PLoS ONE: En syntetisk letalitet Screen Ved hjælp af en Fokuseret siRNA Bibliotek for at identificere Sensitizers til Dasatinib terapi til behandling af epithelial kræft i æggestokkene

Abstrakt

Molekylær målrettede behandlinger har været i fokus for de seneste kliniske forsøg til behandling af patienter med recidiverende epitelial ovariecancer (EOC). De fleste har ikke klaret sig godt som monoterapier til forbedring af overlevelsen af ​​disse patienter. Ringe biotilgængelighed, manglende prædiktive biomarkører, og tilstedeværelsen af ​​multiple overlevelse pathways kan alle mindske succes for et targeted middel. Dasatinib er et tyrosinkinasehæmmer af Src-familien kinaser (SFK) og i prækliniske studier vist sig at have betydelig aktivitet i EOC. Men når evalueret i en klinisk fase 2 studie med patienter med recidiverende eller vedvarende EOC, blev det konstateret, at have minimal aktivitet. Vi antager, at syntetiske letalitet skærme udføres med en overbevisende designet siRNA bibliotek ville identificere anden-site molekylære mål, der kunne synergieffekter med SFK hæmning og forbedre dasatinib effekt. Ved hjælp af en systematisk tilgang, vi udførte primære siRNA screening ved hjælp af et bibliotek med fokus på 638 gener, der svarer til et netværk centreret om EGFR, HER2, og SFK-stilladser proteiner BCAR1, NEDD9, og EFS til at screene EOC-celler i kombination med dasatinib. Vi fulgte op med valideringsundersøgelser herunder udfoldning screening, kvantitativ PCR for at bekræfte effektiv gendæmpning, korrelation af genekspression med dasatinib følsomhed, og vurdering af den kliniske relevans af hits hjælp TCGA ovariecancer data. En raffineret liste over fem kandidater (

CSNK2A1

,

DAG1

,

Grb2

,

PRKCE

, og

VAV1

) blev identificeret som viser det største potentiale for at forbedre følsomhed over for dasatinib i EOC. Af disse

CSNK2A1

, som koder for den katalytiske a-underenhed af protein kinase CK2, blev udvalgt til yderligere evaluering. Synergistisk aktivitet af det klinisk relevante inhibitor af CK2, CX-4945, med dasatinib reducere celleproliferation og øge apoptose blev observeret på tværs af flere EOC cellelinier. kan anvendes Denne overordnede tilgang til forbedring narkotika effekt til andre målrettede stoffer, der har tilsvarende vist ringe klinisk aktivitet

Henvisning:. Pathak HB, Zhou Y, Sethi G, Hirst J, Schilder RJ, Golemis EA, et al . (2015) En syntetisk letalitet Screen Ved hjælp af en Fokuseret siRNA Bibliotek for at identificere Sensitizers til Dasatinib terapi til behandling af epithelial kræft i æggestokkene. PLoS ONE 10 (12): e0144126. doi: 10,1371 /journal.pone.0144126

Redaktør: Sandra Orsulic, Cedars-Sinai Medical Center, UNITED STATES

Modtaget: September 16, 2015; Accepteret: November 15, 2015; Udgivet: December 4, 2015

Copyright: © 2015 Pathak et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. undersøgelsen blev finansieret delvist af en bevilling fra National Cancer Institute (https://www.cancer.gov/) (CA140323) og Kansas Bioscience Authority (https://www.kansasbioauthority.org/) Eminent Scholar Program til AKG. HBP er et tværfagligt Kvinders Health Research Scholar gennem BIRCWH K12 Program på University of Kansas Medical Center sponsoreret af en bevilling fra National Institute of Child Health and Human Development (https://www.nichd.nih.gov) (K12 HD052027 ). JH er en modtager af Madison Lila Self Graduate Fellowship (https://selfgraduate.ku.edu/). EAG arbejde er støttet af en bevilling fra National Cancer Institute (https://www.cancer.gov/) (CA181287). Forfatterne anerkender støtte fra National Cancer Institute (https://www.cancer.gov/) Cancer Center Support tilskud P30 CA168524 (University of Kansas Cancer Center) og P30 CA006927 (Fox Chase Cancer Center). AKG er Chancellors Distinguished Chair i Biomedical Sciences Begavet Professor. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i æggestokkene er den anden mest almindelige gynækologisk kræft plager kvinder i USA [1]. Med omkring 14.000 dødsfald og 22.000 nye tilfælde skønnes årligt, kræft i æggestokkene har den højeste dødelighed-til-ny sag forholdet blandt alle gynækologiske maligniteter [1]. Der er tre hovedtyper af ovarietumorer klassificeret baseret på deres væv af oprindelse (overflade epitel, stromale endokrine celler, og kønsceller), med epitel carcinomer tegner sig for 90% af æggestokkene maligniteter [2]. Disse epiteliale tumorer er generelt yderligere opdelt baseret på deres cellulære morfologi, de fire mest almindelige undertyper bliver serøs, endometrioide, klar celle, og mucinøs, med hver undertype har forskellig patogenese, kemo følsomheder, og prognoser [2, 3]. I øjeblikket er standard for pleje af kvinder diagnosticeret med fremskreden sygdom er optimal debulking kirurgi efterfulgt af taxane- og platinbaseret kemoterapi (generelt paclitaxel eller docetaxel i kombination med carboplatin) [2]. Trods gunstige responsrater til denne indledende behandling, ~ 75% af patienterne i sidste ende oplever en gentagelse af en tumor, der i sidste ende bliver til behandling-resistent. Reaktion på terapi er ofte mindre hyppigt hos patienter med recidiverende sygdom og af kortere varighed i forhold til indledende behandling. Selvom forbedret i det sidste årti, den samlede 5-års overlevelsesraten for patienter med kræft i æggestokkene er stadig kun 44% [1]. Men som ekstra molekylære karakterisering af sygdom undertyper og en bedre forståelse af deres kliniske biologi og prædiktive biomarkører bliver tilgængelige, personlig medicin kan gives, at forbedre patienternes resultater gennem inddragelse af målrettede behandlinger [3-6].

Molekylære målrettede behandlinger er i øjeblikket i fokus for kliniske forsøg til behandling af patienter med recidiverende ovariecancer [7-11]. De Src-familien kinaser (SFKs), den mest fremtrædende medlem af ni medlemmer familien bliver SRC kinase, er membran forbundet ikke-receptor-tyrosinkinaser ofte overudtrykt og aktiveres i en række humane kræftformer og cellelinjer [12], herunder et størstedelen af ​​sen-fase serøse, mucinøse og endometrioide epitelial æggestokkræft og EOC cellelinjer [13-16]. De spiller nøgleroller i reguleringen signaltransduktion fra celleoverfladereceptorer [17-19], og derfor modulerer mange cellulære funktioner, herunder tumor progression og metastase i en række humane tumorer og har modtaget en fornyet interesse som potentielle mål for terapi [20-23 ]. Dasatinib er et oralt indgivet ATP-kompetitiv kinaseinhibitor af SFKs og BCR-ABL-fusionsprotein samt andre tumor-relevant kinaser [24, 25]. Dasatinib er en af ​​tre behandlinger til rådighed for patienter nydiagnosticerede med Philadelphia kromosom-positiv kronisk myeloid leukæmi [26]. Den fortsætter med at blive undersøgt for anti-tumorigen aktivitet mod en række hæmatologiske og faste tumorer (https://www.clinicaltrials.gov/). Vi har for nylig rapporteret resultaterne af en Gynecologic Oncology Group (GOG) sponsoreret fase 2 klinisk forsøg, GOG170M, evaluering dasatinib til behandling af patienter med recidiverende eller vedvarende EOC eller primær peritoneal carcinoma [27]. Dasatinib udviste minimal aktivitet som enkeltstof hos disse patienter [27], svarende til resultaterne fra mange tidligere GOG-170 serie af kliniske fase 2 studier evaluerer andre målrettede agenter som monoterapier ([4], www.GOG.org).

i langt de fleste af disse enkelt-agent forsøg, patient selektion baseret på en bestemt biomarkør ikke blev gjort, som kan have forbedret de observerede svarprocenter. Derudover dysregulering og integration af flere overlevelse veje i ovarietumorer [4] gøre terapier single-agent tilbøjelige til at bukke til afhandlinger aktiverede netværk. Derfor, i den aktuelle undersøgelse, vores mål var at eksperimentelt identificere og validere anden-site molekylære target (s), der kan hjælpe bevidstgøre ovariecancerceller til dasatinib og dermed forbedre dens effektivitet. For at nå dette mål, vi indledningsvis udføres små interfererende RNA (siRNA) -medieret gendæmpning ved hjælp af et bibliotek målrettet protein netværk er relevante for kræft i æggestokkene og SFK funktion. Dette bibliotek blev koncentreret om receptor (RTK’er), herunder epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) og HER2; deres effektorer SHC1 og SHC3; og tre CAS-familie proteiner, NEDD9, BCAR1, og EFS, som direkte binder og påvirke SFK og BCR-ABL, og i nogle tilfælde har vist sig at påvirke dasatinib respons [28-31]. Vi brugte dette bibliotek til at identificere syntetisk dødelige kombinationer, der forbedrer følsomheden af ​​EOC celler til dasatinib. Vi derefter systematisk indsnævret vores hitliste fra den primære skærm og identificeret flere kandidat dasatinib sensibiliserende (

CSNK2A1

,

DAG1

,

Grb2

,

PRKCE

, og

VAV1)

. Af disse

CSNK2A1

genereret en af ​​dem mere fremtrædende overfølsomhedsreaktioner i siRNA skærme og dens ekspressionsniveauer fandtes at være prædiktive for dasatinib følsomhed i et panel af EOC cellelinier. Desuden

CSNK2A1

blev overudtrykt med næsten 2 gange hos patienter med serøse cystadenocarcinomas. Derfor

CSNK2A1

blev anset for at være den mest lovende mål blandt de fem hits for hæmning at øge dasatinib aktivitet.

In vitro Salg drug kombinationsstudier udført under anvendelse dasatinib og CX4945 (silmitasertib), den første og eneste klinisk relevant CK2 inhibitor [32], viste signifikant synergi på tværs et panel af EOC cellelinier reducere proliferation og øge apoptose. Den fokuserede, systematiske tilgang, som vi har taget i denne undersøgelse for at identificere anden-site sensibiliserende at forbedre dasatinib effekt kan også anvendes på andre målrettede stoffer, der har tilsvarende vist ringe klinisk aktivitet.

Resultater

Identifikation af dasatinib-sensibiliserende hits

den primære screening af en EOC cellelinje blev udført ved hjælp af en specialdesignet, siRNA bibliotek med fokus på at målrette signalering protein netværk centreret om EGFR, HER2, SHC1, SHC3, NEDD9, BCAR1 og EFS. Denne skik bibliotek bestod af 1.276 siRNA-duplexer rettet 638 menneskelige gener (en pulje på to siRNAs pr gen per brønd). Design og udvikling af denne netværksbaseret fokuseret siRNA screening bibliotek blev tidligere beskrevet af Astsaturov

et al

. [33]. Vi valgte dette bibliotek, fordi det målrettet mange af de signalproteiner som virker opstrøms, nedstrøms eller parallelt med SFK, givet sin samspil med RTK’er [34, 35] og dets fremtrædende rolle i at lette signaltransduktion fra RTK’er [17-19], give os de mest relevante og sandsynlige kandidater til at målrette i kombination med hæmning af SFK.

Vi anvendte denne fokuserede bibliotek til at screene en EOC cellelinie, A1847, der stammer fra en patient med en ubehandlet, udifferentieret ovariecancer [ ,,,0],36, 37], at identificere gener, der giver resistens over for SFK inhibering via dasatinib behandling. Denne cellelinie blev valgt, fordi det billede konsistente, reproducerbare transfektions data under high-throughput screening tilstande i et siRNA-baseret screening af det humane druggable genom [38], og fordi det var følsomme over for dasatinib forhold til andre EOC cellelinier (Pathak og Godwin , upublicerede resultater). Vi antager, at identifikationen af ​​anden-site mål, som yderligere bevidstgøre en følsom cellelinie vil helt sikkert give en vis grad af overfølsomhed til mere resistente cellelinier. Figur 1 giver en generel skematisk af den samlede eksperimentelle design (se afsnittet Materialer og metoder for oplysninger om screening). Efter statistisk analyse af de normaliserede levedygtighed celle data fra den primære screening af A1847 cellerne i nærvær af siRNA + dasatinib eller siRNA + dimethylsulfoxid (DMSO, at køretøjet anvendes til at opløse dasatinib), en overfølsomhed (SI) blev beregnet for hver siRNA pool. I alt 84 gener med en SI-værdi ≤ 0,85 og en falsk opdagelse sats (FDR) 10%, svarende til ~ 13% af generne er omfattet af dette bibliotek blev udvalgt til at indgå i den næste runde af screening (S1 Table, primær skærm).

A-F. En generel skematisk den eksperimentelle workflow af den primære og sekundære siRNA screening og efterfølgende validering og videreudvikling eksperimenter udført for at identificere de anden-site sensibiliserende for dasatinib. Detaljer for hvert sæt af eksperimenter findes i de efterfølgende figurer og supplerende figurer og tabeller i hele afsnittet Resultater.

Eliminering falsk positive hits

For at eliminere potentiel falsk-positive hits fra den første skærm, der kan skyldes off-target effekter af de oprindeligt anvendte siRNA’er, vi samlet et nyt bibliotek, som indeholder fire individuelle siRNA’er (1 siRNA /brønd) målrettet hver af de 84 gener identificeret i den primære skærm. Med denne nye bibliotek af de-komplicerede siRNA’er, vi udførte en sekundær skærm i tre eksemplarer og beregnet SI-værdi for hver siRNA som det var tilfældet for den primære skærm. S1 Fig viser korrelationen for 2 af de 3 skærme til både køretøjet og dasatinib behandlinger. Vi overvejede gener som dasatinib sensibiliserende, hvis de gav en gennemsnitlig SI-værdi ≤ 0,85 til

mindst

to af de fire individuelle siRNA’er rettet mod et bestemt gen på tværs af de tre biologiske gentagne eksperimenter (S1 Table, sekundær skærm). Baseret på disse strengere kriterier, fjernede vi 44 potentielle falsk-positive hits identificeret i det første skærmbillede.

For de resterende 40 hits, vi samlet de to bedste siRNA’er rettet hvert gen (

jeg

.

e

. dem med de to laveste SI værdier identificeret fra de sekundære skærme) og transficeret de A1847 celler med denne optimale pulje af de to mest effektive siRNA’er (2 siRNAs /brønd /genet) eller den negative kontrol siRNA , GL2, målretning ildflue-luciferasegenet. Otteogfyrre timer efter transfektion, udførte vi kvantitativ RT-PCR til at bestemme mRNA-niveauer i celler omfattet af de genspecifikke siRNA pools forhold til niveauer i celler er mål for negativ kontrol siRNA. Vi betragtes som on target kun de siRNA puljer, reducerede genekspression med mindst 70%. Baseret på disse kriterier for QRT-PCR-resultater, vi indsnævret vores hit liste over dasatinib-sensibiliserende hits til 31 gener (S2 tabel).

Specificitet af dasatinib-sensibiliserende hits

Da dasatinib inhiberer andre tyrosinkinaser foruden de SFKs, såsom BCR-ABL, c-KIT, og PDGFR [24], vi næste bestemmes graden af ​​specificitet af de 31 hits for sensibilisering EOC celler til SFK inhibering. Vi brugte pool af de to bedste siRNA’er rettet mod hvert gen (identificeret fra de-foldning undersøgelser) og screenet de 31 træffere i kombination med dasatinib eller i kombination med et andet tyrosinkinaseinhibitoren, imatinib, som overvejende er rettet mod BCR-ABL, PDGFR, og cKIT, med begrænset aktivitet mod de SFKs [39, 40]. siRNA-medieret gen-nedregulering i kombination med imatinib resulterede i kun 2 af de 31 hits, der viser en overfølsomhed effekt på ≤ 0,85, mens alle 31 siRNA puljer genereret SI værdier ≤ 0,85, når screenet i kombination med dasatinib (S3 tabel). De to hits identificeret fra imatinib kombination skærm (

GAB1

JUP

) blev anset for at være fælles sensibiliserende med dasatinib og derfor blev fjernet fra yderligere undersøgelser, raffinering dasatinib-specifikke hitliste yderligere til 29 hits.

Korrelere genekspression til dasatinib følsomhed

for at afgrænse de anden-site sensibiliserende til dasatinib, det basale niveau af genekspression for de 29 dasatinib sensibiliserende hits blev målt i syv EOC cellelinjer (A1847, A2780, C30, CP70, OVCAR5, SKOV3, og UPN275) ved hjælp 96☓96 dynamiske arrays på BioMark mikrofluid kvantitativ PCR (qPCR) platform (Fluidigm) (fig 2A). Disse EOC cellelinjer blev valgt, fordi de viste varierende niveauer af dasatinib følsomhed i tidligere udgivet værk af Pathak og Godwin. Derfor opnåede vi en mere præcis måling af dasatinib følsomhed i disse cellelinjer ved måling af dosis respons af hver og beregne dens levedygtighed ved en dasatinib koncentration på 1 uM (fig 2B). Størrelsen af ​​korrelation (Spearman koefficient r) og statistisk signifikans (p-værdi) blev beregnet for hvert gen med henblik på at identificere potentielle gener hvis ekspressionsniveauer korreleret med dasatinib følsomhed (S3 tabel). Fire sådanne gener (

BCAR3

,

CSNK2A1

,

PRKCA

, og

PRKCE

) blev identificeret som værende prædiktive for dasatinib følsomhed, med en statistisk signifikant korrelation mellem udtryk og narkotika følsomhed (p 0,05, S3 Bord og figur 2C). Af disse

CSNK2A1

og

PRKCE

er omvendt korreleret med dasatinib følsomhed (

jeg

.

e

., Lave niveauer af disse to gener resulterer i højere følsomhed over for dasatinib), og derfor er potentielle sekundære mål (

e

.

g

., narkotika, som reducerer deres niveauer eller aktivitet i tumorceller ville bevidstgøre disse celler til dasatinib).

A. Basisniveauet af genekspression af 29 dasatinib-sensibiliserende gener i syv EOC cellelinjer blev målt ved anvendelse af kvantitativ PCR udført med en 96☓96 dynamisk array på Fluidigm BioMark mikrofluid platform. Vist er et repræsentativt varme kort over den dynamiske array. Delta C

t-værdier blev beregnet for hvert gen i hver cellelinje (se materialer og fremgangsmåder for detaljer). B. Data om dosisrespons af dasatinib i syv EOC cellelinjer blev genereret og cellelevedygtighed ved 1 uM dasatinib blev beregnet for hver cellelinie som en procentdel af vehikelbehandlede celler under anvendelse af GraphPad Prism. Vist er den gennemsnitlige ± standardafvigelse af middelværdien for hvert datapunkt. C. Delta C

t og dasatinib følsomhed data (dvs. levedygtighed ved 1 uM medikamentkoncentration) blev udsat for Spearman korrelation analyse ved hjælp af GraphPad Prism. Størrelsen af ​​korrelation (Spearman r-værdi) er vist for de fire gener, som udviste en statistisk signifikant korrelation (p 0,05). Hvert punkt repræsenterer en EOC cellelinie med farven matcher koden vist i panel 2B. Linien gennem datapunkterne er kun vejledende. S3 Tabel viser de r og p-værdier for de andre gener evalueret, men som ikke viste signifikans.

Klinisk relevans af dasatinib sensibilisatorer

Gener, hvis protein produkter er afvigende produceret ud over i æggestokkene kræftpatienter kan potentielt være målrettet med inhibitorer til at reducere deres aktivitet. Disse proteiner ville blive betragtet som klinisk relevante terapeutiske mål. Derfor analyserede vi genekspression data tilgængelige via Cancer Genome Atlas (TCGA) data portal om ovariecancer [41] for de 29 dasatinib-specifikke sensibilisatorer opført i S3 tabel. Genekspression data fra 518 serøse cystadenocarcinomas, den største histologiske subtype for EOC og fallopian rør prøver fra 8 raske individer blev opnået fra databasen. Den æggeleder epitel har været impliceret som en kilde af oprindelse for høj kvalitet serøs ovariecancer [42-45], og derfor en passende sammenligningsgruppe. Af de 29 gener, der blev undersøgt, en gennemsnitlig stigning i genekspression mængder større end 1,5 gange i tumorprøver i forhold til de normale prøver blev observeret i fem gener (

CSNK2A1

,

DAG1

,

Grb2

,

VAV1

, og

Ja1;

figur 3 og S4 tabel). Interessant, to af disse gener (

CSNK2A1

og

DAG1

) var også blandt de fem bedste hits med hensyn til niveauet af overfølsomhed til dasatinib observeret, når generne blev stille (S3 tabel).

Agilent genekspression data fra TCGA om 518 serøse cystadenocarcinomas og 8 æggeleder prøver afledt fra raske individer blev forespurgt til 29 dasatinib sensibiliserende gener. De seks Agilent prober, der viste ≥ 1,5 gange stigning i den gennemsnitlige genekspression af de respektive gener i tumorprøverne (grå felter) i forhold til kontrollerne (hvide bokse) er vist. De whiskers af hver kasse plot repræsenterer udtrykket værdier på 5

th og 95

th percentiler. P-værdierne blev beregnet under anvendelse af en uparret to-halet t-test under anvendelse af GraphPad Prism. S4 Tabel viser de gennemsnitlige udtryk værdier af Agilent sonder på tværs af tumor og normale prøver for alle 29 gener.

In vitro

narkotika kombination af dasatinib og CX-4945

på grund af dets overekspression i et flertal af de æggestokkene tumor prøver, dens lave SI værdi fra skærmen, og dens katalytiske natur,

CSNK2A1

er en top kandidat til potentielle lægemiddel-screening /udvikling og prækliniske studier i kombination med dasatinib.

CSNK2A1

gen koder for den katalytiske alpha subunit af protein kinase CK2, en serin-threonin-kinase, og en CK2 inhibitor, CX-4945 (silmitasertib) [46-48], har for nylig afsluttet et fase 1 klinisk forsøg som en potentiel anticancer narkotika [32]. Det er den eneste ATP-kompetitiv inhibitor mod CK2 at have denne status. Derfor valgte vi CX-4945 for at studere virkningerne på cellevækst i et panel af etablerede EOC cellelinjer, når det kombineres med dasatinib. Celler blev behandlet med hvert enkelt middel eller en kombination af de to lægemidler på et fast molforhold over et område af koncentrationer. Figur 4A viser dosis-respons kurver for CX-4945 som et enkelt middel (sort linje), og når de kombineres med dasatinib på en 20: 1 molforholdet (grå stiplet linie). Dosisresponskurver for to andre molære forhold evalueret (8: 1 og 3: 1) er vist i S2 Fig. Kombi (CI) værdier blev beregnet for hver af de tre nøgletal og er afbildet i fig 4B. Lægemiddelkombinationer, som resulterer i Chou-Talalay Cl-værdier mindre end 1 anses for at være synergistisk hvorimod kombinationer, som resulterer i CI-værdier større end 1 anses for at være antagonistiske [49, 50]. Disse data antyder, at lægemidlerne arbejder synergistisk for at inhibere proliferation tværs af størstedelen af ​​EOC cellelinier.

A. Den Chou-Talalay-metoden [78] blev anvendt til at udføre narkotika kombination studier af dasatinib og CX-4945. Punkterne repræsenterer den gennemsnitlige levedygtighed ± standardfejl på middelværdi efter 72 timer af lægemiddelbehandling på de angivne koncentrationer af CX-4945 (•) og CX-4945 + dasatinib (◆; konstant molært forhold på 20: 1 af CX-4945: dasatinib ) for de forskellige EOC cellelinjer i procent af vehikelbehandlede celler. Kurvetilpasningen linier blev dannet ved anvendelse af ikke-lineær regressionsanalyse i GraphPad Prism. Data for de andre molforhold, der blev evalueret præsenteres i S2 Fig. B. dosis-respons data blev anvendt til at beregne kombinationen (CI) værdier for hver cellelinje ved de forskellige molforhold under anvendelse CalcuSyn software [79]. CI værdier mindre end 1 tyder på, at den medicin, der arbejder synergistisk. Vist er den gennemsnitlige beregnede CI værdi ± standardafvigelse af middelværdien.

Vi næste evaluerede effekten af ​​kombinationen narkotika på cellecyklusprogression og celledød ved hjælp propidiumiodidfarvning (S3 Fig). Vi har ikke afsløre eventuelle væsentlige ændringer i cellecyklus fase fordeling med enten af ​​de enkelte agenter i de anvendte doser. Imidlertid kombinationsbehandlingen steg procentdelen af ​​sub-G1 celler i størstedelen af ​​cellelinierne, hvilket antyder tilstedeværelsen af ​​celler, som undergår apoptose (fig 5 og S3 Fig). Vi udførte derfor en direkte måling af apoptose ved at måle annexin V og spaltning af caspase-3 og -7 (figur 5). Begge assays indikerede forøgede niveauer af apoptose i kombination behandlede celler i forhold til de andre behandlinger. I mange tilfælde er stigningen i sub-G1 og den apoptotiske celle population efter kombinationsbehandling var større end additiv som angivet ved værdier større end beregnet ved anvendelse af Bliss uafhængighed model [51].

Cell cyklus og apoptose data blev kvantificeret for de angivne fold-ændringer i forhold til vehikelbehandlede celler og præsenteres som søjlediagrammer viser den gennemsnitlige fold-ændring ± standardafvigelse af middelværdien. I alle tre assays, enlige (Das, 0,5 uM; CX-4945, 10 um) og kombinationen lægemiddelbehandlinger (Das, 0,5 uM; CX4945, 10 uM) var i 72 timer. P-værdier blev beregnet under anvendelse af en t-test, som sammenligner kombinationen behandlingsgruppen til hver enkelt middel behandlingsgruppe. Den stiplede linje angiver den teoretiske værdi, hvis stofferne virker additivt beregnes ved hjælp af Bliss uafhængighed model (Bliss additivitet værdi = FC

Das + (FC

CX-4945 * (100-FC

Das)) /100 hvor FC er fold-ændring [51]. de observerede værdier større end Bliss additivitet værdi indikerer synergi. Se Materialer og metoder for yderligere assay detaljer.

diskussion

Dasatinib er en godkendt terapeutisk til behandling af flere typer af leukæmi og bliver brugt over hele verden i patienter både nydiagnosticerede og dem, der tidligere er behandlet for disse sygdomme [26, 52-55]. det er også ved at blive undersøgt i den tidlige fase kliniske studier af andre tumortyper ( https://www.clinicaltrials.gov/, [56]). Selv om, som vi tidligere har rapporteret, det viste en begrænset respons som et enkelt middel i tidligere behandlede patienter med tilbagevendende EOC [27], er det ikke desto mindre en potent hæmmer af Src-familien og BCR-ABL tyrosinkinaser, der tolereres godt af patienter, og for hvilke vores undersøgelser giver præklinisk rationale at vurdere i kombination med andre målrettede midler. Desuden har inhibering af SFKs blevet foreslået som en mekanisme til at forstærke antitumoraktiviteten af ​​paclitaxel [57], lægemidlet almindeligvis anvendes i front-line behandling for patienter med EOC. Identificering måder at forbedre dasatinib aktivitet mod EOC ville have væsentlig og umiddelbar klinisk effekt.

På vej mod dette mål, vi har taget en systematisk, rationel tilgang på at identificere anden-site molekylære mål som bevidstgøre EOC celler til dasatinib. Vi har identificeret fem gener (

CSNK2A1

,

DAG1

,

Grb2

,

PRKCE

og

VAV1

) som kandidat anden- websted sensibilisatorer dasatinib og fire gener (

BCAR3

,

CSNK2A1

,

PRKCA

, og

PRKCE

) som indikatorer for dasatinib følsomhed. Selvom

Ja1

blev identificeret som et potentielt sekund-site sensibiliserende (figur 3 og S4 tabel), vi ikke betragter det som en farbar vej for kombination med dasatinib. Dette skyldes,

Ja1

koder for JA, et medlem af SFK med en høj grad af strukturel og funktionel homologi med andre familiemedlemmer [58, 59]. Derudover hæmmer dasatinib JA med samme selektivitet som andre SFK medlemmer [24]. Derfor mener vi ikke,

Ja1

som en anden-site molekylære mål, da det ser ud dasatinib direkte hæmmer Ja1 allerede. Af de resterende kandidater,

CSNK2A1

er den øverste kandidat til kombinationsbehandling baseret på resultaterne i dette studie. Dens rolle i biologien af ​​cellen og ovariecancer og dens samspil med SFK medlemmer er kort omtalt nedenfor. En lignende diskussion er fastsat for de resterende hits som underbyggende oplysninger.

CSNK2A1

koder for den katalytiske alpha subunit af protein kinase CK2. Dette protein er en allestedsnærværende, konstitutivt aktiv serin /threonin-kinase med væsentlige roller i cellernes levedygtighed og division, og undertrykkelse af apoptose [60-62]. CK2 er en promiskuøs kinase, med over 300 potentielle substrater [63] og en dobbelt rolle både i celledeling og død gør, der har været impliceret i mange sygdomme [61]. CK2 protein niveauer er forhøjede i alle cancerformer, der er blevet undersøgt [62, 64]. TCGA data om ovariekræft viser, at den katalytiske a-underenheden af ​​CK2 overudtrykkes i hovedparten af ​​ovarietumorer (Fig 3) og MEK-MAPK-CK2-vejen er blevet impliceret i fænotypiske ændringer i en celle kultur model repræsenterer progressive stadier i udviklingen af ovariecancer [65]. CK2 er blevet identificeret som et lovende terapeutisk mål for kræftbehandling [62] og CX-4945, den kliniske fase CK2 inhibitor, som er blevet evalueret i fase 1 forsøg, viste sig at virke synergistisk med gemcitabin og platin-baserede kemoterapeutika

in vitro

hjælp ovariecancer cellelinier og

in vivo

bruge en mus xenograft model for ovariecancer [51]. CK2 forhold med SFK medlemmer er gådefuldt med undersøgelser, der viser, at CK2 kan nedregulere aktiviteten af ​​mindst tre SFK medlemmer (SRC, Fyn, og YES) via direkte fosforylering af deres threoninrester [66, 67], mens en anden undersøgelse viser, at tyrosinphosphorylering af CK2 af SFK medlemmer øger CK2 katalytisk aktivitet [68]. Hvordan disse to kinaser interagerer med hinanden, og om det er direkte eller gennem molekylære chaperoner såsom CDC37 [69] eller andre signalveje og hvordan deres aktiviteter modulerede er ikke helt klart i øjeblikket. Detaljerede mekanistiske undersøgelser er nødvendige for at give en mere grundig billede og at hjælpe med at generere en begrundelse for, hvordan synergien mellem disse to kinaser kan forekomme. Ikke desto mindre er yderligere præklinisk udvikling ved hjælp dasatinib og CX-4945 eller andre relevante hæmmere rettet SFK og CK2 til behandling af epitelial ovariecancer berettiget.

I betragtning af den tid og penge, der investeres, og de mest værdifulde ressourcer af alle, patienter, i at udvikle sikre, højpotente målrettede lægemidler såsom dasatinib og andre lignende molekylært målrettede agenter, er det bydende nødvendigt, at alle potentielle muligheder for at forbedre disse eksisterende lægemidler evalueres. Dette omfatter identifikation af rationelle lægemiddelkombinationer, omformulering for alternative ruter af drug delivery, og nyorientering for andre sygdomme, hvor lægemidlet ikke oprindeligt var godkendt. Endelig identifikation af prædiktive biomarkører for reaktion er afgørende for målrettede behandlinger for at få større præcision i patientudvælgelse således at en sand svarprocent er målt for et givet lægemiddel uden at blive kompliceret af inklusion af patienter, der ikke reagerer simpelthen fordi de ikke var egnede kandidater til at nyde godt af et bestemt lægemiddel. I denne undersøgelse har vi taget en fokuseret tilgang til at identificere flere kandidater til kombinationsbehandling med dasatinib, en strategi, der kan anvendes på andre målrettede stoffer, der har tilsvarende vist ringe klinisk aktivitet.

Materialer og metoder

Cell kultur

epitelovariecancer cellelinjer anvendt i denne undersøgelse er tidligere etableret eller afledt af os under en protokol godkendt af Fox Chase Cancer center Institutional Review Board og skriftligt informeret samtykke (C30 og CP70 fra forældrenes A2780 celler [70]; UPN275 [38]). [33].