaliplatin

I forhold til flere normoksiske tumorer, tumorer med en højere hypoxisk fraktion er mere modstandsdygtige over strålebehandling og kemoterapi [12]. Også begge PGCCs [19] som CSCS [5], er blevet associeret med resistens over for kemoterapi. Derfor næste besluttede vi at analysere i kolon kræft cellekulturer beriget med PGCCs den antiproliferative aktivitet af 5-fluorouracil og oxaliplatin, to almindeligt anvendte lægemidler i kemoterapi af kolorektal cancer. Som vist i figur 8, de cellekulturer, der var blevet beriget i PGCCs ved behandling med CoCl

2, viste en øget resistens over for den antiproliferative virkning af begge lægemidler.

Både HCT-116 og Caco-2 celler blev præinkuberet i 48 timer i nærvær eller fravær af CoCl

2 for PGCC berigelse og derefter de blev udsat i 72 timer for forskellige doser af 5-fluoruracil (A) eller oxaliplatin (B). Celleproliferation er vist som procent af kontrolceller ueksponerede til kemoterapeutiske lægemidler. Dataene repræsenterer middelværdien ± SD af tre uafhængige forsøg (* p 0,05, sammenlignet med celler uden CoCl

2 behandling)

Diskussion

Hypoxi i tumorer har længe. blevet forbundet med øget tumor aggressivitet, dårligere prognose og større modstand mod strålebehandling og kemoterapi [26]. I denne undersøgelse viste vi, at efterligne hypoxi in vitro ved hjælp CoCl

2, som stabiliserer HIF-1α protein ved at inhibere dets nedbrydning, kan frembringe PGCCs i coloncancer cellekultur. PGCCs induceret af behandling med CoCl

2 er stabile og besad karakteristiske morfologi men deres generation under fysiologiske

in vivo

hypoxiske betingelser er endnu ikke fastslået. I vores eksperimenter, morfologi PGCCs induceret af hypoksi varierede mellem HCT-116 og Caco-2-celler (figur 1). Denne afhængighed af cellelinie falder sammen med studiet af Zhang et al [19], hvor PGCCs afledte tumorcellelinier HEY (ovarie) og MDA -MB-231 (bryst) havde en neuronal-lignende morfologi, hvorimod PGGCs afledt fra SKOV3-celler (ovarie ), viste en afrundet morfologi uden cytoplasmatiske udvidelser eller filialer. I vores undersøgelse morfologi PGCCs afledt af HCT-116-celler falder sammen med dem fra HEY og MDA -MB-231-celler, mens de, der genereres i Caco- 2 var mere lig dem beskrevet for SKOV3-celler. Det skal understreges, at HEY, MDA -MB- 231 og HCT-116 er markant invasive cellelinjer, som er repræsentativ for den epitel mesenkymale overgang (EMT) proces, som lider nogle subpopulationer af tumorceller [27]. Derfor eller resultater tyder på, at det genetiske program, der styrer EMT i tumorceller også kan være en vigtig faktor i dannelsen af ​​PGCCs med højere kapacitet af infiltration og spredning.

Vores resultater viste også, at dannelsen af ​​PGCCs i colon cancerceller er associeret med ændringer i cellecyklus og efterfølgende polyploidi (figur 2 og 3). Encellede prokaryote og eukaryote celler dividere med amitotic processer. I komplekse eukaryote celler, selvom mitose hersker, veldokumenterede ændringer i den mitotiske cellecyklus sker at opnå cellevækst og udvikling under stressende omstændigheder. Blandt disse variationer er endoreplication proces, en variation af normal mitotisk cellecyklus, som involverer multiple runder af DNA-replikation uden deltagelse af trinnet med mitose [28]. Tumor kæmpeceller observeret af patologer er traditionelt blevet betragtet som inert fra synspunkt tumorrepopulation. Men nye data viser, at disse celler er i stand til at generere klonogene afkom ved asymmetrisk deling og spirende [19]. Således er en fremgangsmåde blevet beskrevet, hvor cellerne undslippe mitotiske katastrofe-induceret celledød ved at blive PGCCs at inden de dør, giver anledning til flere celler via nuklear knopskydning og asymmetrisk cytokinese. Denne tilstand af celledeling i cancer er blevet benævnt neosis, og er blevet relateret til oprindelsen af ​​cancer stamceller [29], [30].