PLoS ONE: DNA Sequence Profiler af kolorektal cancer Kritisk Gene Set KRAS-BRAF-PIK3CA-PTEN-TP53 relateret til alder på Disease Onset

Abstrakt

Forekomsten af ​​kolorektal cancer (CRC) stiger med alderen og tidlig indtræden indikerer en øget sandsynlighed for genetisk disposition for denne sygdom. De somatiske genetik tumor udvikling i relation til patientens alder forbliver det meste ukendt. Vi har undersøgt mutation status fem kendte cancer kritiske gener i forhold til alder på diagnosetidspunktet, og sammenlignet det genomiske kompleksitet af tumorer fra unge patienter uden kendte CRC syndromer med dem fra ældre patienter. Blandt 181 CRC patienter, forskellige niveauer af mikrosatellit ustabilitet status, blev DNA-forandringer sekvens identificeret i

KRAS Hotel (32%),

BRAF Hotel (16%),

PIK3CA

(4 %),

PTEN Hotel (14%) og

TP53 Hotel (51%). Hos patienter yngre end 50 år (n = 45),

PIK3CA

mutationer blev ikke observeret og

TP53

mutationer var hyppigere end i de ældre aldersgrupper. Den samlede genmutation indeks var lavest i tumorer fra de yngste patienter. I modsætning hertil genom kompleksitet, vurderes som kopital aberrationer, var højest i tumorer fra de yngste patienter. Et tilsvarende antal tumorer fra unge ( 50 år) og gamle patienter ( 70 år) var firedobbelt negativ for de fire prædiktive genmarkører (

KRAS-BRAF-PIK3CA-PTEN

); Men 16% af unge mod kun 1% af de gamle patienter havde tumor mutationer i

PTEN /PIK3CA

udelukkende. Dette indebærer, at mutation test for forudsigelse af EGFR behandlingsrespons kan begrænses til

KRAS

BRAF

i ældre ( 70 år) patienter. Forskellige genetiske forskelle, der findes i tumorer fra unge og ældre patienter, som er sammenlignelige for kendte kliniske og patologiske variabler, viser, at unge patienter har en anden genetisk risikoprofil for CRC udvikling end ældre patienter

Henvisning:. Berg M, Danielsen SA, Ahlquist T, Merok MA, Agesen TH, Vatn MH, et al. (2010) DNA Sequence Profiler af kolorektal cancer Kritisk Gene Set

KRAS-BRAF-PIK3CA-PTEN-TP53

Relateret til Alder ved sygdomsdebut. PLoS ONE 5 (11): e13978. doi: 10,1371 /journal.pone.0013978

Redaktør: Kelvin Yuen Kwong Chan, The University of Hong Kong, Kina

Modtaget: Juni 21, 2010; Accepteret: 14 oktober 2010; Udgivet: November 12, 2010

Copyright: © 2010 Berg et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev finansieret af tilskud fra det norske Cancer Society (https://www.kreftforeningen.no/english) RAL (Tilskud nummer 95.068 /RAL, herunder ph.d.-stipendier til SAD, MB og THA, og Post doc tilskud til TA), og tilskud fra den norske Foundation for Sundhed og Rehabilitering (https://www.helseogrehab.no/) gennem EXTRA midler (tilskud nummer HF-52015/002) til ETE De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

forekomsten af ​​kolorektal cancer (CRC, MIM # 114500) er steget i den vestlige verden, herunder Norge i løbet af de sidste 50 år [1]. CRC typisk findes i ældre mennesker med en median alder ved debut af 70 år, og kun omkring fem procent af alle tilfælde er diagnosticeret hos patienter yngre end 50 år. Arvelige syndromer, såsom familiær adenomatøs polypose (FAP, MIM # 175.100) og Lynch syndrom (HNPCC, MIM # 120.435) findes i mindre end fem procent af alle CRCs [2]. Selvom tidlig debut af sygdom generelt er accepteret at være tegn på en potentiel genetisk risiko, er de fleste unge på debut tilfælde betragtes som sporadiske som ingen kendte genetisk disposition er fundet [3]. Kun få undersøgelser har fokuseret på den somatiske tumorudvikling hos unge patienter med ingen kendte arvelige syndromer [4] – [6]

receptortyrosinkinase (RTK) signalering er nødvendig for at opretholde metabolisme, proliferation, overlevelse og motilitet. af en celle [7]. Således er fejl i komponenter er reguleret af receptor (RTK’er) almindeligvis observeret i humane cancere [8], [9]. De onkogener

KRAS Hotel (HGNC: 6407),

BRAF Hotel (HGNC: 1097), og

PIK3CA Hotel (HGNC: 8975) og tumorsuppressorgen

PTEN Hotel (HGNC: 9588). er alle berørt som reaktion på cytokiner, vækstfaktorer og hormoner signalering gennem RTK

Begge

KRAS

BRAF

har vist sig at har aktiverende mutationer i -70% af CRCs [10], hvilket fører til autonom ERK-signalering [11], [12]. Mutationer i komponenter i PI3-kinase pathway er blevet rapporteret som muteret i ~ 40% i CRC [13], og analyser af den genomiske landskab af CRC tumorer har vist PI3K vej at blive påvirket i en statistisk signifikant måde [14]. I to af disse komponenter,

PTEN

PIK3CA

, mutationer resulterer i konstitutiv aktivering af PI3K pathway ved ophobning af phosphatidylinositol (3,4,5) trifosfat (PIP

3) , som derefter katalyserer phosphoryleringen af ​​AKT. Den aktiverede serin-threonin-kinase AKT regulerer en lang række målproteiner er involveret i en række nedstrøms signalveje [15]. Blandt AKTs downstream mål er tumorsuppressorgen

TP53 Hotel (HGNC: 11998), en transskription faktor, der integrerer information fra mange forskellige typer af cellulær stress, og udføre downstream reaktioner passende for den givne input [16].

TP53

er fundet muteret i omkring halvdelen af ​​alle kolorektale karcinomer [17]

MSI status i den primære tumor har prognostisk betydning i CRC patienter [18] -. [20].

KRAS

TP53

status er forbundet med kliniske endepunkter, den tidligere kun med svag sammenhæng i større serier og kun sidstnævnte, hvis undergrupper af mutationer betragtes [21] – [23] . For nylig har en undersøgelse vist, at

PIK3CA

mutationer kan bære prognostisk information i tumor trin I-III [24]. Denne type oplysninger er ikke blevet offentliggjort for

PTEN

mutationer.

metastatisk sygdom behandling rettet mod EGFR viser sig at være effektiv, hvis

KRAS

BRAF

er ikke muteret [25]. Men selv blandt patienter med vildtype

KRAS

BRAF

ikke alle reagerer på denne behandling [26,26]. På det seneste er det blevet foreslået, at dette kan skyldes mutationer i

PIK3CA

PTEN

, dvs. kun firedobbelt mutation negative tumorer vil reagere på behandlingen [26] – [29].

i den foreliggende undersøgelse har vi sammenlignet DNA sekvensen mutation status generne

KRAS

,

BRAF

,

PIK3CA, PTEN

, og

TP53

i tumor prøver fra patienter yngre end 50 år på diagnose og uden kendte arvelige syndromer, og stratificeret efter MSI status og ældre CRC patienter.

Resultater

klinisk-patologisk data for hele serien (n = 181), opdelt i tre aldersgrupper, er præsenteret i tabel 1.

mikrosatelitter instability- og genmutation status

MSI- og mutation-frekvenserne af den analyserede gener er vist i tabel 1, og et zonekort repræsenterer mutation data for alle prøver er vist i figur 1. i den samlede serie, blev MSI findes i 18% af prøverne, der spænder fra 13% i 50 årige til 20% i 70 aldersgruppe. MSI var signifikant associeret med lokaliseret sygdom, tabel S1. Generne blev muteret inden for det forventede område af frekvenser. Mutationsfrekvenser for hvert gen uafhængigt, og hyppighed for kombinationer af mutationer i generne testede, var ligeligt fordelt mellem alle faser. Forskelle tilskrives alder ved debut er påpeget nedenfor.

Fordeling af mutationer i genet sæt

KRAS-BRAF-PIK3CA-PTEN-TP53

, og MSI-status inden for hver aldersgruppe. Farvekodning: mørk blå = MSI, lyseblå = MSS, rød = mutation, grøn = vildtype, hvid = ikke påvist

I alt ni forskellige mutationer blev observeret i

KRAS

, som påvirker kodoner 12, 13 og 61. Tyve-otte tumorer havde

BRAF

V600E forandring. Otte

PIK3CA

mutationer blev identificeret i exon ni og tyve. Fjorten og femten tumorer havde

PTEN

mutationer og sletninger, hhv. Ninety-tre tumorer havde

TP53

mutationer. Nærmere oplysninger om alle mutationer observerede, kan findes i tabel S2.

Sammenligning af aldersgrupper

Forholdet mellem de kliniske og mutationsmønstre parametre inden for hver aldersgruppe er angivet i tabel S1. For alle aldersgrupper, MSI-tumorer var oftest til stede i højresidig tumor lokalisering. I den ældste patientgruppe MSI og

BRAF

mutationer var statistisk signifikant korreleret (

P

0,001). Ingen sådan korrelation blev fundet i 50 aldersgruppe. MSI tumorer i 50 årige, den 51-70 årige og 70 årige havde 17%, 54% og 79%

BRAF

mutationer, henholdsvis (

P

= 0,04). Desuden blandt de seks MSI tumorer i. 50 gruppe kun halvdelen af ​​prøverne udført mutationer i generne analyseret, mens blandt MSI tumorer i de to andre aldersgrupper, viste alle prøver en eller flere mutationer

KRAS

mutationer blev fundet i 57 (32%) tumorer i den samlede serie. De mutationsfrekvenser var lidt forskellige mellem de aldersgrupper, tabel 1. De fleste af mutationerne blev fundet i kodoner 12 (68%) og 13 (28%) uafhængig af aldersgruppe. De codon 61 mutationer blev kun fundet i prøver fra . 70 årige

KRAS

BRAF

mutationer var gensidigt udelukkende i den samlede serie. Hyppigheden af ​​tumor mutationer i enten

KRAS

eller

BRAF

steget med patientens alder, både når man sammenligner aldersgrupper og med alderen som en kontinuerlig variabel.

Overraskende ingen af de tumorer i 50 årige havde

PIK3CA

mutationer, mens fem (7%) og tre (4%) blev fundet i 51-70 gruppen og . 70 gruppe, henholdsvis

Eighteen

PTEN

mutationer blev identificeret i syv af ni exons (ingen mutationer blev fundet i exon 4 og 9). De mutationer blev observeret i alle aldersgrupper, som det var tilfældet for

PTEN

sletninger. Sletninger opdaget af MLPA blev fundet i otte procent af prøverne i alt, og sameksistensen af ​​sletning og ændringer detekteres ved sekventering blev fundet i tre tumorer. Samlet set 14% af tumorerne havde tegn på svækket

PTEN

funktion. Hyppigheden af ​​

PTEN

afvigelser viste ingen statistisk signifikant forskel mellem aldersgrupperne; 18%, 10% og 16% i 50 gruppe, 51-70 gruppe og . 70 gruppe, henholdsvis

Antallet af

TP53

muterede tumorer forskelligt for de tre aldersgrupper (

P

= 0,02). Denne forskel var også signifikant, når man analyserer kun MSS tumorer (

P =

0,03). Mutationer var mest fremtrædende i DNA-bindende domæne, kodet af exon 5-8, og kun omkring fem procent af de mutationer blev observeret i exon 4 og exon 11. Desuden er der i 50 årige,

TP53

mutationer og MSI var gensidigt udelukkende, og omvendt korreleret i 51-70 og . 70 grupper, henholdsvis

genom kompleksitet og sekvens mutationer

for en delmængde af prøverne (n = 41) en høj opløsning datasæt af kopital ændringer opnået ved opstilling sammenlignende genom hybridisering data (aCGH) var tilgængelige (Roche NimbleGen, 385 000 oligo-probe array) [30]. Som tidligere offentliggjort [30], fandt vi 50 gruppe at have et betydeligt større antal aberrationer end 70 gruppe, selvom den samlede del af genomet med aberrationer var ens i de to grupper, tabel 2. En forskel i kompleksitet blev også fundet på genniveau, vurderet som mutation indeks: i ældre gruppe hver patient havde 1,5 mutationer i gennemsnit sammenlignet med 1,0 i den yngre aldersgruppe. Fordelingen af ​​tumor stadier var noget skæv mellem de to grupper. Men hverken den procentdel af genomiske afvigelser, eller antallet af mutationer afveg blandt tumor etaper.

Kliniske foreninger

Ingen forskel i overlevelse blev fundet sammenligne aldersgrupper, selv når du justerer for tumor scenen på diagnose. Der var en tendens til, at andelen af ​​rektal tumorer faldt med stigende alder (

P

= 0,08), og de yngre patienter tendens til at have en mere avanceret tumor stadie end ældre patienter. Forekomsten af ​​stadie III-IV tumorer var 54%, 46% og 36% i 50, 51-70 og . 70 grupper, henholdsvis

I det samlede prøvesæt, tumor etape var den mest magtfulde prognostisk variabel med hensyn til tre år samlet overlevelse, (

P

0,001). I univariat analyse, patienter med

TP53

muterede tumorer havde dårligere overlevelsesrater end patienter med vildtype

TP53

, 938 ± 31 dage vs. 1016 ± 23 dage (

P

= 0,04), hhv. Men denne forskel var ikke signifikant, når der korrigeres for tumor fase.

TP53

mutationer var af højere prognostisk betydning i højresidig tumorer, 1051 ± 26 dage vs. 883 ± 65 dage for vildtype og muterede

TP53

henholdsvis (

P

= 0,005).

Blandt patienter i den yngste aldersgruppe, dem med

KRAS

mutation havde signifikant kortere overlevelse end patienter med

KRAS

vildtype prøver, 841 ± 101 dage vs. 1033 ± 35 dage (

P

= 0,02), hhv. Ingen af ​​de andre mutations parametre viste nogen statistisk signifikant forskel med hensyn til overlevelse, hverken inden eller mellem aldersgrupper.

Discussion

Vi fandt, at mutationen status af en kendt cancer gensæt varierer i CRC patienter afhængig af alder ved debut af sygdom, og giver yderligere beviser på forskelle i den somatiske udvikling af tumorer hos unge og ældre patienter.

mikrosatelitter ustabilitet status

i alle aldersgrupper, MSI var statistisk signifikant associeret med højresidig tumorer, som forventet [18], [18], [31,32]. Hyppigheden af ​​MSI i denne serie var noget højere end rapporteret andetsteds [33], [34], som er bedst forklares ved en tilfældig overskud af højre-sidet tumorer i den samlede serie. Men for den gruppe af patienter under 50 år på diagnose den observerede frekvens var, lidt lavere end forventet [33], hvilket til dels kan forklares med udelukkelse af patienter med kendte CRC syndromer i denne undersøgelse.

I patienter yngre end 50 år kun 50% af de MSI prøverne blev muteret i en eller flere af de analyserede gener, mens der i patienter over 50 alle MSI prøver viste genændringer. Derudover

BRAF

mutationer var ikke statistisk signifikant associeret med MSI i 50 år gruppe, i modsætning til hvad der var forventet [35]. Mutationen i

BRAF

V600E observeres at fremkalde nedregulering af essentielle DNA reparation gener [36], med potentiale til at inducere MSI i cellen, forklarer denne sammenhæng. Som

BRAF

mutationer ikke observeret i tumorer fra patienter med Lynch-syndrom [37], kan vi ikke udelukke, at MSI /

BRAF

vildtype-prøver i denne serie er fra klinisk uopdaget Lynch-syndrom patienter.

Genmutationer

mutationer frekvenser i

KRAS, BRAF, PIK3CA, PTEN

, og

TP53

viste sig at være inden for tidligere rapporteret interval støtte repræsentativiteten af ​​serien [38].

sameksistens af

BRAF

KRAS

mutationer formodes at være uforenelig med spredning og dermed en negativ selektion til samtidig eksistens begge mutationer [12]. Vi gjorde bekræfte en omvendt korrelation mellem mutationer i disse to gener [39]. Desuden et stigende antal tumorer med enten

KRAS eller BRAF

mutation blev observeret med stigende alder, efter aftale med en nylig rapport om unge patienter med kolorektal cancer [6].

I samlede serie, tumorer viser

BRAF

V600E blev typisk

TP53

vildtype og

PTEN

muteret (tabel S1), som også var tilfældet for tumorer i 70 aldersgruppe. Således er “

BRAF

V600E,

TP53

vægt,

PTEN

mut” kan betragtes som en funktion af ægte sporadiske tumorer.

i forhold til den rapporterede 14% frekvens af

PIK3CA

mutationer i kolorektale karcinomer i COSMIC database [38], den nuværende serie viser kun 4% mutationer. Dette kan til dels forklares ved, at den nuværende serie er beriget med prøver fra unge patienter, og deres tumorer havde ikke

PIK3CA

mutationer. Men sidstnævnte observation er i modsætning til to tidligere undersøgelser [6], [40], der rapporterer to /ene patienter yngre end 50 år med

PIK3CA

mutationer. De forskellige metoder, der anvendes, prøvetype, formalinfikserede eller frisk frosset væv, og størrelsen af ​​serien kan delvis forklare denne forskel i mutationshyppighed blandt undersøgelserne. Mutation i enten onkogenet

PIK3CA

eller tumorsuppressorgen

PTEN

kan føre til en ophobning af PIP

3, og nedstrøms AKT aktivering. Men da en sekvens ændring i

PTEN

indebære en resterende vildtype allel, yderligere aktiverende mutation i den samme pathway kan være gavnligt for tumorcellerne [41]. Vi fandt 32 tumorer med ændring (er) i hver af

PIK3CA

og /eller

PTEN

, herunder syv tumorer med flere

PTEN

aberrationer. Hele den kodende sekvens af

PTEN

er blevet undersøgt [42] – [48], men ingen af ​​de undersøgelser har man undersøgt tumorer fra unge patienter specifikt. Til vores viden dette er den første rapport kombinerer

PTEN

hele kodning sekvensdata med brutto sletning mønster i CRC fra forskellige aldersgrupper.

TP53

mutationshyppighed var signifikant højere i 50 årige, end i de andre aldersgrupper, som er bedst forklares med den højere frekvens af venstre sidede og rektal kræftformer i 50 aldersgruppe. Som forventet,

TP53

mutationer var forbundet med MSS tumorer, og den betydelige forskel mellem aldersgrupperne var stadig gyldige, når man analyserer kun MSS tumorer.

En mutation indeks blev beregnet og tumorer fra ældre patienter fandtes at have akkumuleret flere gen sekvens ændringer end dem fra unge patienter (1,5 vs. 1,0), der kunne indikere en tidsforskel i tumor udvikling.

Distinct genetiske sammensætning af tumorer fra unge og ældre patienter

fra aCGH data på en delmængde af 41 prøver, bemærkede vi, at patienter under 50 år havde signifikant flere afvigelser i deres tumorer end patienter 70 år gjorde,

dvs

. en højere grad af genomisk kompleksitet. Tværtimod, som nævnt ovenfor, tumorerne fra ældre patienter havde den højeste genmutation indeks, selv om denne gruppe omfattede færre fremskredne stadier. Tilsammen kan man spekulere i, at blandt de unge patienter der er bærere med genetisk disposition påvirker gener, der koder for proteiner, der sikrer korrekt kromosom adskillelse under mitose, snarere end specifikke veje.

Bardelli

et al.

[29] rapporterede, at patienter med metastatisk sygdom, der er “firdobbelt negativ” i

KRAS-BRAF-PIK3CA-PTEN

gensæt har den højeste sandsynlighed for respons på anti-EGFR terapier. Men i øjeblikket kun

KRAS

test anbefales før beslutning med hensyn til en sådan behandling, og

BRAF

test er valgfrit [49].

I den nuværende serie af primær kræftformer, mutation frekvenser i disse fire gener var ligeligt fordelt mellem alle tumor stadier. Derfor har vi, i det følgende hypotese antallet af potentielle respondenter baseret på hele datasæt (figur 2). Når man overvejer tumorer med svækket

PTEN

og /eller muteret

PIK3CA

udelukkende, den yngste aldersgruppe, der vises 16% (n = 7) mutationer, sammenlignet med 1,4% (n = 1) i ældste aldersgruppe. Dette indebærer, at for ældre patienter,

KRAS

og

BRAF

mutation status alene vil afsløre 98% af de patienter, der er uanvendelige til anti-EGFR-behandling, sammenlignet med 71% hos patienter 50 år . Virkningen af ​​mutationer i

PIK3CA

PTEN

drøftes med hensyn til anti-EGFR-behandling [26], [28], [29]. Uanset, hvis deres mutationsstatus ikke påvirker på effekten af ​​anti-EGFR behandling, forventes de yngre patienter at have en endnu større del af de potentielle respondenter til denne type behandling end de ældre patienter (figur 2).

Procent-wise fordeling af afvigelser for

KRAS

,

BRAF

,

PIK3CA

og

PTEN

og deres kombinationer, i 50 aldersgruppe og 70 aldersgruppe. Patienter negative for alle mutationer (firdobbelt negative) er potentielle respondenter til anti-EGFR-terapi. (Modificeret fra Bardelli

et al.

[

29

])

Foreningen til kliniske data

fortløbende prøve serie kolorektale karcinomer fra et enkelt hospital viste overordnede fordeling af klinisk-patologiske data som forventet for en norsk kohorte [1]. Andelen af ​​rektal kræft faldt med stigende alder ved debut, mens den modsatte tendens blev set til højresidig tumorer, som rapporteret af andre [50], [51]. Endvidere er en større del af patienter diagnosticeret før alder 50 år havde mere fremskreden sygdom stadium i forhold til de ældre aldersgrupper. Dette kan afspejle, at CRC er uventet i unge voksne og symptomer forsømmes både patienten og lægen [52]. Rapporter af unge patienter med tarmkræft adskiller med hensyn til aggressivitet af sygdommen, og dermed resultatet [3], [52], [53]. Men i den foreliggende undersøgelse, den treårige samlede overlevelse var ens i de tre aldersgrupper, selv når der korrigeres for tumor fase. Dette kunne tyde på en mere aggressiv sygdom hos unge patienter, som ældre mennesker forventes at have en højere dødelighed. Endvidere observerede højere grad af genomisk kompleksitet i tumorer fra unge versus ældre patienter også kan være tegn på en forskel i aggressivitet. Det skal bemærkes, at de unge patienter inkluderet er ikke bærere af kendte kolorektal cancer syndromer efter kun kliniske kriterier.

Den prognostiske og prædiktive værdi af

TP53

er stadig kontroversiel [54]. I vores datasæt patienter med

TP53

mutationer havde signifikant kortere overlevelse end patienter vildtype. Desuden for patienter med højre-sidet eller MSI tumorer,

TP53

mutationer viste endnu større prognostisk værdi, i overensstemmelse med resultater rapporteret af

TP53

-CRC kollaborativ studiegruppe [55].

i en nylig undersøgelse,

PIK3CA

mutationer viste sig at tjene som surrogatmarkører for dårlig overlevelse i kolorektal cancer patienter [24]. Som nogle

blev observeret PIK3CA

mutationer i vores prøvesæt, kunne vi ikke bekræfte disse resultater. Blev imidlertid mutationer kun findes i prøver fra patienter ældre, og var ikke til stede hos patienter med spredte metastaser, og kun få i stadium III patienter. Således er vores data tyder på, at

PIK3CA

mutationer er vigtige for tumorigenese blandt ældre patienter, men ikke tjene som en markør for evnen til at metastaserer.

Konklusion

Vi har fundet tydelige forskelle i den genetiske sammensætning af karcinomer fra unge og ældre patienter. De tumorer fra unge patienter, som ikke er bærere af kendte arvelige CRC syndromer har færre genmutationer, men flere kopi nummer aberration i hele genomet. Disse data tyder på, at nogle unge patienter kan have en potentiel øget risiko for kræft forårsaget af ændringer i gen (er) er involveret i at opretholde korrekt kromosom adskillelse.

Materialer og metoder

Etik erklæring

skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle fag indgår. Forskningen biobanker er registreret i henhold til national lovgivning, og forskningsundersøgelser er godkendt af det regionale udvalg for Medical Research Ethics (REK sydøstlige: 1.2005.1629, REK Syd, 2003: S-02.126)

Patienter. og tumorprøver

i alt 181 patienter blev inkluderet i undersøgelsen,

dvs

en fortløbende serie af 132 patienter beriget med en serie af 49 patienter med sygdom i ung alder ( 50 år ). Hver serie er beskrevet i de følgende afsnit. Kliniske data blev indsamlet prospektivt. Død data blev hentet fra enten hospital optegnelser eller fra det norske folkeregister. De kliniske og patologiske data fra disse to serier er vist i tabel S3.

Fortløbende serie (n = 132).

Patienter, der gennemgår elektiv resektion af kolorektal adenocarcinom i 2005-2007 ved Oslo Universitetssygehus , Aker, Oslo, blev inkluderet. Patienter med FAP- eller Lynch-syndrom, blev udelukket baseret på kliniske kriterier. Tumorvæv blev udtaget umiddelbart efter resektion af prøven og øjeblikkeligt frosset i flydende nitrogen. Alle vævsprøver blev evalueret af en patolog til at etablere differentiering kvalitet af indholdet celle karcinom og tumor.

Tidlig debut serie (n = 49).

Prøver fra en biobank fra en multi-hospital undersøgelse (INFAC-studie – personer med familiær risiko for kræft), herunder Oslo Universitetssygehus, Aker, Oslo og fem andre hospitaler i samme geografiske område af Norge tilmeldt 2003-2008, blev inkluderet i denne undersøgelse. Inklusionskriterierne i INFAC-undersøgelsen var alder 55 år, med undtagelse af dem, der opfyldte kriterierne for alle kendte CRC syndromer. Tumorvæv og tilsvarende normale mucosa prøver blev taget fra resektion modellen i operationen teater og straks inkuberes i RNAlater. Vævet blev overført til nye rør efter 36-72 timer og opbevaret ved minus 80 ° C indtil anvendelse. DNA fra normale og cancerøse væv blev ekstraheret og anvendt til analyse.

Prøver inkluderet i CGH-analyse.

For en delmængde af patienterne (n = 41) data fra aCGH analyser var tilgængelige. Denne undergruppe omfattede 24 patienter yngre end 50 år, og 17 er ældre end 70 år på primær diagnose. Kliniske og mutationsmønstre data for disse patienter er vist i tabel S2.

Gruppering af patienter i henhold til alder.

Patienter fra den tidlige debut serien blev inkluderet for at berige antallet af tidlig debut patienter i samlede stikprøve sæt. Patienter fra den tidlige debut serien blev udvalgt til at matche patienter yngre end 55 år i træk serier med hensyn til køn, median alder, tumor scenen og lokalisering, tabel S3. Derefter blev prøver fra de to serier kombineret og opdelt i tre aldersgrupper; under alder 50 år, 51 gennem 70 år og over 70 år, der omtales som 50, 51-70 og 70, hhv. Den gennemsnitlige alder ved primær diagnose var 70 år i træk serier, og der blev valgt som cutoff for den ældste aldersgruppe. Cutoff for den yngste aldersgruppe blev fastsat til 50 år, da tidlig debut kan skyldes arvelige genetiske faktorer, og kun ~ 5% af alle CRC er diagnosticeret før 50 år. Tumorer i tyktarmen proximalt til milt bøjning blev defineret som højresidig: dem i de resterende colon blev betragtet som venstre-sidet henviser rektum blev defineret som 15 cm fra den anale randen, når den måles med et stift proctoskop. Lokaliseret sygdom blev defineret for UICC /AJCC fase I og II og regional sygdom for trin III og IV.

mikrosatelitter ustabilitet analyse

For alle patienter, tumor og tilsvarende normale væv eller blod blev analyseret ved hjælp af de Bethesda markører [56]. Analysen blev udført som beskrevet af Wu

et al.

[57]. Høj grad af i tumor-DNA mikrosatellit instabilitet (MSI-H), sammenlignet med tilsvarende normale DNA, blev defineret hvis to eller flere markører udviste afvigende peak profil efter fragmentanalyse. Hvis både normale prøve, og tumoren prøve fra en patient udviste det samme mønster for alle markører, blev tumoren betragtet mikrosatellit stabil (MSS).

Mutation analyse for KRAS, BRAF, PIK3CA, PTEN og TP53

for

BRAF

KRAS

, aktiverende mutationer i positionerne kendt for ofte bære ændringer rapporteres [11], [58]. I

PIK3CA

genmutationer i tarmkræft klynge i exon 9 og 20 [59], og for

TP53

PTEN

mutationer er rapporteret i hele kodende sekvens [ ,,,0],17], [60].

for

TP53

PTEN

, den samlede kodende sekvens blev opformeret i multiplex PCR reaktioner, ved hjælp af multiplex-PCR-kit som anbefalet af sælgeren (QIAGEN, GmbH, Hilden, Tyskland) [30], [60]. Singleplex PCR-reaktioner ved hjælp Hotstar Taq (QIAGEN) blev anvendt til at forstærke

PIK3CA

,

KRAS

og

BRAF

amplikoner [10], [59], [61]. I

PIK3CA

exon 9 og 20 blev opformeret i

KRAS

, exon 2 og 3, herunder ofte muterede codon 12, 13 og 61, og

BRAF

exon 15, herunder mutationen i codon 600, blev amplificeret. Primere, der kører vilkår og fragment detaljer er beskrevet i tabel S4.

PCR produkter blev oprenset under anvendelse af Sephadex søjler (Millipore, Billerica, MA, USA og GE Healthcare, Chalfont St.Giles, UK) forud for inkorporering af farvestof mærket ddNTP’er og sekventering på 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) [30]. I tilfælde, hvor der blev konstateret en mutation blev en ny uafhængig PCR-produkt udsat for sekventering for at bekræfte resultatet.

Multiplex ligation-afhængig sonde forstærkning (MLPA) af PTEN

Salsa MLPA kit P225- B2 PTEN (MRC Holland, Amsterdam, Holland) blev anvendt i henhold til vejledningen fra forhandleren. I alt 25 prober dækker

PTEN

gen, mindst to prober for hver af de ni exoner. Også 10 sonder andre steder på kromosom 10, og yderligere 12 referencepunkter sonder på andre kromosomer fungerer som kontroller. Amplificerede fragmenter blev analyseret på en 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems). Rå data blev analyseret med Coffalyzer® (MRC Holland) med standardindstillinger. Cutoffs på 1,2 og 0,8 blev brugt til scoring af gevinster og tab, henholdsvis foruden individuel vurdering af plottet fra hver prøve. Denne scoring bestemmes efter følgende beregning: én kopi gevinst eller tab i 60% af cellerne i en triploid tumor er lig 1,2 og 0,8 hhv. Mindst to tilstødende sonder, der ligger i samme exon, med samtidig gevinst eller tab, var begrænset til at tildele afvigende kopi nummer i en region.

statistiske analyser

Kliniske variable blev testet for foreninger med mutationsændringer resultater for alle gener analyseret, og alle gener blev testet for inter-relationelle sammenslutninger. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af softwarepakken PASW 17,0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Fishers eksakte test blev anvendt til krydstabulerede variabler.