PLoS ONE: en inducerbar, isogene Cancer cellelinje System til Målretning staten Uoverensstemmelse Reparation Deficiency

Abstrakt

DNA basefejlparringsreparationssystemet (MMR) fastholder genom stabilitet gennem anerkendelse og reparation af enkelt-base mismatch og små insertion-deletion loops. Inaktivering af MMR-vejen forårsager mikrosatellit ustabilitet og akkumuleringen af ​​genomiske mutationer, der kan forårsage eller bidrage til kræft. Faktisk 10-20% af visse faste og hæmatologiske kræftformer er MMR-deficiente. MMR-mangel kræftformer ikke svare på nogle standard af pleje kemoterapeutika grund af formodet øget tolerance af DNA-skader, hvilket understreger behovet for nye terapeutiske lægemidler. Mod dette mål genereret vi isogene kræft cellelinier til direkte sammenligning af MMR-dygtige og MMR-defekte celler. Vi manipuleret NCI-H23 lunge adenocarcinomceller at indeholde en doxycyclin-inducerbar shRNA designet til at undertrykke ekspressionen af ​​fejlparringsreparationsgenet MLH1, og sammenlignet encellede subkloner, der blev uinducerede (MLH1-dygtige) versus induceret for MLH1 shRNA (MLH1-deficient ). Her præsenterer vi karakteriseringen af ​​disse MMR-inducerbare cellelinjer og validere en ny klasse af rhodium metalloinsertor forbindelser, forskelligt hæmmer udbredelsen af ​​MFR-mangelfulde cancerceller

Henvisning:. Bailis JM, Gordon ML, Gurgel JL, Komor AC, Barton JK, Kirsch IR (2013) en inducerbar, isogene Cancer cellelinje System til Målretning staten fejlparringsreparationsmangel. PLoS ONE 8 (10): e78726. doi: 10,1371 /journal.pone.0078726

Redaktør: Klaus Roemer, University of Saarland Medical School, Tyskland

Modtaget: Juni 24, 2013; Accepteret: September 17, 2013; Udgivet: 29 Oktober 2013

Copyright: © 2013 Bailis et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne takker NIH (GM33309 til JKB) og NSF (stipendium til ACK) om økonomisk støtte. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Julie Bailis, Marcia Gordon, Jesse Gurgel, og Ilan Kirsch er eller var medarbejdere i Amgen, Inc. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

genom ustabilitet er kendetegnende for kræftceller og kan føre til numerisk eller strukturelle ændringer af kromosomer (kromosom ustabilitet, eller CIN) eller nukleotid mismatch repair (MMR) mangel (MIN) [1]. Mens CIN kan skyldes tab af funktion af en række cellulære veje, MIN resultater specifikt for fejl i MFR-systemet og kan identificeres af gevinst eller tab af mono-, di- eller tri-nukleotid repeat sekvenser, benævnt mikrosatellit ustabilitet (MSI) (revideret i 2). Replication fejl såsom polymerase skridning genererer små indsættelse-deletion sløjfer (IDLs) eller enkelte basefejlparringer i DNA’et. DNA-skader kan også ændre baser at forårsage uoverensstemmelser. I humane celler, der er MFR-dygtige, heterodimerer, der indeholder de bakterielle MutS homolog MSH2 binder et misforhold, og derefter heterodimerer, der indeholder den bakterielle MutL homolog MLH1 associeret med protein: DNA-kompleks til at mægle rekrutteringen af ​​reparation faktorer, punktafgifter misforholdet og genoprette den korrekte DNA-sekvens. MMR-defekte celler ikke er i stand til at korrigere uoverensstemmelser, hvilket resulterer i inkorporering af fejl i DNA-skabelonen og en mutator fænotype.

MMR-mangel er stærkt forbundet med kræft. Kim line mutation af MMR-gener, især MLH1 eller MSH2, er grundlaget for arvelig ikke-polypose colorectal cancer (HNPCC), eller Lynch-syndrom, som giver modtagelighed for kolorektal cancer, men også til andre specifikke kræfttyper herunder endometrie og ovariecancer (revideret i 3,4). Mutation eller hypermethylering af MMR-gener i somatiske celler er associeret med ca. 15% af sporadiske colorektale cancere, samt 10-15% af ovarie-, endometrie- og gastriske cancere (gennemgået i 5). MMR-mangel og MSI er også blevet identificeret i op til 20% af leukæmier hos patienter, der tilbagefald eller at udvikle sygdommen som følge af kemoterapi [6].

MMR-mangel og MSI også forekomme i primær lungecancer forbundet med rygning eller eksponering for chrom [7-9]. Cancere med MSI er blevet rapporteret at være resistente over for flere standard-of-care kemoterapeutiske midler, såsom antimetabolit 5-fluorouracil (5-FU), platinforbindelserne cisplatin og carboplatin, det alkylerende stof temozolomid, og topoisomeraseinhibitoren etoposid [ ,,,0],10]. Inaktivering af MMR-vejen kan tillade celler til at tolerere visse former for DNA-skader uden at indlede en vej af programmeret celledød [11].

En udfordring at identificere terapier for MMR-mangelfulde kræftsygdomme er, at de molekylære mål og klinisk fænotyper som følge af inaktivering af MMR-gener er variable. MMR mangel kan føre til læserammeforskydningsmutationer i gener, der indeholder gentagne sekvenser i DNA’et, og mindst 30 gener er blevet identificeret som potentielle mål for MSI, herunder onkogener BRAF og KRAS, og DNA-skade respons gener MRE11, BRCA1 og ATR [ ,,,0],12,13]. Bestræbelserne på at identificere nye terapeutiske mål, der udviser syntetisk letalitet med MFR-mangelfulde cancerceller har afsløret variabilitet i genetiske mål med tab af funktion af MLH1 eller MSH2 [14]. Tilsammen udgør disse observationer støtter tanken om, at kræft med MSI repræsenterer en mangefacetteret, heterogen sæt af sygdomme. I betragtning af kompleksiteten af ​​MSI tumorer, har vi tidligere foreslået målrettet enden fænotype eller “tilstand” af fejlparringsreparationsmangel selv [15,16].

I den nuværende indsats er beskrevet her, vores mål var at udvikle værktøjer for at gøre undersøgelser af induceret fejlparringsreparationsmangel. Vi beskriver en helt isogene cellelinje system, hvor ekspressionen af ​​MMR-gen MLH1 kan slås til eller fra med shRNA. Som vores modelsystem vi bruges lungeadenokarcinom NCI-H23, en cellelinie udvalgt på basis af relativt høje niveauer af MLH1, som kunne reversibelt inaktiveres af shRNA. I denne undersøgelse har vi inducere MMR-mangel i NCI-H23-cellelinje systemet og vise, at dette resulterer i MSI og forøget resistens over for DNA-beskadigende midler. Som en potentiel skridt mod at udvikle en terapeutisk der retter sig mod enden “state” af MMR-mangel, bruger vi også denne cellelinje system til at yderligere at validere en ny klasse af metalkomplekser, der er målrettet DNA mismatch.

Materialer og metoder

Kort hårnål RNA (shRNA)

Sekvenser forudsagt at banke ned udtryk for MLH1 eller MSH2 generne var designet ved hjælp BLOCK-IT RNAi Designer (Life Technologies). Fire uafhængige sekvenser for hvert gen blev valgt som kandidat shRNA udløser som angivet nedenfor (nummerering angiver position på cDNA).

MLH1.

362 GCCTGAAGTTGATTCAGATCC

740 GCAGGTATTCAGTACACAATG

928 GGTTACATATCCAATGCAAAC

2237 GCGCTATGTTCTATTCCATCC

MSH2.

399 GCATCCAAGGAGAATGATTGG

1102 GGATTAAGCAGCCTCTCATGG

1260 GCAGCAAACTTACAAGATTGT

2359 GGGCTATATCAGAATACATTG

Den anvendte metode til konstruktion af shRNA kassetter er blevet beskrevet i detaljer andetsteds [17]. Kort fortalt blev shRNA sense-loop-antisense-konstruktioner af disse sekvenser genereret ved PCR under anvendelse TTCATGAGA som loop sekvens. Det endelige PCR-produkt, der indeholdt sense-loop-antisense shRNA sekvenser flankeret af

attB1

websted og tH1 promotor på 5′-enden, og en opsigelse signal og

attB2

site på 3′-enden, blev derefter klonet ind i Gateway vektoren pDONR (Life Technologies). Gateway rekombinationsteknikker blev derefter brugt til at overføre shRNA kassetter i Gateway-kompatible lentiviral destination vektorer pLV736G eller pLV739G.

Lentivirale stamopløsninger blev fremstillet som beskrevet [17]. 293-METR celler [18] blev transficeret med en pLV736G eller pLV739G vektor, som indeholdt en individuel shRNA kassette, sammen med plasmider indeholdende de Gag /Pol, Rev, og env-gener. Efter inkubation natten over blev supernatanten opsamlet, filtreret, koncentreret ved ultracentrifugering og opbevaret ved -80 ° C.

Cell line generation

NCI-H23-celler opnået fra American Type Culture Collection (ATCC ) blev dyrket i RPMI medium med 10% føtalt bovint serum. For lentiviral transduktion, blev NCI-H23-celler podet ved 2 x 10

4 ml i 12-brønds plader og inkuberet natten over. Medier blev opsuget fra cellerne og erstattet med Opti-MEM-medier (Life Technologies), som indeholdt 10 ug /ml Diethylaminoethyl-dextran (GE Healthcare Life Sciences) og 1-5 x 10

6 transduktion enheder pr milliliter (TU /ml ) af lentivirus. Celler blev transduceret med lentivirus indeholdende MLH1 shRNA eller MSH2 shRNA. Plader blev inkuberet natten over, og derefter medier indeholdende lentivirus blev suget fra og erstattet med frisk RPMI-medium. Efter 1-3 dage (d), blev celler ekspanderet til plader med 6 brønde og dyrket i nærvær af selektionsmidlet (250 ug /ml G418 for MLH1 og 2,5 ug /ml puromycin for MSH2). 500 ng /ml doxycyclin (Sigma-Aldrich) blev tilsat til cellerne for at inducere ekspression af shRNA.

Celler dyrket under selektion og med shRNA induceret i mindst 2 måneder, blev udpladet til plader med 96 brønde ved en densitet på 0,3 celler pr brønd for at selektere for enkeltcellesuspensioner subkloner. Enkeltcellesuspensioner subkloner blev ekspanderet og holdt under udvælgelsesbetingelser. Uinducerede celler anvendt til sammenligning med de inducerede subkloner blev opnået ved at dyrke subklonerne i fravær af doxycyclin i mindst en uge.

Antistoffer og western blots

Proteinlysater blev fremstillet i lysebuffer ( 50 mM HEPES, 1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA, 10% glycerol, 1 mM dithiothreitol), hvortil phosphatase og proteasehæmmere (20 mM glycerophosphat, 100 mM natriumfluorid, 0,5 mM phenylmethylsulfonylfluorid, 0,1 mM natriumorthovanadat, 10 ug /ml leupeptin) blev tilsat. Lysater blev klaret ved centrifugering og derefter analyseret ved SDS-PAGE på 4-12% Bis-Tris-geler (Life Technologies) efterfulgt af immunblotting. Primære anvendte antistoffer var imod MLH1 (Becton Dickinson # 551.091), MSH2 (Becton Dickinson # 556.349), GAPDH (Abcam # ab9484), phosphoryleret histon H2AX (Millipore # 05-636) eller tubulin (Cell Signaling # 2148). Primære antistoffer blev påvist med sekundære antistoffer konjugeret til IRDye700 eller IRDye800 (LICOR) og visualiseret med Licor Odyssey. Hver Western blot forsøg blev udført mindst to gange, på uafhængige dage. Repræsentative data fra et enkelt forsøg er vist.

DNA fragment analyse

Genomisk DNA fra NCI-H23 subkloner blev fremstillet under anvendelse af en DNeasy kit (Qiagen). Multiplex PCR-reaktioner blev udført ifølge MSI Analysis System, Version 2.1 (Promega). PCR-produkter blev analyseret på en ABI 3130 sequencer, og derefter blev analyseret under anvendelse GeneMapper software (Life Technologies). Subkloner, der udviste MSI i mindst én markør i det første eksperiment blev testet igen i et uafhængigt forsøg for at bekræfte resultaterne.

Cell levedygtighed assays

Celler dyrket i fravær eller nærvær af doxycyklin blev udpladet på 2000-5000 celler pr brønd i 96-brønds plader og fik lov at inkubere natten over. Celler blev derefter behandlet med forbindelser i en dosis-respons for 4d. Cellelevedygtighed blev vurderet ved anvendelse af en celle Titer-Glo assay (Promega) for ATP-metabolisme. Celle levedygtighed assays blev udført i to eksemplarer på mindst 3 uafhængige forsøg. Repræsentative data fra ét sådant eksperiment er vist.

Fasekontrast billeddannelse af celler under spredning eksperimenter blev udført ved anvendelse af en IncuCyte med et 20X objektiv (Essen BioScience).

kolonidannende assays blev også anvendt til at teste cellelevedygtighed følgende forbindelse behandling. Celler dyrket i fravær eller nærvær af doxycyclin blev udpladet ved 500-2000 celler pr brønd i en 6-brønds plade og får lov at inkubere natten over. Celler blev behandlet med forbindelser i en dosis-respons i 24 timer (h), og derefter blev mediet aspireret og erstattet med frisk medium, som ikke indeholdt forbindelsen. Kolonier blev visualiseret med krystalvioletfarvning på 10-12d

Ældning associeret beta-galactosidase (SA – gal). Produktion blev vurderet ved anvendelse af en histokemisk plet for beta-galactosidase aktivitet ved pH 6,0 (Sigma-Aldrich) . Celler blev ubehandlet eller behandles med forbindelser som angivet for 3d, og derefter blev cellerne fikseret, farvet for SA -. Gal og filmede med et Zeiss Axio inverteret mikroskop udstyret med et farvekamera

Statistisk analyse

for cellelevedygtighedsassays blev parrede t-tests anvendt til at sammenligne halv maksimal hæmmende (IC

50) eller median lethal dosis (LD

50) værdier fra flere eksperimenter og bestemme p-værdier. P-værdier lig med eller mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Statistisk analyse blev udført med Graph Pad Prism software.

microarray analyse

Totalt RNA blev fremstillet ud fra dobbelte prøver af celler i log-vækstfase, under anvendelse af et RNeasy mini kit (Qiagen). Prøve integritet blev vurderet på en Bioanalyzer. Cy3- og Cy5-mærket RNA blev fremstillet ud fra 200 ng total RNA per prøve, og derefter hybridiseret til Humane samlede genom Arrays (Agilent Technologies) i henhold til Agilent To Color mikroarray-baseret Gene Expression Analysis protokol. Data blev analyseret i Rosetta Resolver. Salg

Kemiske forbindelser

Syntese af [Rh (HDPA)

2chrysi]

3+ og [Rh (DIP)

2chrysi]

3+ er blevet beskrevet [19,20]. Syntesen af ​​[Rh (DPE) (phen) (Chrysi)]

3+ blev for nylig rapporteret [21]. Cisplatin, doxorubicin, etoposid, 6-thioguanin og temozolomid blev opnået fra Sigma-Aldrich og opløst i DMSO eller vand. Den CDK4 /6-inhibitor PD-0.332.991 [22], der anvendes som en positiv kontrol for senescens assays, blev syntetiseret ifølge publicerede fremgangsmåder. Salg

Resultater

Inhibering af MLH1 af shRNA reducerer MLH1 proteinniveauer

NCI-H23 lunge adenocarcinom cellelinie er dygtige til mismatch repair og indeholder relativt høje niveauer af MFR proteiner MLH1 og MSH2 [23]. Med det formål at generere et tilpasset system, der inducerer MMR mangel og tillader direkte sammenligning med MMR-dygtige celler, testede vi, om ekspression af disse MMR-proteiner kan nedreguleres af shRNA. NCI-H23-celler blev transduceret med lentivirus indeholdende inducerbar shRNA til MLH1 eller MSH2, og celler, der stabilt integreret konstruktionen i genomet, blev udvalgt og udvidet. Under normale vækstbetingelser, det integrerede shRNA var ikke aktiv og MMR-proteiner udtrykkes der fortsat. Ekspression af shRNA blev reguleret ved behandling af cellerne med doxycyclin. Når shRNA blev induceret, proteinlysater fra celler, der indeholdt en af ​​de fire shRNA konstruktioner mod MLH1 demonstreret nær fuldstændig ( 90%) hæmning af MLH1-proteinet (figur S1). I modsætning hertil blev MSH2 proteinet kun delvist faldt efter induktion af enhver af de fire MSH2 shRNA konstruktioner i NCI-H23-celler (fig S1) og disse celler blev ikke yderligere karakteriseret.

På grund af muligheden for variation af shRNA ekspression i en celle population, vi isoleret og karakteriseret encellede subkloner fra NCI-H23-celler transduceret med et af shRNA konstrukter blev MLH1 928. Celler dyrkes i nærvær af doxycyclin at inducere MLH1 shRNA for mindst en måned, og derefter udpladet for enkelt celler, som blev ekspanderet til kolonier, som blev opretholdt i inducerende betingelser. MMR proteinniveauer blev derefter igen vurderet ved immunblotting. De NCI-H23 subkloner, der udtrykte MLH1 shRNA konsekvent reducerede niveauerne af MLH1 protein 90%, uden at påvirke niveauet af MSH2 protein (figur 1).

MLH1 protein niveauer i NCI-H23 subkloner induceret for MLH1 928 shRNA blev sammenlignet med MLH1 protein niveauer i NCI-H23 parentale celler (H23). Proteinlysater blev analyseret ved SDS-PAGE og immunoblotting for MLH1 og MSH2 proteinniveauer. GAPDH blev anvendt som kontrol for protein loading.

nedregulering af MLH1 inducerer mikrosatellit ustabilitet

Vi valgte mindst 20 subkloner fra NCI-H23-celler, der udtrykte MLH1 shRNA at teste for MSI. Genomisk DNA blev fremstillet fra parentale NCI-H23 celler og fra hver subklon, og derefter multiplex PCR blev udført til amplifikation af et standard panel af mikrosatellit-markører (BAT-26, BAT-25, MONO-27, NR-21 og NR-24 ). Fragmentstørrelser af PCR-produkterne blev derefter analyseret på en DNA sequencer. Alle de NCI-H23 subkloner viste MSI ved mononukleotid repeat BAT-26 [24], angives af en ændring af 1-3 nukleotider i locus (figur S2). MLH1 mangel er derfor tilstrækkelig til at fremkalde MSI. En række subklonerne vises også muligt MSI på en anden markering, med uafhængige subkloner demonstrerer ændring af forskellige markører (Fig S2). Subkloner 4-10 og 4-13, som blev opnået ved transduktion af NCI-H23 celler med MLH1 928 shRNA konstruktion, blev valgt til yderligere fænotypisk analyse.

Nedregulering af MMR-gener ved shRNA er reversibel

De NCI-H23 enkelt celle subkloner blev opretholdt under vækstbetingelser, som hele tiden inducerede shRNA udtryk. For at teste, om shRNA-medierede nedregulering af MLH1 var reversibel, blev celler fra hver subklon opdeles i to særskilte kulturer, med én kultur opretholdt i nærvær af doxycyklin at opretholde MLH1 mangel, og den anden kultur dyrket i fravær af doxycyclin at tillade MLH1-ekspression. Efter en uge blev proteinlysater fremstillet fra cellerne, og MLH1 proteinniveauet blev vurderet ved immunblotting. I fravær af doxycyklin, celler fra 4-10 og 4-13 subkloner var i stand til at re-udtrykke vildtype-niveauer af MLH1 protein (figur 2). Ikke alle de testede subkloner kunne re-express MLH1 protein efter vækst i fravær af doxycyclin (data ikke vist), hvilket antyder, at shRNA i disse subkloner kunne udtrykkes konstitutivt. Salg

NCI-H23 subkloner 4 -10 og 4-13, der blev induceret i MLH1 shRNA blev opdelt i to kulturer, en opretholdt i inducerende betingelser (+ doxycyclin) og den anden dyrket i fravær af doxycyclin (-) for at tillade re-ekspression af MLH1. Proteinlysater blev fremstillet og analyseret ved SDS-PAGE efterfulgt af immunblotting for ekspression af MLH1 proteinet. Tubulin blev anvendt som en kontrol for lige protein lastning tværs prøver.

MLH1-mangelfuld NCI-H23 subkloner ikke vise de globale ændringer i genekspression

microarray analyse blev udført på de NCI-H23-encellede subkloner at teste, om nedregulering af MLH1 af shRNA påvirker ekspressionen af ​​andre gener. Celler fra subkloner 4-10 og 4-13 blev enten opretholdt i tilstedeværelse af doxycyclin til at fremkalde MLH1 shRNA, eller dyrkes i fravær af doxycyclin i mindst en uge til at tillade videreanvendelse udtryk for MLH1. Den parentale cellelinie NCI-H23, enten ubehandlet eller behandlet med doxycyclin, blev inkluderet som en kontrol. Totalt RNA blev isoleret fra dobbelte prøver af celler, fluorescens-mærket og hybridiseret til Agilent hele genomet arrays. Genekspressionsmønstre i den ikke-inducerede subkloner svarede til dem af de parentale NCI-H23-celler, enten ubehandlede eller behandlet med doxycyclin (data ikke vist). Niveauer af MLH1 gentranskriptet blev reduceret cirka tre gange i de 4-10 og 4-13 subkloner hvor MLH1 shRNA var blevet induceret (Figur S3). En mere udbredt genekspression signatur i forbindelse med MLH1 shRNA induktion ikke fremgår af de data (Figur S3).

MLH1-mangelfuld NCI-H23 subkloner udviser øget resistens over for kemoterapeutiske medikamenter

Vi næste testet, om induceret MMR-mangel vil medføre resistens over for DNA-ødelæggende stoffer. Vi direkte sammenlignet MMR-mangelfulde NCI-H23 subkloner til MFR-dygtige celler fra den samme sub-klon, der blev opnået ved at lade cellerne til at re-express MLH1. MMR-deficiente og MMR-dygtige subkloner blev behandlet med topoisomeraseinhibitor etoposid eller alkyleringsmidlet temozolomid og cellelevedygtigheden blev vurderet efter 4d (figur 3A, D). MMR-dygtige subkloner, hvori shRNA blev uinducerede, viste ikke en signifikant forskel i følsomhed over for forbindelserne sammenlignet med parentale NCI-H23-celler, der enten var ubehandlet eller behandlet med doxycyclin (p = 0,34) (Figur S4). For hvert par tilpassede celler (f.eks induceret subklon 4-10 sammenlignet med 4-10 induceret), de MLH1-deficiente celler var konsekvent mindst to gange mere resistent over for disse forbindelser end de isogene MLH1-dygtige celler, en opdagelse der er statistisk signifikant (p = 0,04 for celler behandlet med etoposid, og p = 0,01 for celler behandlet med temozolomid) (figur 3A, D). De MLH1-manglende subkloner var også mere modstandsdygtige over for tværbindingsmidlet cisplatin (p = 0,02), purin analog 6-thioguanin (p = 0,05), og en anden topoisomeraseinhibitor, doxorubicin (p = 0,04) (Figur S5). Den cirka to-fold forskel i levedygtighed MMR-defekte celler versus MMR-dygtige celler in vitro som respons på kemoterapeutiske midler er blevet rapporteret tidligere og vist oversætte til lægemiddelresistens in vivo (gennemgået i 4,10). For at bekræfte, at den differentierede virkning på levedygtigheden er på grund af tilstedeværelsen eller fraværet af MLH1, anvendte vi forskellige shRNA sekvenser, 362 og 2239, for at inhibere MLH1 ekspression og derefter karakteriseret celle følsomhed over for kemoterapeutiske lægemidler. Vi observerede, at MLH1-mangel som følge af induktion af disse uafhængige shRNA udløser ført til en tilsvarende stigning i resistens over for kemoterapeutiske stoffer i forhold til de NCI-H23-celler, der udtrykte MLH1 (p = 0,01) (Figur S6).

NCI-H23 subkloner, der blev uinducerede eller induceret for MLH1 shRNA blev behandlet med etoposid (A-C) eller temozolomid (D-F). (A, D) Celler blev behandlet med forbindelse ved de angivne koncentrationer, og cellelevedygtighed blev vurderet ved 4d ved anvendelse af et Cell Titer-Glo assay. Graferne angiver den relative overlevelse for dobbeltprøver fra et enkelt eksperiment. T tests for at sammenligne IC

50 værdier på tværs af flere eksperimenter bestemt p-værdier for p = 0,04 for celler behandlet med etoposid, og p = 0,01 for celler behandlet med temozolomid. (B, E) fasekontrast billeder af celler ved 0t og 96h tidspunkter i løbet af cellelevedygtigheden forsøg er vist. Celler blev behandlet med 390 pM etoposid (B) eller 500 uM temozolomid (E). (C, F) Celler blev behandlet med forbindelse i 24 timer ved de angivne koncentrationer, og kolonidannende evne efter forbindelse udvaskning blev vurderet. Graferne viser procent overlevelse ved 10d for dobbeltprøver af celler behandlet med etoposid (C) eller temozolomid (F). Sammenligning af LD

50 værdier på tværs af flere eksperimenter ved t-test bestemt p-værdier for p = 0,03 for celler behandlet med etoposid, og p = 0,04 for celler behandlet med temozolomid.

At udforske forskellig sensitivitet til forbindelserne mere detaljeret, vi afbildes cellerne over 4d behandlingsperiode af celleviabilitetstest og undersøgt celletal og morfologi. På det 0h tidspunkt, cellerne er i vækstfasen og vises raske ved fasekontrast billeddannelse. Men ved 96 h, forskellene mellem de ikke-inducerede og inducerede subkloner var tydelige: De fleste af MLH1-dygtige celler havde gennemgået celledød efter behandling med DNA-ødelæggende midler, hvorimod MLH1-deficiente celler fortsatte med at proliferere (figur 3B, E). Behandling med DNA-beskadigende midler påvirkede ikke MLH1-ekspression i de ikke-inducerede subkloner men førte til forøget ekspression af phosphoryleret histon H2AX, en markør for DNA-fragmentering [25], hvilket tyder på, at MLH1-udtrykkende celler havde gennemgået apoptose (fig S7).

Vi undersøgt yderligere celleoverlevelse følgende forbindelse behandling ved hjælp klonogene assays. Celler blev behandlet med etoposid eller temozolomid i 24 timer, og genvinding fra forbindelse behandling blev vurderet ved koloni-dannelse efter 10d. De MLH1-manglende NCI-H23 subkloner var mere resistente over for sammensatte behandling end de isogene celler dygtige for MLH1 (figur 3C, F), der viser en signifikant forskel i LD

50 værdier (p = 0,03 for etoposid, og p = 0,04 for temozolomid). Tilsammen viser disse resultater en differentiel respons på DNA-skade, der udelukkende er baseret på tilstedeværelsen eller fraværet af MLH1.

MLH1-deficient NCI-H23 subklonerne display forøget følsomhed over for rhodium metalloinsertor forbindelser

Vi tidligere beskrevne metalkomplekser, der covalent binder DNA fejlparringer med moderat affinitet og høj specificitet, grundet termodynamisk destabilisering af fejlparrede basepar (gennemgået i 26). Vi oprindeligt påvist, at denne klasse af forbindelser fortrinsvis inhiberer proliferationen af ​​MMR-defekte celler, under anvendelse af et matchet HCT-116 kolorektal cancer cellelinje system og en genetisk knockout-system [16,19,21]. Dette tidligere arbejde var fundamentet og motivation for oprettelsen af ​​de isogene cellelinjer er beskrevet i den aktuelle undersøgelse og førte os til at teste, om rhodium metalloinsertor forbindelser også fortrinsvis ville hæmme levedygtigheden af ​​disse celler, når MMR-mangel blev induceret.

i vores inducerbar cellelinje system, rhodium metalloinsertor forbindelse [Rh (Chrysi) (phen) (DPE)]

3+ fortrinsvis inhiberede levedygtigheden af ​​inducerede MLH1-deficiente NCI-H23 subkloner, med mindst en tre gange ændring i den cellulære IC

50 i en 4d Cell Titer-Glo assay i forhold til MLH1-dygtige subkloner (p = 0,01) (Figur 4A, B). En anden rhodium metalloinsertor forbindelse, [Rh (HDPA)

2chrysi]

3+ også fortrinsvis inhiberede proliferation af MLH1-manglende celler (fig S8), med en to til tre gange ændring i cellulær IC

50 værdier (p = 0,02). For at bekræfte, at forskellen skyldes MLH1 mangel snarere end en off-target effekt af shRNA, vi brugte ekstra, uafhængig MLH1 shRNA konstruerer at nedregulere MLH1 i NCI-H23 celler og kontrolleret, at MLH1-defekte celler fortrinsvis følsomme over for rhodium metalloinsertor forbindelserne (p = 0,01) (Figur S9). I modsætning hertil en beslægtet forbindelse, der udviser svag binding til uoverensstemmende DNA, [Rh (DIP)

2chrysi]

3+ [21] ikke vise en differentieret effekt på celle levedygtighed uinducerede og inducerede NCI-H23 kloner (p = 0,90) (Figur S9). Sammen støtter vores data den hypotese, at nedregulering af MLH1 øger celle følsomhed over for rhodium metalloinsertor forbindelser.

NCI-H23 subkloner, der blev uinducerede eller induceret for MLH1 shRNA blev behandlet med den rhodium metalloinsertor forbindelse [Rh (Chrysi) (phen) (DPE)]

3+. (A) Celler blev behandlet ved de angivne koncentrationer, og cellelevedygtighed blev vurderet efter 4d ved anvendelse af et Cell Titer-Glo assay. Procent levedygtighed dobbeltprøver fra et enkelt forsøg er vist. P-værdien blev bestemt som p = 0,01 ved en t-test. (B) fasekontrast billeder af celler behandlet med 5 pM [Rh (Chrysi) (Phen) (DPE)]

3+ ved 0h og 96h under celleviabilitetstest er vist. (C) Celler blev behandlet med [Rh (Chrysi) (phen) (DPE)]

3+ i 24 timer, og derefter analyseret for kolonidannelse efter 10d. Graferne viser procent overlevelse af dobbeltprøver af sammensatte behandlede celler. P-værdien blev bestemt som p = 0,01 ved en t-test.

Vi undersøgte den cellulære morfologi af NCI-H23 subkloner behandlet med [Rh (Chrysi) (phen) (DPE)]

3+ under tidsforløbet af proliferationsassays under anvendelse fase kontrast billeddannelse. Celler fra de MLH1-dygtige og MLH1-deficiente subkloner optrådte sunde og i vækstfase på det 0h tidspunkt. Ved 96 h, havde de ikke-inducerede MLH1-dygtige celler fortsatte med at proliferere, men færre celler syntes at være under mitose, hvilket antyder en forsinkelse eller tilbageholdelse (figur 4C) cellecyklus. Cellerne syntes ikke at være senescent, som vist ved manglende produktion af SA – gal [26] (data ikke vist). I modsætning er de fleste af de MLH1-deficiente celler enten undlod at proliferere, eller havde undergået celledød ved 96h (figur 4C). Vi verificerede, at denne differentierede virkning skyldtes fravær eller nærvær af MMR i cellerne ved at vurdere MLH1 proteinniveauer i celler behandlet med rhodium metalloinsertor forbindelser (Figur S10). Den tidligere vist effekt af shRNA induktion på MLH1 proteinekspression blev ikke ændret efter behandling med rhodium forbindelser (Figur S10).

Vi bekræftede også den øgede følsomhed af MLH1-mangelfulde NCI-H23 subkloner til rhodium metalloinsertor forbindelser under anvendelse klonogene assays. Efter 24 behandling med [Rh (Chrysi) (phen) (DPE)]

3+, MLH1-deficient NCI-H23 subkloner dannet færre kolonier end de isogene MLH1-dygtige subkloner, der udviser en signifikant forskel i LD

50 værdier (p = 0,01) (figur 4D). Den differentielle følsomhed MLH1-deficiente subkloner til rhodium metalloinsertor forbindelser er konsistent med den hypotese, at disse forbindelser udøver deres virkninger ved binding til DNA mismatches, der findes i MMR-defekte celler.

Diskussion

MMR vej fastholder genom stabilitet ved at fremme anerkendelse og reparation af enkelte basefejlparringer og små indsættelse-deletion sløjfer i DNA, der skyldes replikation fejl eller DNA skader. Tab af funktion af MMR-vejen øger forekomsten af ​​cellulære mutationer og kan forårsage eller bidrage til kræft. Mekanismen for carcinogenese følge af nedarvet MMR-mangel er blevet godt undersøgt, især i colorektal cancer [4,27], og er blevet modelleret i cellelinje systemer såsom HCT-116 O-celler, som er MLH1-manglende, men indeholder en ekstra kopi af kromosom 2 og HCT-116 N-celler, hvori MLH1-mangel er suppleret med en ekstra kopi af kromosom 3, som indeholder vildtype MLH1 [28]. I andre typer kræft, som i lungekræft, kan MMR-mangel fremmes ved kræftfremkaldende eksponering [7-9]. Kemoterapi behandling kan også fremme MMR-mangel fører til sekundær leukæmi [6]. Cellelinjen system, vi beskriver tilvejebringer det første eksempel på en isogen model for induceret MMR-mangel, der kan være reversibelt tændes eller slukkes ved kontrolniveauet af protein-ekspression. Det giver en model til at undersøge spørgsmål om induceret MMR-mangel og tillade identifikation af molekyler, der kan tilbyde terapeutisk fordel i MMR-defekte kræftformer.

NCI-H23 matchede cellelinje her beskrevne system tillader detaljeret karakterisering af timingen og rækkefølgen af ​​begivenheder, der resulterer når MMR-mangel induceres. Vi observerede lignende virkninger med tre forskellige shRNA sekvenser målrettet mod MLH1, og i to forskellige encellede subkloner isoleret fra celler transduceret med et af MLH1 shRNA konstruktioner.