PLoS ONE: Tumor-Produceret versican V1 Forbedrer hCAP18 /LL-37 Expression i makrofager gennem Aktivering af TLR2 og vitamin D3 Signaling at fremme kræft i æggestokkene Progression I Vitro

Abstrakt

Tumor-associerede makrofager har vist sig at fremme tumorvækst. De kan have en obligatorisk funktion i angiogenese, invasion, og metastase gennem frigivelse af inflammatoriske mediatorer. Deres tilstedeværelse i ovariecancer er blevet korreleret med dårlig prognose hos disse patienter. Det humane kationiske antimikrobielle protein-18 (hCAP18) /LL-37 blev oprindeligt identificeret som et effektormolekyle af det medfødte immunsystem. Det er udgivet af medfødte immunceller, såsom makrofager, bekæmpe mikroorganismer. Tidligere undersøgelser har karakteriseret den hCAP18 /LL-37 som en vækstfaktor, som har vist sig at fremme ovarie tumorprogression. Men rollen hCAP18 /LL-37 har i makrofag-forfremmet æggestokkene tumor udvikling og hvordan dens udtryk er styret i denne sammenhæng er stadig dårligt forstået,. Her viser vi, i co-kultur eksperimenter af makrofager og ovariecancerceller en betydelig stigning i

in vitro

proliferation og invasivitet af tumorcellerne observeres. Disse forbedrede vækst og invasion egenskaber korreleret med hCAP18 /LL-37 induktion. HCAP18 /LL-37 ekspression blev formindsket ved tilsætning af to neutraliserende antistoffer, TLR2 eller TLR6 samt Cyp27B1 eller VDR-inhibitorer. Desuden enten TLR2 eller TLR6 antistof reduceret vitamin D3 signalering og tumorceller progression

in vitro

. Tilsætning af Cyp27B1 eller VDR inhibitorer ophævet TLR2 /6 aktiverings-induceret ekspression af hCAP18 /LL-37 i makrofager. Knockdown af tumor-producerede versican V1 af RNAi i disse tumorceller førte til en reduceret induktion af hCAP18 /LL-37 i makrofager. Versican V1 knockdown hæmmede også TLR2 og vitamin D3 signalering, samt vækst og invasivitet af disse tumorceller i

in vitro

co-kultur. Sammenfattende har vi fundet, at versican V1 forbedrer hCAP18 /LL-37-ekspression i makrofager ved aktivering af TLR2 og efterfølgende vitamin D-afhængige mekanismer, som fremmer ovarie tumorprogression

in vitro

.

Henvisning : Li D, Wang X, Wu JL, Quan WQ, Ma L, Yang F, et al. (2013) Tumor-Produceret versican V1 Forbedrer hCAP18 /LL-37 Expression i makrofager gennem Aktivering af TLR2 og vitamin D3 Signaling at fremme kræft i æggestokkene Progression

In Vitro

. PLoS ONE 8 (2): e56616. doi: 10,1371 /journal.pone.0056616

Redaktør: Qiang Wang, Cedars-Sinai Medical Center, USA

Modtaget: Juli 3, 2012; Accepteret: 15 januar 2013; Publiceret: 12 feb 2013

Copyright: © 2013 Li et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China Tilskud (81272603); Research Program for Udvalget for Videnskab og Teknologi i Putuo District, Shanghai (PTKW09-B02). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

en tumor mikromiljø spiller en afgørende rolle i tumor initiering og promotion. Denne unikke mikromiljø indeholder medfødte immunceller, lymfocytter og bindevæv samt maligne celler [1]. Medfødte immunceller (også kendt som myeloide celler), indbefatter makrofager, frigivelse cytokiner og chemokiner samt indflydelse tumorigenese [1] – [3]. Tumorassocierede makrofager (TAM’er) er en vigtig bestanddel af inflammatoriske infiltrater i tumorer. TAM’er er afledt af cirkulerende monocytiske forstadier ved kemoattraktanter, der udskilles af både tumor- og stromaceller [4], [5]. Kliniske studier fortsætter med at vise en sammenhæng mellem en høj populationer af TAM’er en dårlig prognose i ovarie-, bryst-, prostata-, lunge- og livmoderhalskræft [6] – [8]. Der er en voksende mængde beviser, at adskillige pro-inflammatoriske faktorer produceret af makrofager, fremme tumorvækst, angiogenese, invasion og metastaser [1], [5], [9]. Men den faktiske rolle en række centrale pro-inflammatoriske molekyler har i tumor fremme og deres mekanismer udtryksformer og funktionen forbliver dårligt forstået.

Den menneskelige kationiske antimikrobielle protein-18 (hCAP18) /LL-37 er den eneste kendte cathelicidin peptid hos mennesker [10]. HCAP18 /LL-37 konstitutivt produceret i talrige celletyper, herunder makrofager, neutrofiler, hud epitelceller i huden, mave-tarmkanalen og urinvejene, ved bitestiklen og respiratoriske epitelceller [11], [12]. Den HCAP18 gen består af 3 domæner: det N-terminale signalpeptid region, den stærkt konserverede cathelin-lignende domæne og det C-terminale område betegnes LL-37-peptidet [13]. LL-37 peptid fastholdes i sin pro-peptidform indtil spaltning med protease 3 lige før sekretion [14], [15]. LL-37-peptidet tjener forskellige funktioner i forskellige immunreaktioner, herunder immunmodulation, inflammatorisk reaktion, celleproliferation, angiogenese, og antiapoptotisk aktivitet [16]. LL-37 er blevet etableret som en bidragyder til tumorigenese og tumor progression [16], [17]. Undersøgelser har vist i ovariecancere LL-37 bidrager til celleproliferation, invasion og cancer progression gennem direkte stimulering af tumorceller, initiering af angiogenese og rekruttering af immunceller [14], [18], [19]. Behandling med en syntetisk, biologisk aktivt LL-37 peptid eller transgen ekspression LL-37 øger lunge tumor celleproliferation betydeligt. Denne forskning viser, at LL-37 fungerer som vækstfaktor for menneskelig lungecancer [20]. Derudover LL-37 også anses for at øge proliferation og metastase i brysttumorer og maligne melanomer [21], [22]. Tilsammen disse resultater understøtter den hypotese, at LL-37 funktioner en vækstfaktor i transformerede celler.

En række stimuli, herunder pro-inflammatoriske molekyler, vækstfaktorer, næringsstoffer, bakterielle produkter, og især inflammation og skader op -regulate ekspression af hCAP18 /LL-37 [16]. Hos mennesker 1,25-dihydroxyvitamin D3 (1,25D3) opregulerer ekspressionen af ​​hCAP18 /LL-37 via vitamin D-receptoren (VDR) i monocytter, makrofager, kerationocytes i epidermis [23], [24]. Tidligere forskning, der fokuserede på intracellulær

Mycobacterium tuberculosis

demonstreret TLR2 aktivering i humane makrofager opreguleret udtryk for VDR og Cyp27B1 gener. Denne kaskade af hændelser øger produktionen af ​​1,25D3, hvilket igen fører til induktionen af ​​hCAP18 /LL-37 [24]. Nylige studier af tumormikromiljøet har vist Lewis lungecarcinom (LLC) celler produceret faktorer, såsom versican, er nødvendige for lunge tumorvækst og metastase. Endvidere har denne fremgangsmåde er afhængig af TLR2-medieret myeloid celleaktivering [25], hvilket resulterer i NF-KB-aktivering af inflammatoriske faktorer TNFa, IL-6-produktion [26], [27].

Formålet med denne undersøgelse er at undersøge reguleringsmekanismer af hCAP18 /LL-37 i tumoren mikromiljø. Her rapporterer vi den versican V1 afledt fra tumorceller forøger hCAP18 /LL-37-ekspression i makrofager gennem aktivering af TLR2 og efterfølgende vitamin D-afhængige mekanismer. Desuden er det denne kæde af cellulære signaleringsbegivenheder, der fremmer ovarietumor celleproliferation og invasion. Disse resultater foreslår ny mekanisme for hCAP18 /LL-37 regulering i tumor mikromiljø. Desuden giver de indsigt i kritiske faktorer involveret i kræft progression.

Materialer og metoder

cellelinjer og reagenser

De humane ovariecancer cellelinjer OV-90 og SKOV3 celler blev opnået fra American Type Culture Collection, og andre menneskelige æggestokkene kræftceller HO-8910 blev 3AO celler købte fra Shanghai Institute of Cell Biology, Chinese Academy of Science. Disse celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) (Hyclone laboratorier. Inc, South, Utah, USA) suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS) (Invitrogen, Grand Island, NY, USA), 100 U /ml penicillin og 100 U /ml streptomycin (Hyclone laboratorier. Inc). Cellekulturer blev udført ved 37 ° C i befugtet luft med 5% CO

2. FCS blev erstattet med 10% komplement-inaktiveret humant serum (HS) (opnået fra blodbanken på Tongji Hospital Tongji Universitet. Institutionel godkendelse fra de lokale forsknings- etiske udvalg (intern gennemgang og Etik bestyrelser Tongji Hospital, Tongji Universitet ) blev opnået før udførelse denne undersøgelse) 24 timer før forsøget. Neutraliserende antistoffer anti-hCAP18 /LL-37 (2 mg /ml, klon # mAb 3D11, Hycult biotek, Netherland), anti-TLR2 (10 pg /ml, klon # mAb 383.936, R Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Californien, USA), mus anti β-actin (1:10000; Sigma-Aldrich, Steinheim, Tyskland). HRP-konjugeret gede-anti-kanin (1:5000; Santa Cruz Biotechnology) eller kanin-anti-muse (1:1000, Dako, Glostrup, Danmark) blev anvendt som sekundært antistof

RNA-isolering og real-time. PCR

Cell totale RNA’er blev fremstillet med RNeasy plus mini kit (Qiagen, Santa Clarita, CA, USA) ifølge fabrikantens anbefalinger. Real time PCR reaktionsblandinger har tidligere [28] blevet beskrevet. Kort fortalt blev cDNA syntetiseret ved revers transkriptionsreaktion under anvendelse af første streng cDNA-syntese kit (Invitrogen). Real-time PCR blev udført under anvendelse af QPCR SYBR Green Mix (Bio-Rad) på en AB 7300 real time PCR systemet maskine (AB Applied Biosystems, Singapore). Følgende PCR-primere blev anvendt: β-actin, 5′-AGCCTCGCCTTTGCCGA-3 ‘og 5′-CTGGTGCCTGGGGCG-3′; hCAP18 /LL-37, 5’-TGGGCCTGGTGATGCCT-3 ‘og 5′-CGATGTTCCTTCGACAGGAAGC-3′; VDR, 5’-AAGGACAACCGACGC CACT-3 ‘og 5′-ACACACCTGTAGCCGTACTA-3′; Cyp27B1, 5’-ACCCGACAC GGAGACCTTC-3 ‘og 5′-CACAGGTGCGACAACTGGTA-3′; Cpy24, 5’-CGCAG CGGCTGGAGAT-3 ‘og 5′-ATGGCGTTTCTTCCGATGCC-3′; TLR1, 5’-AACCC ATTCCGCAGTACTCCA-3 ‘og 5′-AAGGCCACGTTTGCTCTTTTC-3′; TLR2, 5’-CAATGATGCTGCCATTCTCAT-3 ‘og 5′-ATTATCTTCCGCAGCTTGC A-3′; TLR3, 5’-ACAACTTTAGCACGGCTCTGGA-3 ‘og 5′-ACCTCAACTGGGATC TCGTCA-3′; TLR4, 5’-AGTTTCCTGCAATGGATCAAGG-3 ‘og 5′-CTGCTT ATCTGAAGGTGTTGCAC-3’; TLR6, CCCATTCCACAGAACAGCAT-3 ‘og 5′-A TAAGTCCGCTGCGTCATGA-3′; CD14, 5’-TGTGAGCTGGACGATGAAGAT-3 ‘og 5′-CAGACACACACTGGAAGGCTT-3’. Specificitet af RT-PCR blev kontrolleret af ‘ingen revers transkription’ kontrol og smeltekurveanalyse. Kvantitative PCR-resultater blev opnået under anvendelse af ΔΔCT (tærskelcyklus) metode. Data blev normaliseret til p-actin niveauer i hver prøve.

ELISA-assay for versican

Prøver af cellekultursupernatanter blev analyseret af menneskelig versican ELISA (USCN life science, INC. Houston, TX, USA) ifølge producentens anvisninger. Detektionsgrænsen for analysen var 0,107 ng /mL.

Statistisk analyse

Værdier vises som middelværdi plus eller minus SEM. Sammenligninger mellem grupper blev analyseret ved t-test (to-sidet). Resultaterne blev betragtet som statistisk signifikant for P-værdier mindre end 0,05.

Resultater

Udtrykket af hCAP18 /LL-37 i makrofager fremmer spredning og invasivitet af ovariecancerceller

TAMer erstattet med perifert blod monocytafledte makrofager til

in vitro

co-kultur eksperiment var blevet rapporteret af forskellige grupper. Disse rapporter viser, at perifert blod monocytafledte makrofager har tilsvarende funktion til TAM’er [27], [31]. For at bestemme virkningen af ​​makrofager på ovariecancerceller proliferation, blev transwell inserts anvendes som et co-kulturmodel. Humane perifere blod-monocytafledte makrofager blev anbragt i transwell skær og forskellige ovariecancer cellelinier blev podet på bunden af ​​24-brønds plader. Co-kultur blev dyrket i 4 dage co-kultur i DMEM indeholdende 10% HS eller behandling med EGF, som en positiv kontrol. Væksten i HO-8910, OV-90, SKOV3, og 3AO celler blev signifikant forøget ved samtidig dyrket med humane makrofager afledt af perifere blodmonocytter (Fig. 1A). For at forhindre hCAP18 /LL-37 funktion monocytcellerne blev forbehandlet med en hCAP18 /LL-37 neutraliserende antistof før co-kultur med kræft i æggestokkene celler. I co-kultur eksperimenter, hvor monocytter blev forbehandlet med hCAP18 /LL-37 neutraliserende antistof en signifikant inhibering af HO-8910, OV-90, blev observeret SKOV3, og 3AO celler vækst (Fig. 1A). Nr cellevækstinhiberingen blev observeret i kontrol IgG1 antistof co-kultur eksperimenter (fig. 1a). For at vurdere makrofag-induceret æggestokkene vækst af BrdU-inkorporering cancerceller i nysyntetiserede DNA-strenge målt under anvendelse af anti-BrdU-antistoffer i et ELISA-assay. Konsekvent den observerede stigning i celleproliferation, DNA-syntese i HO-8910, OV-90, SKOV3, og 3AO celler blev bemærkelsesværdigt forøget, når cellerne blev co-dyrket med makrofager (fig. 1B). Som forventet, tilsætning af hCAP18 /LL-37 neutraliserende antistof reducerede makrofag virkning på ovariecancer celleproliferation (fig. 1B). Dernæst blev æggestokkene invasion cancerceller undersøgt. Disse cellers evne til at invadere Matrigelcoatede inserter var også signifikant forøget ved makrofager (fig. 1C, D). Efter co-dyrkningsmedier blev behandlet med hCAP /LL-37 neutraliserende antistof, det tumorcelleinvasion betydeligt svækkede (fig. 1C, D). Disse resultater antyder en direkte rolle for hCAP /LL-37 til at fremme tumorcelleinvasion. Et IgG kontrol antistof ikke interfererer med ovariecancer celleinvasion (fig. 1C, D). Tilsammen tyder disse data, at hCAP18 /LL-37 er nødvendig for makrofag proliferation og invasion i æggestokkene cancerceller.

For co-kultur eksperimenter af kræft i æggestokkene celler med makrofager, humant perifert blod monocyt-afledte makrofager (1 x 10

4 celler) blev anbragt i transwell skær og ovariecancerceller (1 × 10

4 celler) blev podet på bunden af ​​24-brønds plader. Celler blev præinkuberet med 2 ug /ml anti-hCAP18 /LL-37 eller et IgG1-isotypekontrol-Ab (2 ug /ml) i 2 timer. Cellerne blev co-dyrket i DMEM (10% HS) i 4 dage. 100 ng /ml EGF (Sigma, Steinheim, Tyskland) blev anvendt som kontrol. (A) Spredningen af ​​ovariecancerceller blev målt ved celletal tæller. (B) Celleproliferation blev målt ved ELISA (BrdU mærkning) analyse. (C) Invasion assay. Invasion assays blev udført under anvendelse af en BD BioCoat Matrigel Invasion Chamber med en 8 um porestørrelse PET membran, ensartet overtrukket med BD Matrigel Matrix. Resultaterne er gennemsnit ± SEM, signifikant forskel, n = 3, * p 0,05. (D) Matrigel invasion assay af SKOV3. DAPI-farvning af migrerede tumorceller. Repræsentative snit er vist (a) SKOV3 ingen behandling. (B) SKOV3 + makrofager. (C) SKOV3 + makrofager + neutraliserende anti-hCAP18 /LL-37 (2 ug /ml). (D) SKOV3 + makrofager + IgG1-isotypekontrol-Ab (2 ug /ml). (E) SKOV3 + EGF (100 ng /ml).

Tumor celler udløser aktivering af vitamin D3 og TLR2 signalering og opregulering af hCAP18 /LL-37 i makrofager

Til undersøge ekspressionsmønsteret for hCAP18 /LL-37, humane makrofager blev co-dyrket med SKOV3-celler. Induktionen af ​​hCAP18 /LL-37 mRNA (fig. 2A) og protein (fuld-længde hCAP18 /LL-37 og spaltes LL-37, fig. 2B) niveauer steg i makrofager. Omvendt var der ingen signifikante forskelle i hCAP18 /LL-37 mRNA eller pro-peptid niveauet i SKOV3 celler (fig. 2A, B). Nej, modne LL-37 blev ikke påvist i SKOV3-celler (fig. 2B). Disse resultater viste, at makrofager og ikke SKOV3 celler bidrager til frigivelsen af ​​LL-37 peptidet. At vurdere niveauet af hCAP18 /LL-37 og spaltes LL-37 i cellemediet, udførte vi western blotting på cellesupernatanter Efter 24 timers samdyrkning. En betydelig stigning i niveauet af forstadiet og spaltede peptid blev observeret i sammenligning med makrofager eller SKOV3-celler (fig. 2C).

humant perifert blod monocyt-afledte makrofager og SKOV3-celler blev co-inkuberet som beskrevet i figur 1 . Totale RNA’er og proteiner af SKOV3-celler og makrofager blev isoleret 24 timer efter co-dyrkning. (A) Ekspressionen af ​​hCAP18 /LL-37-mRNA blev målt ved real-time PCR. (B) Ekspressionen af ​​hCAP18 /LL-37-protein blev analyseret ved Western blot. β-actin tjente som ladningskontrol. (C) Western blot af cellesupernatanter fra SKOV3-celler, makrofager og co-kultur ved 24 timer. (D, E) Induktion af VDR, CYP24, Cyp27B1, TLRs og CD14 mRNA blev målt i makrofager ved real-time PCR. Resultater er middeltal gange ændring ± SEM, signifikant forskel, n = 3, * p 0,05; ns, ikke signifikant.

I betragtning af den VDR er blevet rapporteret at mediere ekspression af hCAP18 /LL-37 [23], [24] vi undersøge, om udtrykket af VDR og relaterede gener induceres under samdyrkning. Faktisk blev der observeret en stigning i VDR mRNA-niveauer, når makrofager blev co-dyrket med SKOV3-celler (fig. 2D). Endvidere blev 1,25 D3 kataboliske enzym CYP24 (også kendt som Cyp24A1) induceret i makrofager, når de blev co-dyrket med tumorceller. Cyp27B1, som katalyserer omdannelsen af ​​inaktivt provitamin D3 hormon (25D3) i det bioaktive formen (1,25D3) [24], mRNA niveauer blev også opreguleret i co-kultur model (fig. 2D). Det er blevet rapporteret, at TLR2 aktivering fører til vitamin D-afhængig induktion af hCAP18 /LL-37 i makrofager [32]. TLR2, 6 og CD14 mRNA niveauer alle viste den forventede stigning i co-dyrkede makrofager. Ekspressionsniveauerne af TLR1, TLR3, og TLR4 blev ikke ændret i disse makrofagceller (fig. 2E).

Ovariecancer cellemedieret induktion af hCAP18 /LL-37, VDR, CYP24, og Cyp27B1 i makrofager er afhængig af TLR2 og TLR6

Vi næste forsøgt at afgøre, om induktion af hCAP18 /LL-37 var afhængig af TLR2 induktion. Humane makrofager afledt fra perifere blodmonocytter blev inkuberet i 2 timer med en TLR2-neutraliserende antistof eller et IgG1 isotypekontrolantistof, derefter stimuleret i 24 timer i SKOV3-celle-konditionerede medier (SKOV3-cm) med 10% HS. I makrofagceller behandlet med TLR2 neutraliserende antistof en væsentlig reduktion i hCAP18 /LL-37 induktion blev observeret, blev observeret nogen signifikant effekt på gen-induktion i kontrol antistof-behandlede prøver (fig. 3A). For at bestemme om induktionen af ​​VDR, CYP24, og Cyp27B1 også var påvirket af eksponering for TLR2 neutraliserende antistof, blev mRNA-niveauer målt. Prøverne udsættes for sameTLR2 antistof viste ingen induktion af VDR, CYP24, eller Cyp27B1, igen ingen inhibitor påvirker blev observeret i IgG-antistoffet kontrolprøverne (fig. 3B-D). Disse forsøg blev gentaget under anvendelse af en TLR6 neutraliserende antistof, blev det samme mønster af inhibering observeret, med induktion af hCAP18 /LL-37, VDR, CYP24, og Cyp27B1 blokeres i TLR6 antistofprøver, men ikke kontrolgruppen (fig. 3A -D). Kombinerer TLR2 og TLR6 neutraliserende antistoffer tilbydes muligheden for en synergistisk inaktivering virkning af disse gener (Fig. 3A-D). Disse data indikerer tumor-medieret induktion af hCAP18 /LL-37 kræver TLR2 /6-aktivitet i makrofager. Denne induktion mekanisme menes at være involveret i vitamin D3 signalering. Som yderligere belæg for vores model, tilføjelse af neutraliserende antistoffer mod TLR2 eller TLR6 undertrykte signifikant SKOV3 celleproliferation og invasivitet (fig. 4A, B). Kombinerer TLR2 og TLR6 neutraliserende antistoffer resulterede i en synergistisk inhibering virkning på SKOV3 celle progression (fig. 4A, B). Disse resultater indikerer aktivering af TLR2 eller TLR6 er påkrævet for tumorcellen progression.

humane makrofager blev præinkuberet med 10 ug /ml anti-TLR2, 10 ug /ml anti-TLR6 eller et IgG1-isotype kontrol antistof (10 ug /ml) i 2 timer. Derefter makrofager var kultur med DMEM (10% HS) eller SKOV3-CM (10% HS) i 24 timer, og de samlede RNA’er blev ekstraheret for real-time PCR-analyse. (A) hCAP18 /LL-37-mRNA. (B) VDR mRNA. (C) CYP24 mRNA. (D) Cyp27B1 mRNA. Mean gange ændring ± SEM, n = 3, * p. 0,05

humant perifert blod monocyt-afledte makrofager og SKOV3-celler blev præinkuberet med 10 ug /ml anti-TLR2, 10 ug /ml anti -TLR6 eller et IgG1-isotypekontrol-Ab (10 ug /ml) i 2 timer. Cellerne blev co-dyrket i DMEM (10% HS) i 4 dage. 100 ng /ml EGF blev anvendt som kontrol. (A) Cell nummer, proliferation og invasion af SKOV3-celler blev målt. Mean gange ændring ± SEM, n = 3, * p 0,05. (B) Matrigel invasion assay af SKOV3. DAPI-farvning af migrerede tumorceller. Repræsentative snit er vist som angivet. (A) SKOV3 ingen behandling. (B) SKOV3 + makrofager. (C) SKOV3 + makrofager + neutraliserende anti-TLR2. (D) SKOV3 + makrofager + neutraliserende anti-TLR6. (E) SKOV3 + makrofager + neutraliserende anti-TLR2 og anti-TLR6. (F) SKOV3 + makrofager + IgG1-isotypekontrol-Ab. (G) SKOV3 + EGF (100 ng /ml).

TLR2 /6 medieret udtryk for hCAP18 /LL-37 via Cyp27B1 og VDR aktivering

Cyp27B1 afhængig bioomdannelse af 25D3 til 1,25D3 er et centralt element i D-medieret vitamin hCAP18 /LL-37 udtryk [33]. For at bestemme om det tumor-induceret aktivering af TLR2 /6 forøget bioaktivitet Cyp27B1, hvilket fører til hCAP18 /LL-37 ekspression blev makrofager udsat for TLR2-TLR6 ligand Pam2CSK4, i nærvær og fravær af 25D3 medier (DMEM uden serum ). Ekspression af hCAP18 /LL-37 blev ikke påvirket, når de udsættes for 25D3 eller Pam2CSK4 uafhængige af hinanden. Imidlertid blev hCAP18 /LL-37expression induceret efter samtidig eksponering (fig. 5A). Desuden hæmning af Cyp27B1 af itraconazol blokeret TLR2 /6 aktivering og en efterfølgende stigning inhCAP18 /LL-37 mRNA niveauer (fig. 5A). Tilsætning af VDR-antagonisten ZK159222 også inhiberede induktion af hCAP18 /LL-37-ekspression som bestemt ved mRNA-niveauer (fig. 5A). Dernæst vi co-dyrkede primære makrofager og SKOV3-CM (uden serum) i nærværelse af en række 25D3 koncentration, og niveauer af hCAP18 /LL-37-mRNA blev målt ved qPCR. I en anden makrofag /SKOV3-CM co-kultur eksperiment tilsætningen af ​​25D3 steg betydeligt hCAP18 /LL-37-mRNA-niveauer på en dosisafhængig måde (fig. 5B). Det er bemærkelsesværdigt, at SKOV3-CM uden HS ikke inducerede ekspression af hCAP18 /LL-37 (fig. 5B) på grund af utilstrækkelig vitamin D i dyrkningsmedier [24], [33]. Disse resultater antyder derfor, at tumor-induceret aktivering af TLR2 /6 i humane makrofager udløser hCAP18 /LL-37-ekspression. Desuden data understøtter denne opregulering er afhængig af Cyp27B1 og VDR medieret endogene produktion af 1,25D3.

(A) Human makrofager blev forbehandlet med VDR antagonisten ZK159222 (10

-7 M) eller den Cyp27B1 antagonisten itraconazol (10

-7 M) i 2 timer og derefter stimuleret med TLR2 /6 ligand Pam2CSK4 (100 ng /ml) i nærvær eller fravær af 25D3 (10

-6 M) (DMEM uden serum) i 24 timer. Ekspression af hCAP18 /LL-37 mRNA blev bestemt som beskrevet i figur 3. (B) Regulering af hCAP18 /LL-37-genet på stimulering med 25D3 i DMEM (uden serum) eller SKOV3-CM (uden serum). Mean fold ændring ± SEM, n = 3, * p. 0,05

Tumor-udskilt versican V1 aktiverer TLR2 og TLR6 at fremkalde hCAP18 /LL-37-ekspression i makrofager

Som angivet ovenfor, co-kultur af makrofager /SKOV3-celler aktiveret TLR2 /6 og dermed øget hCAP18 /LL-37-ekspression i makrofager. Disse resultater antyder ubestemte opløselige faktorer produceret af SKOV3-celler medierer denne proces. Kim et al. viste, at versican V1, en makrofag aktivator, der fungerer gennem TLR2 og dens co- receptorer TLR6 og CD14, er op reguleret i mange humane tumorer, herunder kræft i æggestokkene og lungekræft, og forbedrer lunge tumor metastatisk vækst [25]. For at bestemme om versican V1 kunne være den opløselige faktor ansvarlig for TLR2 /6-aktivering observeret her undersøgte vi versican V1 ekspressionsniveauer i tumorceller co-dyrket med makrofager. Figur 6A viste versican V1 proteinekspression blev forøget i totale cellelysater af SKOV3, HO-8910, OV-90, og 3AO celler, når de co-dyrket i 24 timer. For at undersøge niveauet af versican V1 sekretion fra ovarietumorceller inkuberede vi SKOV3, HO-8910, OV-90, og 3AO celler med konditioneret medium fra makrofager (M-CM) i 24 timer. ELISA-analyser blev udført for at bestemme tilstedeværelsen af ​​secerneret versican V1 i cellemedium.