PLoS ONE: Påvisning af K-ras mutationer i Forudsigelse Effekt af epidermal vækstfaktor receptor tyrosin kinase (EGFR-TK) Inhibitor i patienter med metastatisk colorectal Cancer

Abstrakt

epidermal vækstfaktor receptor tyrosin kinase (EGFR- tk) inhibitorer er nyttige ved behandling af forskellige avancerede humane cancere; men deres kliniske effekt varierer. Denne undersøgelse opdaget

K-ras

mutationer til at forudsige effekten af ​​EGFR-TK-hæmmer cetuximab behandling på kinesiske patienter med metastatisk kolorektal cancer (mCRC). I alt 87 patienter med metastatisk colorectal cancer blev behandlet med cetuximab i 2-16 måneder, i kombination med kemoterapi mellem august 2008 og Juli 2012, og vævsprøver blev anvendt til at detektere

K-ras

mutationer. Dataene viste, at

K-ras

mutation fandt sted i 27/87 (31%). Målet svarprocenter og sygdomsbekæmpelse sats i

K-ras

vildtype og mutant patienter var 42% (25/60) versus 11% (3/27) (p 0,05) og 60% (36 /60) versus 26% (7/27) (p 0,05), hhv. Patienter med vildtype

K-ras

betydeligt højere median havde overlevelsestid og progressionsfri overlevelse, end patienter med muteret

K-ras Hotel (21 måneder versus 17 måneder, p = 0,017 ; 10 måneder versus seks måneder, p = 0,6). Disse resultater tyder på, at en høj frekvens af

K-ras

mutationer forekommer i kinesiske FRK patienter, og at

K-ras

mutation er forpligtet til at vælge patienter til berettigelse til cetuximab. er behov for yderligere prospektive undersøgelser ved hjælp af en stor stikprøve for at bekræfte disse foreløbige resultater

Henvisning:. Li Z, Liu XW, Chi ZC, Sun BS, Cheng Y, Cheng LW (2015) Påvisning af

K -ras

Mutationer i Forudsigelse Effekt af epidermal vækstfaktor receptor tyrosin kinase (EGFR-TK) Inhibitor i patienter med metastatisk kolorektal cancer. PLoS ONE 10 (5): e0101019. doi: 10,1371 /journal.pone.0101019

Academic Redaktør: Laszlo Buday, Ungarsk Academy of Sciences, UNGARN

Modtaget: 27. september 2013; Accepteret: Juni 2, 2014, Udgivet: 7. maj 2015

Copyright: © 2015 Li et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering: Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er den tredje mest almindeligt diagnosticeret kræft i verden og er en af ​​de mest betydelige sundhedsproblemer i Kina [1]. Selvom forekomsten af ​​CRC bruges til at være lavere i Kina end i de vestlige lande, er den steget hurtigt i de senere år [2]. Kirurgi er den bedste behandling mulighed for CRC, ligesom de fleste andre kræftformer, men metastaserende CRC behov kombinationsbehandling, såsom kirurgi og kemoterapi eller target terapi. I løbet af de seneste årtier, har 5-fluorouracil (5-FU) regimer produceret median overlevelse på ca. 12 måneder for avanceret CRC, mens calciumfolinat (CF) plus 5-Fu forlænger median overlevelse på 14 måneder [3]. Desuden oxaliplatin og irinotecan har øget median overlevelse af patienter til mere end 20 måneder [4]. Senest målrette terapien, herunder anti-epidermal vækstfaktorreceptor-tyrosinkinase (EGFR-TK) har vist sig at forbedre den samlede overlevelse af patienter med vildtype-KRAS (v-Ki-ras2 Kirsten rotte sarkom viral onkogen homolog) metastaserende CRC [ ,,,0],5]. Men anti-EGFR-TK-behandling med gefitinib, erlotinib eller cetuximab fremstiller forskellige resultater i forskellige menneskelige kræftformer. Årsagen kan være, fordi anti-EGFR-behandling af patienter med muterede

K-ras

ikke blot kan være ineffektiv, men også skadelig [5]. Således har 2011 retningslinjer fra National Comprehensive Cancer Network (NCCN) anbefalede cetuximab som første-line behandling for patienter med vildtype

K-ras

siden EGFR og

K-ras

mutationer er eksklusive [6].

K-ras

gen koder for et 21 kDa-protein, som er en GTP /GDP-bindende protein med GTPase aktivitet og er involveret i transduktion af mitogene signaler at linke receptor tyrosinkinase aktivering til nedstrømseffektorer. Efter BNP binder til p21 RAS protein, vil det konvertere det til en inaktiv form, mister sin funktion for signaltransduktion. Mutationer af ras-genet normalt medføre konstitutiv aktivering af RAS GTPase, hvilket fører til aktivering af de nedstrøms signalveje og resulterer i celletransformation og tumorigenese [7-9]. I CRC, mere end 90% af

K-ras

mutationer forekommer i

K-ras

exon 1 codon 12 og codon 13 [7,8].

Cetuximab er et kimært muse /humant monoklonalt antistof mod EGFR-TK og udvikling og anvendelse af cetuximab har forbedret overlevelse FRK patienter. Tidligere data viste, at effekten af ​​cetuximab stramt var forbundet med

K-ras

mutationer, så den amerikanske Food and Drug Administration anbefales, at patienter skal gennemgå

K-ras

mutation analyse før modtagelse cetuximab behandling . Men ikke alle patienter med vildtype

K-ras

vil drage fordel af cetuximab behandling, da der ikke var nogen sammenhæng mellem EGFR og cetuximab effekt. Den samlede svarprocent på patienter med vildtype

K-ras

til cetuximab er kun 40-60%, men svarprocenten af ​​patienter med

K-ras

mutationer var kun 10% eller mindre [10,11], således, i denne undersøgelse, vi har registreret

K-ras

mutationer til at forudsige effekten af ​​EGFR-TK-inhibitor cetuximab i kinesiske patienter med metastatisk colorectal cancer.

Materialer og metoder

patienter

i denne undersøgelse, vi rekrutteret i alt 87 patienter med histologisk bekræftet mCRC i Jilin provinsen Cancer Hospital mellem januar 2008 og august 2010, som blev behandlet med ugentlig cetuximab (400 mg /m

2 som en initial støddosis, og 250 mg /m

2 efterfølgende dosis) i kombination med kemoterapi (standard dosis). Konkret 55 patienter fik cetuximab plus oxaliplatin kemoterapi og yderligere 32 patienter fik cetuximab plus irinotecan-baseret kemoterapi for 2-16 måneder. Cetuximab blev administreret som første linie behandling i alle 87 patienter ugentlige indtil sygdomsprogression eller i slutningen af ​​denne undersøgelse. Den Cancer Hospital i Jilin provinsen review bestyrelse godkendte denne undersøgelse og skriftlige informerede samtykke blev opnået fra alle fag. Dog blev patienterne udelukket fra dette studie, hvis de ikke havde modtaget postoperativ kemoterapi, eller hvis de var 25 eller 80 år.

Evaluering af behandlingsrespons og overlevelse af patienter

Behandlingsrespons blev anslået hver anden måned computertomografi (CT) af stedet for metastase (leveren og lungen) ifølge til svar evalueringskriterier i solide tumorer (RECIST) [12]. Patienter blev kategoriseret som en komplet respons (CR), partielt respons (PR), stabil sygdom (SD) eller progressiv sygdom (PD). Den objektive responsrate blev defineret som (CR + PR) /Total, mens sygdomskontrolrate den blev defineret som (CR + PR + SD) /Total. Samlet overlevelse blev defineret som tiden fra histopatologisk diagnose til død uanset årsag. Den stabil sygdom tiltalt efter behandlingen, vil sygdommen vare ved i mindst fire uger uden signifikant ændring i tumor læsion. Den sidste opfølgning af disse patienter var i juli 2012. Men alle emner i dette studie havde stadie IV sygdom og hvis sygdommen skred frem, ville behandlingen med cetuximab stoppes. Således studie præsenterer progressionsfri overlevelsesrater data

DNA-ekstraktion og detektion af K-ras-mutationer

Paraffin blokke fra tumorvæv blev re-vurderet ved hjælp af H . E-farvede vævssnit til sikre, at det samlede antal af tumorceller var ens for forskellige prøver. Udvalgte vævssnit fra CRC patienter indeholder en høj andel af tumorceller (typisk ≥ 60%), blev identificeret ved tre erfarne patologer. Efter dette blev genomisk DNA ekstraheres derefter fra tre 10 um tykke sektioner af hver tumor prøve ifølge protokoller tidligere [13] beskrevne. Kort fortalt blev vævssnittene afparaffineret i xylen, vaskes i absolut ethanol, og inkuberet ved stuetemperatur med 150 pi digestionspuffer (1 mg /ml proteinase K, 0,05 M Tris-HCI, pH 8,5; 1 mM ethylendiamintetraeddikesyre; 0,5% Tween 20; 2% natriumdodecylsulfat) i 24 timer. Den næste dag blev reaktionerne centrifugeret ved 15 000 g i 15 minutter, og DNA blev ekstraheret ved anvendelse af en QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Tyskland) ifølge producentens instruktioner. Efter dette blev DNA-koncentrationen spektrofotometrisk vurderes under anvendelse af en bølgelængde på 280/260 nm og justeret til en slutkoncentration på 100 ug /ml og opbevaret ved -20 ° C indtil anvendelse.

For at detektere

K -ras

mutationer blev polymerasekædereaktion-single konformationspolymorfisme (PCR-SSCP) udføres ved hjælp af primere og en PCR-kit (Takara Bioteknologi (Dalian) Co. Ltd, Dalian, Kina). Kort fortalt blev en 50-pi PCR blanding fremstillet for hver prøve, der indeholdt 2 pi genomisk DNA, 1 pi 10 pmol /l af hver primer og 25 pi forblanding (1,5 U Takara Taq polymerase, 10x PCR-buffer, 3,0 mmol /l Mg2 +, 0,4 mmol /l deoxynucleotidetriphosphate). Primerne til påvisning

K-ras

mutationer ved kodon 12 og 13 var 5′-AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATA-3 ‘og 5′-CTGTATCAAAGAATGGTCCTGCAC-3’, som tidligere [14] beskrevne. PCR blev udført på en 7900HT Hurtig Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) med en indledende denatureringstrin ved 94 ° C i 5 minutter, efterfulgt af 30 cykler af 94 ° C i 30 sek, 60 ° C i 30 sek og 72 ° C i 30 sek, en endelig 72 ° C forlængelse i 5 minutter, og derefter opbevaret ved 4 ° C uendeligt. Derefter blev PCR-produkterne separeres på 1,5% agarosegeler og oprenset ved anvendelse af et QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Venlo, Holland) og sendes til DNA-sekventering analyse af

K-ras

mutationer på Shanghai Generay Biotech Co Ltd (Shanghai, Kina).

Statistisk analyse

Sammenhængen mellem

K-ras

mutationer og respons på cetuximab behandling blev analyseret ved hjælp af Fishers eksakte test. Kaplan-Meier kurver og Log-rank-test blev anvendt til at analysere sammenhængen mellem

K-ras

mutationer og den samlede overlevelse (OS) og progressionsfri overlevelse (PFS) af patienterne. Cox proportional hazard model blev anvendt til at bestemme de faktorer relateret til den samlede overlevelse. Statistisk analyse blev udført ved anvendelse af SPSS 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). P. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

I denne undersøgelse, vi behandlede i alt 87 FRK patienter med cetuximab plus oxaliplatin-baserede (55 patienter) eller irinotecan-baseret (32 patienter) kemoterapi for 2 til 16 måneder. Tumorvævene blev udsat for opdagelse af

K-ras

mutationer. Vi fandt 27 patienter med en muteret

K-ras

og de overordnede

K-ras

mutation sats var 31%. De detaljerede patientkarakteristika er vist i tabel 1.

De patienter med vildtype

K-ras tumor

havde bedre ORR og DCR end patienter med muteret

K -ras tumor

, dvs DCR, 60% vs. 26% (χ

2 = 23,582, p 0,05), ORR, 42% vs. 11% (χ

2 = 24,669, p 0.05, tabel 2), hvilket indikerer, at detektion af

K-ras

mutation kan forudsige respons af patienterne til cetuximab og kemoterapi. Blandt 32 tilfælde modtager irinotecan, ni tilfælde havde

K-ras

mutation, mens der blandt 55 sager, der modtager oxaliplatin, 18 tilfælde havde

K-ras

mutation; der var imidlertid ingen signifikant forskel på

K-ras

mutation mellem patienter, der fik irinotecan og patienter oxaliplatin (p 0,05, tabel 3). Desuden patienter behandlet med cetuximab plus irinotecan kemoterapi havde bedre ORR og DCR end patienter behandlet med cetuximab plus oxaliplatin kemoterapi, dvs DCR, 66% vs. 40% (χ

2 = 13,569, p . 0,05, tabel 3)

Desuden fandt vi, at den mediane overlevelse var 21 måneder i patienter med vildtype

K-ras

, mens den mediane overlevelse var 17 måneder hos patienter med muteret

K-ras

. Denne forskel var statistisk signifikant (χ

2 = 5.703, P = 0,017, Fig 1). Den progressionsfri overlevelse var 10 måneder hos patienter med vildtype

K-ras

, mens progressionsfri overlevelse var 6 måneder hos patienter med muteret

K-ras

. Denne forskel var ikke statistisk signifikant.

Desuden mediane overlevelse var 22 måneder hos patienter behandlet med cetuximab plus irinotecan-baseret kemoterapi, mens den mediane overlevelse var 18 måneder hos patienter behandlet med cetuximab plus oxaliplatin kemoterapi Denne forskel var også statistisk signifikant (χ

2 = 3,957 p = 0,047, fig 2). Efter CT og nuklear magnetisk resonans, de FRK patienter fik cetuximab plus irinotecan eller cetuximab plus oxaliplatin kemoterapi og fire FRK patienter blev vist i figur 3. Specifikt i tilfælde 1, CR (fuldstændig reaktion) Patienten blev behandlet med fire cyklusser af cetuximab plus irinotecan-baseret kemoterapi. Case 2 var en CR patient, som blev behandlet med tre cyklusser af cetuximab plus oxaliplatin kemoterapi. Case 3 var en PR (delvis respons) patient, som fik fire cyklusser af cetuximab plus irinotecan-baseret kemoterapi. Case 4 var også en PR patient, som blev behandlet med fire cyklusser af cetuximab plus oxaliplatin kemoterapi. Leveren fokus forsvandt i sag 1 og 2, og fokus var stærkt reduceret i sag 3 og 4. univariat analyse viste, at

K-ras

mutationer og behandling valg var associeret med dårlig prognose i CRC patienter (

s

= 0,017 og

s

= 0,047, henholdsvis), mens den multivariate analyse viste, at

K-ras

mutation, behandling valg, og dårlig tumor differentiering var uafhængige faktorer for overlevelse af patienter med mCRC (

s

= 0,004,

s

= 0,006 og

s

= 0,015, henholdsvis; tabel 4).

disse patienter blev behandlet med irinotecan-baseret (n = 32) og oxaliplatin-baserede (n = 55).

Case 1 er en CR patient, som blev behandlet med fire cyklusser af cetuximab plus irinotecan-baseret kemoterapi. Case 2 er en CR patient, som blev behandlet med tre cyklusser af cetuximab plus oxaliplatin kemoterapi. Case 3 er en PR-patient, som fik fire cyklusser af cetuximab plus irinotecan-baseret kemoterapi. Case 4 er også en PR-patient, som blev behandlet med fire cyklusser af cetuximab plus oxaliplatin kemoterapi. CR, helt reaktion; PR, partielt respons.

Diskussion

I den aktuelle undersøgelse, vi har registreret

K-ras

mutationer i tumorvæv at forudsige respons af kinesisk patienter med metastatisk colorectal cancer til cetuximab plus oxaliplatin eller irinotecan-baseret kemoterapi. Vi fandt, at patienter med vildtype

K-ras

efter disse behandlinger havde bedre ORR og DCR end patienter med muteret

K-ras Hotel (42% vs. 11% og 60% vs. 26%, hhv.) Desuden fandt vi, at median overlevelsestid for patienter med vildtype

K-ras

var 21 måneder sammenlignet med 17 måneder hos patienter med muterede

K-ras

(p = 0,017). Hertil kommer, at median overlevelsestid af patienter behandlet med Cetuximab plus irinotecan kemoterapi var 22 måneder sammenlignet med 18 måneder hos patienter behandlet med cetuximab plus oxaliplatin kemoterapi (p = 0,047). Denne undersøgelse understøtter den observation, at påvisning af

K-ras

mutation er en nyttig indikator for anti-EGFR-TK-behandling i metastatisk kolorektal cancer. Yderligere studier bør undersøge den underliggende molekylære mekanisme bag muterede

K-ras

i progressionen af ​​fremskreden kolorektal cancer.

Tyktarmskræft ofte metastaserer til leveren, hvilket fører til vanskeligheder med at kontrollere det klinisk . I vores undersøgelse, der var 65 af 87 patienter (74,7%), der havde metastatisk sygdom i leveren efterfulgt af metastase til lungen, ovariet, og hud. Uden progressiv behandling, patienter med metastatisk sygdom har en meget dårlig prognose [15]; således vil fremskridt i behandlingen af ​​metastatisk kolorektal cancer redde liv og forbedre livskvaliteten for patienter. I denne undersøgelse, vurderer vi

K-ras

mutationer i 87 FRK patienter til at forudsige respons af patienter til cetuximab plus oxaliplatin eller irinotecan-baseret kemoterapi. Vi fandt 27 patienter med muteret

K-ras Hotel (31%), hvilket var i overensstemmelse med dem i de vestlige CRC patienter [16] og kinesiske CRC patienter [17]. Tidligere undersøgelser har vist, at patienter med vildtype

K-ras

havde et bedre svar på cetuximab behandling end dem med muteret

K-ras

[10,11]. I den aktuelle undersøgelse, vi bekræfter også disse resultater [10,11,18]. På et molekylært niveau, kan andre ikke-tyrosinkinaser også aktivere EGFR signalvejen, der kan forklare, hvorfor

K-ras

mutation er nyttigt, men ikke perfekt forudsige resistens over for cetuximab. Desuden har vi, eller andre, bare opdaget de mest almindelige mutationer i

K-ras

(dvs. exon codon 12 og 13), men andre

K-ras

også kan spille en rolle i anti-EGFR-TK-resistens. Desuden er det nødvendigt at kontrollere, om de undertyper eller site af metastatisk kolorektal cancer spiller en rolle som reaktion på anti-EGFR-TK-terapi, ligesom cetuximab.

Desuden den aktuelle undersøgelse kombineret cetuximab med oxaliplatin- eller irinotecan-baseret kemoterapi, hvilket også kan påvirke respons af patienterne. Forskellen viser vi i denne undersøgelse kan skyldes stoffet samspillet mellem cetuximab og irinotecan eller oxaliplatin; derfor er yderligere undersøgelse er nødvendig for at afklare dette spørgsmål. Men Van Cutsem et al. undersøgt kemoterapi resultat i K-

ras

patienter med metastatisk colorectal cancer og viste, at der ikke var nogen signifikant forskel i progressionsfri overlevelse eller total overlevelse mellem patienter, der fik cetuximab plus irinotecan, fluoruracil og leucovorin (FOLFIRI) eller FOLFIRI alene [19]. Derfor er det muligt, at en anden kemoterapi kan føre til forskellige reaktioner i patienter.

Aktiveret K-ras-protein interagerer med phosphotidylinositol-3-kinase (PI3K) for at aktivere dens downstream effektorer (såsom mammalian target of rapamycin ) til indirekte modulere celleoverlevelse. Gennem det BRAF /mitogen-aktiveret kinase (MAPK) pathway, aktiveret K-ras-protein påvirker også celleproliferation [20]. Til dato har et antal målrettede behandlinger mod EGFR signalering blevet etableret og cetuximab er et humant /muse kimært IgG1 monoklonalt antistof der binder til det ekstracellulære domæne af EGFR og inhiberer EGFR-medieret signalering [21]. En nylig undersøgelse viste, at cetuximab behandlingen var effektiv i vildtype

K-ras

og EGFR kinesisk CRC patienter, som gav tegn på effekt-forudsigelse af EGFR målrette terapeutiske strategier [22,23].

Men der skal meget mere til en vellykket cetuximab af avancerede CRC patienter i klinikken. Vi kunne først vurdere

K-ras

mutationer til at vælge patienter er berettiget til cetuximab behandling og derefter undersøge, hvordan muteret

K-ras

antagoniserer cetuximab effekt eller omgår EGFR-TK-hæmning. En hidtil ukendt lægemiddelkombination kan være nødvendig for at undertrykke aktiviteten af ​​muterede K-ras-protein.