PLoS ONE: Integreret Multidimensional Analyse er nødvendig for nøjagtig Prognostisk Biomarkører i kolorektal cancer

Abstrakte

CRC kræft er en af ​​de dødeligste sygdomme i de vestlige lande. For at udvikle prognostiske biomarkører for CRC (kolorektal cancer) aggressivitet, vi analyserede retrospektivt 267 CRC patienter via en roman, flerdimensional biomarkør platform. Brug nanofluidic teknologi til qPCR analyse og kvantitativ fluorescerende immunhistokemi for protein analyse, vi vurderede 33 microRNA, 124 mRNA og 9 protein antigener. Analyse blev gennemført i hver enkelt dimension (microRNA, gen eller protein) ved hjælp af både den multivariate Cox modellen og Kaplan-Meier-metoden. Derefter forenklet vi de censurerede overlevelsesdata i binære respons data (aggressiv vs. ikke aggressiv kræft). Efterfølgende integreret vi data til en diagnostisk score ved hjælp skiver omvendt regression for tilstrækkelig reduktion dimension. Nøjagtighed blev vurderet ved anvendelse areal under Receiver Operating karakteristiske kurve (AUC). Enkelt dimension analyse førte til opdagelsen af ​​individuelle faktorer, der var signifikante prædiktorer for udfaldet. Disse omfattede syv specifikke microRNA, fire gener, og en protein. Når disse faktorer blev kvantificeret individuelt som prædiktorer for aggressiv sygdom, den højeste påviselige areal under kurven (AUC) var 0,68. Derimod når alle resultater fra enkelte dimensioner blev kombineret i integrerede biomarkører, AUC blev dramatisk forøget med værdier nærmer sig, og endda over 0,9. Enkelt dimension analyse genererer statistisk signifikante prædiktorer, men deres prædiktive styrker er suboptimal til klinisk anvendelighed. En roman, multidimensional integreret tilgang overvinder disse mangler. Nyligt afledte integrerede biomarkører har potentiale til meningsfuldt styre udvælgelsen af ​​terapeutiske strategier for de enkelte patienter, mens belyse molekylære mekanismer kørsel sygdomsprogression

Henvisning:. Mariani M, S han, McHugh M, Andreoli M, Pandya D, Sieber S, et al. (2014) Integreret Multidimensional Analyse er nødvendig for Nøjagtige Prognostiske Biomarkører i kolorektal cancer. PLoS ONE 9 (7): e101065. doi: 10,1371 /journal.pone.0101065

Redaktør: John Souglakos, University Hospital of Heraklion og Laboratoriet for Tumor Cell Biology, School of Medicine, University of Crete, Grækenland

Modtaget: April 15, 2014; Accepteret: 3 juni 2014; Udgivet: 2 juli 2014

Copyright: © 2014 Mariani et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist støttet af en bevilling fra Ruth C. Donovan Cancer Research Program og en liberal donation fra Mr. og Mrs. Ruggles . De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

CRC er en af ​​de dødeligste sygdomme på verdensplan. Kaukasiske patienter med lokal, regional eller metastatisk sygdom udviser en 5-års overlevelse på 66%, 44% og 4%, henholdsvis [1]. Sygdomsstadium på tidspunktet for kirurgi er veletableret som den vigtigste prognostiske faktor i CRC. I de sidste to årtier har mediane overlevelse steget betydeligt med indførelsen af ​​nye cytostatika og biologiske behandlinger. Reaktionen på sådanne behandlinger afhænger af molekylære determinanter hvis udredning har været i fokus for intense og produktive forskningsindsats. Vi ved nu, for eksempel, at kræft huser aktiverende KRAS mutationer ikke reagerer på anti-EGFR-behandling [2]. Men målet at optimere behandlingsprotokoller baseret på de unikke molekylære karakteristika af en persons tumor stadig undvigende. Udvikling af nye biomarkører, der pålideligt kan identificere patienter med høj risiko for sygdomsprogression og død ville være særligt nyttig til at bestemme de kliniske omstændigheder, hvor adjuverende kemoterapi er berettiget. Ud fra følgende betragtninger brugen af ​​antimetabolit 5-fluorouracil (5FU) er standardbehandling for patienter med stadium III CRC, dens potentielle fordele i forhold til risici i stadie II CRC patienter er et spørgsmål om kontroverser og debat [3]. I mangel af en robust klinisk indikator for udfaldet sygdom, at beslutningen om at behandle eller ikke at behandle stadie II patienter med 5FU kan ikke hvile på objektive og faste kriterier. Tidligere identificerede prædiktive biomarkører, der havde vist stor løfte i denne arena, herunder telomerase, transformerende vækstfaktorer (TGFa og TGFp), epidermal vækstfaktor (erbB2 og ErbB3) og mucin (MUC1 og MUC2) har skuffet i studier af klinisk anvendelighed [4].

Den traditionelle tilgang til biomarkør udvikling forudsætter enkelt dimensionelle (microRNA, gen eller protein) analyse i et forsøg på at knytte en enkelt molekylær enhed til tumor adfærd. Denne metode synes at have nået et højdepunkt, der er suboptimal for klinisk beslutningstagning. Tidligere flerdimensionale tilgange har vist, at gennem en kombination af biomarkører, der kommer fra forskellige dimensioner et bedre kendskab til biologi CRC kan opnås [5], [6], [7]. I et forsøg på at give mere personlige muligheder, vi udviklet en ny metode, der yderligere fremmer integrationen og inkorporerer flere molekylære enheder fra alle tre molekylære dimensioner (microRNA, gener og protein) samtidigt for at generere nøjagtige prædiktorer for udfaldet hos patienter med CRC. Vores resultater viser tydeligt overlegenhed denne roman, flerdimensional tilgang i forhold til de traditionelle værktøjer enkelt dimension analyse. Vi håber, at nyopdagede flerdimensionelle biomarkører vil danne grundlag for en vellykket triage og lagdeling af patienterne i prospektive kliniske undersøgelser samtidig afsløre molekylære agenter og veje spille fremtrædende skumle roller i CRC sygdomsprogression.

Materialer og metoder

Gene og mikro-RNA-ekspression vurderes nanofluidic teknologi

En klinisk kohorte af 267 patienter tyktarmskræft blev analyseret i denne retrospektive undersøgelse. Efter godkendelse af Danbury Hospital Intern Review Board (DHIRB) og indsamling af de relevante kliniske oplysninger blev FFPE prøver fra tyktarmskræft sager, der var blevet bevaret mellem 2000 og 2008. Ifølge protokollen af ​​undersøgelsen (DH-17/12 ) herunder fuld de-identifikation af patientoplysninger, DHIRB afkald behovet for informeret samtykke. FFPE prøver blev skåret til 10 um tykkelse og to vævssnit blev bragt i en 1,5 ml rør. Til hvert rør blev en milliliter af xylen tilsat for afparaffinering efterfulgt af blanding to gange med en høj hastighed vortex i 3 min ved stuetemperatur. Totalt RNA blev derefter automatisk ekstraheret med QIAcube hjælp af miRNeasy FFPE (Qiagen, Valencia, CA) efter fabrikantens protokol. RNA fra SW837-celler blev automatisk ekstraheret med QIAcube hjælp af miRNeasy (Qiagen, Valencia, CA) efter fabrikantens protokol. RNA kvantiteten og kvaliteten blev vurderet af Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Analyse blev udført under anvendelse af 48,48 dynamisk array (Fluidigm Corporation, CA, USA) og en Biomark platform efter fabrikantens protokol som beskrevet tidligere [8], [9].

Kvantitativ fluorescerende immunhistokemi

Kvantitativ fluorescerende immunohistokemi udførtes til proteinanalyse. Vævsprøver blev fremstillet i en Tissue Micro Array (TMA) format: repræsentative tumorområder blev opnået fra formalinfikseret paraffinindlejret (FFPE) enheder af den primære tumor, og op til tre repræsentative replikere 3 mm kerner fra flere tumorblokke blev taget efter gennemgå og mærkning af hematoxylin og eosin farvede lysbilleder ved bord-certificeret patologer (SS og PF). I alt blev 630 kerner taget og fordelt over 16 slides fra 267 patienter. FFPE væv, der anvendes som kontroller for reaktionen omfattede normal colon, nyre, lever, hjerne, bryst, lymfeknuder, skjoldbruskkirtel, hud, tonsil, skeletmuskulatur og blære sammen med brystcancer og ikke-småcellet lungekræft.

TMA-objektglas blev afparaffiniseret i xylen og derefter rehydreret i sekventielt fortyndet ethanolopløsninger. Antigen genfinding blev udført ved opvarmning af objektglassene i en damper i 30 minutter i en opløsning af Tris-EDTA, pH 8,0. Endogen peroxidaseaktivitet blev blokeret ved behandling af objektglassene i Peroxidazed reagens (Biocare Medicinsk, Concord, CA) i 5 minutter. Ikke-specifik binding blev reduceret ved inkubation med Baggrund Sniper (Biocare Medical, Concord, CA) i 10 minutter. Objektglas blev inkuberet med det primære mål antistoffer og epitel- og stromale celle maske antistoffer fortyndet i Da Vinci Green antistoffortynder (Biocare Medical, Concord, CA) i 1 time ved stuetemperatur. Nærmere oplysninger om alle anvendte antistoffer er i tabel S1. Cyanin 5 (Cy5) direkte konjugeret til tyramid (Perkin-Elmer, Boston, MA) ved 1:50 fortynding blev anvendt som fluorescerende detektion for alle de mål-antigener.

Statistical Analysis

I enkelt dimension analyse blev samlet overlevelse beregnet fra datoen for diagnosen til datoen for død eller dato sidst set. Medianer og liv tabeller blev beregnet ved hjælp af produktet-limit estimat af Kaplan og Meier-metoden, og Log Rank test blev anvendt alene at vurdere den statistiske signifikans. Multivariat analyse vurderede den kliniske rolle hver faktor matches med andre kliniske variable (alder, scene, sortering, type svulst, og køn), efter Cox proportional hazard model. For at forenkle problemet censurere, fjerner vi de patienter, der blev censureret inden for 3 år og transformerede overlevelsesdata til binær respons, enten aggressiv eller ikke aggressiv. For hver faktor vist sig at være signifikant i multivariat analyse (p-værdi 0,05)., Arealet under kurven (AUC) i modtageren operating characteristic (ROC) kurve blev anvendt til at vurdere diskriminerende magt

I flerdimensional analyse, datasættet blev tilfældigt opdelt i uddannelse og afprøvning delmængder, med 125 tilfælde i hver delmængde. Multiple biomarkører blev kombineret til opnåelse af et diagnostisk score, der blev anvendt som en indikator for resultatet. For at generere score, vi først brugt skiver omvendt regression [10], [11] for at gøre den tilstrækkelig dimension reduktion hvorved ingen oplysninger om den betingede fordeling af resultatet blev tabt under reduktionen dimension. Dernæst blev en skalar diagnostisk score beregnet ud fra de lavere dimensionelle data genereret i det første trin af likelihood ratio statistik, der har vist sig at være optimal blandt alle mulige funktioner af flere markører for binære sygdom resultater [12]. Denne fremgangsmåde aktiveret udnyttelse af oplysninger fra flere markører samtidigt uden at det er nødvendigt at gøre antagelser om fordelingerne af markørerne. Cox og Kaplan-Meier modeller blev anvendt til at vurdere den statistiske signifikans af flerdimensionale biomarkører i multivariat analyse, som beskrevet ovenfor.

Resultater

Expression Analyse af microRNA

De vigtigste kliniske parametre af de 267 CRC patienter, der deltog i denne retrospektive analyse er illustreret i tabel 1. Alle prøver blev indsamlet på den første operation før nogen behandling. Som forventet er den vigtigste kliniske faktor til at forudsige resultatet var det stadium af sygdommen. For patienter med stadium IV progressionen var hurtig med en median overlevelse på 11 måneder, mens den for patienter på tidligere stadier resultatet var bedre (fig. 1). Alle patienter blev derefter behandlet med den bedste tilgængelige pleje og denne undersøgelse vil fokusere på rene prognostiske prædiktorer og ikke til om respons på specifikke behandlinger. Som et første skridt, vi screenede en serie af 33 microRNA’er at identificere potentielle prædiktorer for udfaldet i multivariat analyse, herunder alder og stadie i Cox modellen. MikroRNA’er blev valgt i overensstemmelse med antallet af citationer i Pubmed bruger som søgeord udtrykkene “kolorektal cancer” og “microRNA”. Ti microRNA (MIR-532-3p, Mir-200a, Mir-17, Mir-106a, MIR-193a-5p, MIR-145, MIR-375, Mir-29a, MIR-18a og Mir-200b) var statistisk signifikante med værdier af rækkevidde risikoforhold (RR) mindre end 1 for hver, hvilket betyder, at høj ekspression var relateret til et godt resultat (tabel 2). For yderligere at understøtte resultaterne af Cox-analyse blev data også vurderet ved anvendelse af Kaplan-Meier-metoden. Fem kvintil cutoffs (25, 33, 50, 67 og 75) blev anvendt til at stratificere patienterne for høj og lav ekspression af hvert microRNA og log-rank test tjente at opdage, hvis forskelle i resultatet var signifikante. Den kvintil cutoff giver den laveste p-værdi ved log-rank test blev anvendt som diskriminator (tabel 2). Syv microRNA (Mir-200a, Mir-17, Mir-106a, MIR-375, Mir-29a, MIR-18a og Mir-200 mia) blev bekræftet at være signifikante under anvendelse af Kaplan-Meier-metoden, og de tilsvarende plots er vist i fig . 2.

I rød fase I-II patienter (n = 176), i grønne fase III patienter (n = 82) og i blåt stadie IV (n = 8).

Kaplan-Maier-analyse blev udført dividere patienterne så højt (grøn) og lav indstilling (rød). Survival tidsskala er i måneder. Alle forskelle var signifikante og p-værdier er angivet i tabel 2 (Log-rank test). Vejviser

Expression Analyse af gener

Nanofluidic teknologi tilbyder den fordel at tillade analyse af microRNA og deres målgener (targetome) i den samme RNA-prøve på grund af det lave volumen af ​​hver enkelt qPCR analyse. For at udføre denne analyse, vi ansat flere programmer (www.miRbase.org) [13] for at udarbejde en liste over gener, der kan være målrette af de 33 undersøgte i denne undersøgelse microRNA. Listen blev prioriteret efter et funktionelt netværk opnået med DAVID software (https://david.abcc.ncifcrf.gov) [14] for at berige puljen med handlingsrettede mål og master-regulatorer af genekspression og apoptose. Efter en indledende analyse af 180 kandidater, vi fokuserede på 79 gener, hvis udtryk var påviselig i et stort antal CRC kræftpatienter. Seks gener (MID1, INHBA, OSBPL3, BGN, DICER1 og FAP) var prædiktorer i univariat analyse (data ikke vist), men kun MID1 forblev signifikant efter multivariat korrektion og Kaplan-Meier analyse (tabel 3 og fig. 3). Som en anden foranstaltning til eventuelt øge antallet af kandidatgener, vi analyserede den offentlige datasæt GSE14333 rapportering transkriptom analyse af 290 patienter CRC kræft [15]. For hvert enkelt gen blev data analyseret og beregnet i en multivariat Cox model som beskrevet ovenfor (tabel 4). Prognosemuligheder blev bekræftet ved Kaplan-Maier-analyse under anvendelse af en multipel proceduren ifølge kvintil selektion for cutoff som beskrevet ovenfor. De 45 gener med de laveste p-værdier i multivariat analyse blev vurderet i vores platform af nanofluidic genekspression. Kun 3 ud af 45 (7%) generne blev bekræftet som prædiktorer for udfaldet i både GSE14333 og vores kliniske indstilling i multivariat Cox regression og Kaplan-Meier analyse (ANO1, KANK4 og IGFBP3, tabel 4 og fig. 3).

Kaplan-Maier-analyse blev udført dividere patienterne så højt (grøn) og lav indstilling (rød). Survival tidsskala er i måneder. Alle forskelle var signifikante og p-værdier er angivet i tabel 3 (Log-rank test). Vejviser

Expression Analyse af proteiner

For at foretage analyse på proteinniveau, valgte vi 9 faktorer (TUBB3, ELAVL1, OSBPL3, IGFBP3, ANO1, HGF, GLI3, PPP2CA og ARNT2). TMA’erne blev fremstillet ud fra de samme paraffinblokke, der anvendes til gen og microRNA analyse. Tredobbelte kerner i hvert tilfælde blev inkluderet i TMA’erne at fange klonal heterogenitet, og hver TMA blev analyseret i tre eksemplarer ved multiplex, kvantitativ fluorescerende immunhistokemi. Kerner blev farvet med DAPI (blå kanal), og stromale og epiteliale celler blev farvet med anti-vimentin (grøn kanal) og anti-cytokeratin (gul kanal), hhv. Antigener af interesse blev erhvervet i den røde kanal, og et repræsentativt billede af analysen for IGFBP3 og ANO1 er vist i fig. 4A. For hvert protein blev udtryk kvantificeret med AQUA-software, der udnytter et uovervåget algoritme til at kvantificere udtryk i definerede subcellulære rum eller “masker”. I vores undersøgelse valgte vi fire masker: tumor (cytokeratin +), stromale (vimentin +), tumor kerner (DAPI + /cytokeratin +) og tumor cytoplasma (DAPI- /cytokeratin +). For hver 3 mm kerne, blev analyseret mindst tre elektroniske delsegmenter (histospots). På grund af gentagen analyse, vi samlet op til 18 AQUA scores for hver patient, som derefter blev midlet. GLI3, ARNT2 og HGF viste overvejende nukleare farvning i nogle kræftceller, mens det i andre, farvningen var overvejende cytoplasmatisk. For at udnytte dette fænomen, blev et indeks skabt ved at dividere den nukleare over cytoplasmatisk ekspression. En værdi 1 var typiske for en stærk nuklear farvning, mens en værdi 1 angivet en overvejende cytoplasmatisk mønster af udtryk. Ekspression af alle proteiner og indekset blev analyseret med multivariat Cox regressionsanalyse. Kun udtryk for ANO1 (i cancerceller og i kerner af kræftceller) var signifikant i multivariat analyse (tabel 5 og figur 4B.)

A:. Fra top til bund følgende signaler er repræsenteret: antigen af interesse (rød kanal), celle kerner (DAPI), tumorceller (cytokeratin), stromale celler (vimentin) og sammenflettede billede. B: Kaplan-Maier analyse af 267 patienter i henhold til ekspressionen af ​​AQUA scoringer af ANO1 inde i tumoren masken (ANO1_AQUA) og i kernen af ​​cancerceller (ANO1_Nuclear_AQUA). Kaplan-Maier-analyse blev udført dividere patienterne så højt (grøn) og lav indstilling (rød). Alle forskelle var signifikante og p-værdier er rapporteret i tabel 5 (Log-rank test).

Beregning af Predictive Nøjagtighed

Vi delte patienterne i to kliniske grupper af interesse for at tillade en forenkling af censurerede data i en binær respons. Disse overlevende mindre end tre år fra diagnosen blev mærket som havende aggressiv sygdom, mens de overlevende i mere end tre år blev anset for at have mere indolent, ikke-aggressiv sygdom. Hver af de enkelte faktorer fra de tre dimensioner ovenfor (microRNA, gen eller protein) blev testet som en indikator for sygdom aggressivitet hjælp ROC kurver med AUC beregning. Selv om nogle faktorer var statistisk signifikante i multivariat analyse, den maksimale AUC fås fra en enkelt biomarkør i en enkelt dimension kun var 0,68 (ADAMTS5). Ved hjælp af en sådan svag prædiktor for patientpleje ville være uacceptabelt, da det er ukorrekt (enten falsk positiv eller falsk negativ) i ca. en tredjedel af tilfældene.

Generering af flerdimensionale biomarkører

Vi spekuleret på, at ved at kombinere information fra forskellige dimensioner (microRNA, gen- og protein), kunne vi øge prædiktiv nøjagtighed. Men multidimensionalitet skaber betydelige beregningsmæssige kompleksitet og udfordringer. Betragtninger i enkelt dimension analyse af antallet af betragtes variabler i vores tilfælde er relativt begrænset på 188, flerdimensional analyse af to og tre variable giver 17,578 og 1,089,836 kombinationer hhv. Styring for type 1 fejl ved hjælp af cross-validering bliver kritisk vigtigt som antallet af variable stiger. Af denne grund, efter at udelukke 17 patienter på grund af ufuldstændige data, vi tildelt tilfældigt de resterende 250 patienter til enten uddannelse eller testning sæt (Tab. 1). Som et første skridt, valgte vi tilfældigt enten to eller tre variable fra alle microRNA, gener og proteiner, som vi overvejet. Efter tilstrækkelig reduktion dimension blev variabler sammen til en ny diagnostisk score, som indeholdt alle de oplysninger om forældrenes faktorer. Beregning viste klart, at ved at øge mængden af ​​data fra forskellige dimensioner, de beregnede AUC steg i træningssættet (fig. 5A). Efter beregning af alle de 1,089,836 multidimensionale prædiktorer, valgte vi kombinationerne med den højeste placering af AUC. Blev derefter tilsat en yderligere biomarkør ad gangen, en microRNA, gen eller protein, ind i de eksisterende kombinationer samtidig overveje alle mulige kombinationer, og beregnet AUC igen i træningssættet (fig. 5B). Denne proces blev gentaget indtil AUC nåede et maksimum og undlod at stige betydeligt ved at tilføje yderligere prædiktorer i de eksisterende kombinationer. Disse beløbsgrænser blev nået, når antal variabler inde hver kombination nåede 10 i træningssættet (fig. 5B). Derefter analyserede vi de øverste kombinationer i sættet test og vi fandt 15 flerdimensionelle biomarkører (MB), som viste AUC-værdier 0,83 i træning og test sæt (sammensætning er rapporteret i tabel 6, 7 og 8), der understøtter opfattelsen af, at multidimensional biomarkører er mere præcis end en individuel enkelt dimension prædiktor. Fra denne liste valgte vi de 4 mest nøjagtige flerdimensionelle biomarkører (MB1 til MB4), hver med AUC på ca. 0,9 i både uddannelse og test sæt (Fig. 6A). Deres sammensætning er grafisk afbildet i fig. 6B. Disse biomarkører var også udestående prædiktorer for udfaldet i Kaplan-Meier analyse (fig. 6C).

I boxplot, fra bund til top, er de Q1-1.5 * IQR, Q1, median, Q3, og Q3 + 1,5 * Q3, hvor Q1 er første kvartil (25

percentil), Q3 er den tredje kvartil (75

percentil), og IQR er den interkvartile (nemlig Q3-Q1). I A foretages analysen med en enkelt variabel, med alle de mulige kombinationer af to (n = 17.578) og tre variable (n = 1,089,836). I B analysen udføres ved at tilføje en ny variabel (gen, microRNA eller protein) den foregående top kombinationer.

Grafisk diagram af sammensætningen ifølge MB1-4 (B). I blå, grøn og rød protein, er gener og microRNA rapporteret. Kaplan-Maier analyse af træning og test indstilles i henhold til udtrykket af de øverste 4 MB (C). Alle forskellene var stærkt signifikant (Log-rank test) og er rapporteret i tabel 7 og 8 til træning og test sæt, hhv. Vejviser

Diskussion

CRC kræft forbliver blandt de dødeligste maligniteter. For kliniske behandling, især i trin II og III sygdom, flere behandlingsmuligheder er nu tilgængelige. Som også observeret i vores kliniske studie resultatet er for det meste drevet af klinisk fase på diagnose med stadie IV patienter en alvorlig prognose. Men selv i patienter med tidligere stadier resultatet ikke kun gunstig med et betydeligt tilbagefald sats. Opdagelser af effektive biomarkører, der kan guide terapeutiske beslutninger ambitiøst søges i håb om at opnå de bedst mulige resultater, minimerer ikke nødvendige og giftige procedurer. Et væld af undersøgelser er blevet gennemført mod herpå [2], [16], [17]. Den ideelle biomarkør til at køre kliniske behandlinger bør være betydelig i multivariat analyse samtidig have robust prædiktiv præcision med få falsk positive og falsk negative resultater. Nogle begrænsede succeser er blevet opnået med hensyn til udvælgelsen af ​​specifikke terapeutiske regimer i henhold til toksicitet og effekt [2]. Men de fleste af disse lovende individuelle biomarkører er ikke lykkedes i kliniske forsøg [18]. Mere komplekse biomarkører er blevet skabt, omend i en enkelt dimension. En 12-gen panel var effektiv til at forudsige risikoen for tilbagefald og respons på behandling i et stort klinisk studie med 1436 patienter i fase II, og III CRC patienter [19]. Men senere valideringsundersøgelser ikke gengive de samme resultater [20], da akilleshæl denne teknologi er stadig den manglende præcision i uafhængige valideringsundersøgelser. I vores undersøgelse vil vi over dimension som beskaffenheden af ​​den variable, bliver microRNA, et gen eller et protein. Vi mener, at den manglende nøjagtighed bør afhænge i det mindste delvis fra det faktum, at 12-genet signatur kun blev opnået i genet dimension, således downsizing den mulige rolle, at andre faktorer, såsom microRNA og protein kan have i prognosemuligheder af gener. Denne tidligere erfaringer fik os til at gense den måde forudsigende biomarkører er bygget. Cancer aggressivitet er en kompleks træk i de fleste tilfælde. Det er som en multifaktoriel ligning. For at gøre mønsteret mere kompleks, såsom multiple faktorer kommer fra forskellige dimensioner såsom gener, proteiner, DNA-sekvenser og forskellige undersæt af celler (cancer og stromal). Vores idé var centrering forudsigelse om en integreret analysemetode, herunder flere dimensioner og flere faktorer på samme tid. Vi mener, at kun en integreret tilgang kan komme tættere på løsning af en multifaktoriel ligning. De resultater, vi præsenterer i denne undersøgelse understøtter vores hypotese. I vores kohorte CRC patienter, vi først analyseret et stort panel af mulige individuelle prædiktorer komme fra hver af tre enkelt dimensioner (microRNA, gen eller protein). Vi var faktisk i stand til at identificere statistisk signifikante prædiktorer for udfaldet, som bestemt ved multivariat Cox-analyse og Kaplan-Meier-metoden. Nogle af disse prædiktorer er ikke blevet grundigt undersøgt i CRC til dato. Som et eksempel blev ekspression af ANO1 (anoctamine 1) fundet at være statistisk signifikant på genet og proteinniveauet, re-håndhæve nye data fra analyse af datasættet GSE14333 [15]. Men AUC for ANO1 i vores analyse var ikke større end 0,65, hvilket betyder, at som en drivkraft for kliniske beslutninger, ville ANO1 misclassify en konsekvent antal patienter. Således ikke statistisk signifikans ikke nødvendigvis fører til klinisk anvendelighed. Manglende erkende dette faktum kan tegne sig for en stor del af skuffelse med individuelle biomarkører stammer fra en enkelt dimension [4], [20].

Ikke tilfreds med AUC under 0,7 og i håb om at udvikle mere robuste indikatorer, søgte vi at kombinere vores data på nye måder. I dette manuskript, vi give oplysninger om en multidimensional platform, som kombinerer nanofluidic teknologi med kvantitativ fluorescerende immunhistokemi at skabe biomarkører med AUC nærmer sig, og endda over 0,9. Mens antallet af variabler, der skal analyseres, er enorm, kan denne potente værktøjssæt indsamle flerdimensionale data til en rimelig reagens omkostninger for FFPE prøver ($ 0,20 for gen /microRNA analyse, $ 0,85 per protein).

Ud over at forudsige klinisk resultat, kan vores analyse fremhæve molekylære førere af aggressivitet. For eksempel vises IGFBP3 i alle de øverste fire flerdimensionale biomarkører. Dette antigen er velkendt for forskere i CRC, selv om modstridende data er til stede i litteraturen om dets virkninger [21]. På genekspressionsniveau i både GSE14333 og vores datasæt, blev høj ekspression af IGFBP3 relateret til dårligt resultat. Dette er i overensstemmelse med andre tidligere undersøgelser [21], [22], [23]. Vægten af ​​beviser sikkert implicerer dette gen som en fremtrædende drivkraft for CRC kræft aggressivitet på trods af sin væren på kant med ældre undersøgelser forbinder IGFBP3 udtryk for en anti-proliferativ effekt på væksten af ​​tyktarmskræft celler (revideret i [24]).

Kun to variable var til stede i 3 ud af de 4 øverste flerdimensionelle biomarkører: ADAMTS5 og HGF-indekset. ADAMTS5 er medlem af ADAMTS (en disintegrin og metalloproteinase med thrombospondin motiver) protein familie. Enzymet kodes af dette gen indeholder to C-terminale TS motiver og fungerer som aggrecanase at spalte aggrecan, en større proteoglycan af brusk [25]. Som enkelt faktor, i datasættet GSE14333 blev høj ekspression forbundet med dårlig resultat i flere sonder. Men i vores analyse, denne faktor viste ikke en signifikant tendens i multivariat analyse som enkelt element. Litteratur om ADAMTS5 i CRC kræft er yderst begrænset med kun én undersøgelse rapporterede dette gen som en af ​​de mest hypermethyleret i tumor i forhold til den omgivende normale tyktarmsslimhinde [26]. Den anden variabel, HGF (hepatocytvækstfaktor) indeks, repræsenterer en vej, der er kendt for at blive aktiveret i aggressiv CRC. HGF er blevet grundigt undersøgt som et potentielt nyt mål (revideret i [27]). Selvom HGF-ekspression i immunoperoxidasefarvning vises med et klart cytoplasmatisk mønster i CRC cancerceller [28], vores immunofluorescensbestemmelse demonstrerede en nuklear mønster, der var af klinisk betydning. En lignende kernelokalisering af receptoren af ​​HGF c-Met er blevet rapporteret i brystcancerceller, hvor en sådan overekspression var relateret til øget metastatiske potentiale og aggressiv sygdom [29].

Sammenfattende CRC cancer aggressivitet er en komplekse træk, der ikke kan forudsiges med passende nøjagtighed ved anvendelse af en individuel, enkelt dimensionelle faktor (microRNA, gen eller protein). I modsætning hertil en flerdimensional integreret tilgang, der udnytter data fra microRNA, kan gen og protein analyse generere præcise indikatorer for biologisk adfærd, fremme en bedre kliniske behandling af CRC, og skinne en spotlight på molekyler og molekylære veje, der er forbundet med og potentielt årsagen til dårligt resultat.

Støtte oplysninger

tabel S1.

Liste over antistoffer, leverandører og endelig koncentration anvendes

doi:. 10,1371 /journal.pone.0101065.s001

(DOCX)

Tak

Dette arbejde er dedikeret til mindet om Renato Andreoli, der gik bort for tarmkræft i en alder af 57.