PLoS ONE: Etablering og karakterisering af en Highly tumordannende og Cancer Stem Cell beriget kræft i bugspytkirtlen cellelinie som en veldefineret Model System

Abstrakt

Standard kræftceller ikke modellere intratumoral heterogenitet situationen tilstrækkeligt. Klonselektion fører til en homogen population af celler ved genetisk drift. Heterogenitet af tumorceller, men er særlig kritisk for terapeutisk relevante studier, eftersom det er en forudsætning for at erhverve lægemiddelresistens og gentagelse af tumorer. Her beskrives isoleringen af ​​et stærkt tumorigen primær pankreatisk cancercellelinie, kaldet JoPaca-1 og dets detaljeret karakterisering på flere niveauer. Implantation af så få som 100 JoPaca-1-celler i immundefekte mus gav anledning til tumorer, der var histologisk meget lig den primære tumor. Den høje heterogenitet JoPaca-1 blev afspejlet af forskellige cellemorfologi og et væsentligt antal kromosomafvigelser. Sammenlignende hel-genom sekventering af JoPaca-1 og BxPC-3 afsløret mutationer i gener ofte ændret på kræft i bugspytkirtlen. Undtagelsesvis høj ekspression af cancer stamceller markører og en høj klonogen potentiale

in vitro

in vivo

blev observeret. Alle disse egenskaber gør denne cellelinje en særdeles værdifuld model til at studere biologi og farmaceutiske virkninger på kræft i bugspytkirtlen

Henvisning:. Fredebohm J, Boettcher M, Eisen C, Gaida MM, Heller A, Keleg S, et al. (2012) Etablering og karakterisering af en Highly tumordannende og Cancer Stem Cell Beriget kræft i bugspytkirtlen cellelinie som en veldefineret Model System. PLoS ONE 7 (11): e48503. doi: 10,1371 /journal.pone.0048503

Redaktør: Nathan A. Ellis, University of Illinois i Chicago, USA

Modtaget: Juli 5, 2012; Accepteret: September 26, 2012; Udgivet: November 12, 2012 |

Copyright: © 2012 Fredebohm et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejdet blev støttet af det tyske ministerium for Uddannelse og Forskning (BMBF) som en del af NGFN PaCaNet konsortiet (BMBF-01GS08117). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Jörg Hoheisel og Jörg Tost fungere som redaktører for PLoS ONE. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer ..

Introduktion

Kræft i bugspytkirtlen er en af ​​de mest aggressive former for kræft. Dødeligheden er næsten identisk med forekomst. Med en fem-års overlevelse på mindre end 5%, det er den fjerde mest almindelige årsag til cancer-relaterede dødsfald i den udviklede verden [1]. Årsager til dårlig prognose er den sene kliniske diagnose [2] og tumor modstand mod standard [3] kemoterapi. Med omkring 90% af tilfældene, pancreatisk duktalt adenokarcinom (PDAC) er den mest almindelige form og ansvarlig for den høje dødelighed; andre, sjældne cancer undertyper, såsom cystiske tumorer, er mindre dødelig. PDAC antages at hidrøre fra epitelceller i pancreas gangsystemet [4]. Fordeling af tumorceller i maligne væv er typisk diffus og indeholder områder med varierende grader af histologisk differentiation. Det er også kendetegnet ved en samlet heterogen tumorcellepopulation (intratumoral heterogenitet) [5], [6].

Et betydeligt antal PDAC cellelinier af forskellige karakteristika er blevet etableret og give en cellulær kilde til at undersøge molekylære aspekter af denne ødelæggende sygdom (omfattende revideret af Ulrich et al. [7]). Men dyrkning cellelinjer under veldefinerede betingelser uundgåeligt fører til udvælgelsen af ​​subpopulationer over tid. Således behøver standard cellelinjer ikke modellere situationen for intratumoral heterogenitet, da klonselektion har fundet sted i mange passager

in vitro

. Dette fører til en homogen population af celler ved genetisk drift [8]. Tværtimod primære cellelinjer meget ligner heterogenitet af den primære tumor, og giver derfor en god ressource for cellekultur eksperimenter.

in vivo

heterogenitet af tumorceller er især kritisk for eksperimenter afprøver effekten af ​​kemoterapi, fordi heterogenitet giver grundlaget for udvælgelsen af ​​resistente underpopulationer, som igen danner grundlag for erhvervet resistens narkotika og gentagelse af tumor [3], [9]. Blandt populationen af ​​resistente celler, cancer stamceller spille en særlig vigtig rolle, da de har evnen til at forny sig selv [3] og er i stand til at genbefolke tumoren ved det primære sted eller fører til metastase-dannelse på fjerne steder [10].

Kræft stamceller eller tumor initiering celler, der kører tumor progression har fået en masse opmærksomhed i de seneste årtier [11], [12], [13]. For kræft i bugspytkirtlen, har flere molekylære markører blevet foreslået at være karakteristisk for cancer stamceller. Blandt disse er udtryk for triplet CD44, CD24 og ESA [14], celleoverfladen protein CD133 (prominin I) [15], [16], [17], og – for nylig – øget aktivitet af aldehyd dehydrogenase 1 (ALDH1 ) [18]. Ekspression af ALDH1 er også blevet korreleret med invasion og migration samt mesenkymale funktioner af tumor [19]. Desuden er det blevet forbundet med dårlig samlede overlevelse. Interessant, men to modstridende undersøgelser viser, at høj [19] eller lav [20] udtryk for ALDH1, har en negativ indvirkning på patientens overlevelse. Et andet kendetegn for tumorinitiering er evnen til at danne sfæroider eller tumor sfærer i suspension [21], [22]. Cancerstamceller antages også at bidrage til udviklingen af ​​lægemiddelresistens. Samtidig er det blevet vist, at indholdet af CD133 udtrykkende celler kan beriges med gemcitabin [23], [24], [25] antyder en central rolle i denne CSC markør i gemcitabin modstand.

Her rapporterer vi isolering og karakterisering af en ny primær cellelinie afledt direkte fra en human tumor prøve af en patient med pancreas ductus adenocarcinom. Denne cellelinie, opkaldt JoPaca-1, udviser en høj variation i morfologi og bærer mange kromosomforandringer. Patologisk muse-xenotransplantater og den primære tumor har en høj grad af lighed med hensyn til diffusiv differentiering og infiltration af omgivende pancreas og ikke-pancreasvæv. JoPaca-1 celler udtrykker tumor markør mesothelin og flere cytokeratiner. Bortset fra sin høje heterogenitet, formentlig det vigtigste element i denne nye cellelinie er dens høje indhold af tumorfremkaldende celler som demonstreret af

in vivo

begrænsende fortynding assay og høje ekspressionsniveauer af kræft stamceller markører. I betragtning af dens tætte lighed med den oprindelige tumor og i kombination med den grundige molekylær karakterisering, cellelinien giver en fremragende ressource for enhver form for celle-baseret snarere end væv-baseret analyse.

Materialer og metoder

Etik erklæring

informeret skriftligt samtykke blev opnået fra patienten. Etisk godkendelse blev opnået fra den etiske kommission af det medicinske fakultet på University Hospital of Heidelberg, Tyskland. Alle dyr pleje og procedurer følges tyske lovbestemmelser og blev tidligere er godkendt af statslige revision bestyrelse delstaten Baden-Wuerttemberg, Tyskland.

Cell isolation

Frisk væv blev opnået fra en 46- årig mandlig patient, der lider af kræft i bugspytkirtlen, der gennemgik en pylorus-bevare pancreatecto-duodenectomy. Under operationen blev en prøve taget fra den fjernede tumor og gælder lagret i Hanks balancerede saltopløsning (HBSS, H6648, Sigma Aldrich, Taufkirchen, Tyskland) ved 4 ° C i 12 timer før videre behandling. Vævsprøven blev derefter skåret i stykker på ca. 5 mm i diameter og overført til en kultur-kolbe indeholdende Hams /F-12-medium (21.765-029, Life Technologies, Darmstadt, Tyskland) suppleret med serum udskiftning reagens (S0638, Sigma-Aldrich) . Vævsstykkerne knyttet til substratet, og celler voksede ud efter en uge og danner klynger omkring vævsfragmenterne. Fibroblaster og stjerneformede celler blev fjernet ved to runder af seriel enzymatisk løsrivelse med 0,05% trypsin /EDTA (25.300.054, Life Technologies). Den resulterende population af tumorceller blev frosset ved passage nummer fire og opbevaret i portioner. For eksperimenterne beskrevet her, blev JoPaca-1 celler anvendes i passager 6 til 19. Immortalisering af de isolerede celler ikke var nødvendigt.

Cell kultur

veletablerede bugspytkirtelkræft cellelinjer MiaPaCa -2, MDAPanc-28, BxPC-3, AsPC-1, og Capan-1 blev opnået fra ATCC (Rockville, MD, USA). Derudover FamPAC blev venligst stillet til rådighed af professor Eisold [26] og HDPE C7 celler af professor Francisco Real (spansk National Cancer Research Centre, CNIO) [27]. BxPC-3 blev bekræftet af den tyske samling af mikroorganismer og cellekulturer (DSMZ, Braunschweig, Tyskland). Alle cellelinjer var fri for mycoplasma, vira og cellelinje forurening som testet ved PCR [28]

Celler blev dyrket i standard medium og kosttilskud, der blev opnået fra Life Technologies, Darmstadt, Tyskland, medmindre andet er angivet.: JoPaca-1 i Isocove modificerede Dulbeccos medium (IMDM), 10% føtalt kælver serum (FCS) og 1% penicillin-streptomycin (P /S) (katalog nr 21056.); BxPC-3 i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium, 10% FCS og 1% PS (katalog nr 21875.); HDPE c7 i keratinocyt serumfrit medium (KSFM), 0,15 ng /ml epidermal vækstfaktor receptor, og 25 ug /ml oksehypofyseekstrakt (katalog nr. 17.005.075) [29]. For tumor sfære dannelse, JoPaca-1-celler blev dyrket i Hams /F12-medium suppleret med 20 ng /ml basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF, F0291, Sigma-Aldrich, München), 1 × B-27 kosttilskud (kat. Nr . 0080085-SA), 2 mM L-glutamin (katalog nr. 25.030.024) og 1% P /S i lave montagepladerne (katalog nr. 3473, Corning, Amsterdam, Holland). Celler blev delt i et forhold på 1 til 10, medmindre andet er anført. Cellelevedygtighed efter behandling med gemcitabin (G6423, Sigma-Aldrich) blev bestemt ved resazurine assay [30]. Til langvarig behandling med gemcitabin blev JoPaca-1-celler i passage 10 udsat for en periode på 72 timer for stigende koncentrationer af lægemidlet: 10, 15, 20 og 25 nM. Celler blev delt 1/3 efter hver runde af behandling og sammenlignet med en kontrol i passage 13 til ekspression af CD133. Billeder af forældrenes JoPaca-1 og sub-kloner i kultur blev taget på et inverteret mikroskop (DM Irbe, Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland) udstyret med en CCD-kamera (Progressive Scan CV-M1, JAI, Frankfurt am Main, Tyskland). Scale barer blev tilføjet i ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA) ved at beregne målte pixel størrelser

Cytogenetik -. Flerfarvet fluorescens

in situ

hybridisering (MFISH)

JoPaca -1 celler blev behandlet med 10 ng /ml vinblastin ved 37 ° C, 5% CO

2 i 4 timer arrestere dem i metafase. Metafasespredninger blev fremstillet i overensstemmelse med standardprotokoller [31]. Kort sagt, blev suspenderede celler behandlet med 75 mM KCI i 20 minutter ved 37 ° C og fikseret med iskold Carnoys opløsning (methanol:acetic syre = 3:01) i tre vasketrin. Opløsningen af ​​fikserede celler blev droppet fra 1 meter på en vippet objektglas som tidligere var blevet befugtet med 70% ethanol. MFISH blev udført ved anvendelse af flerfarvede probekit 24XCyte (Metasystems, Altlussheim, Tyskland) ifølge producentens instruktioner. Hybridiseret metafasespredninger blev analyseret ved hjælp af en computer-assisteret fluorescens mikroskop (Axioplan 2, Zeiss, Göttingen, Tyskland) udstyret med passende filtersæt. Billeder blev optaget med et CCD-kamera (Photometrics, Tucson, AZ, USA) og analyseret ved hjælp af vitser SpectraVysion ™ Software (Vysis, nu distribueres gennem Applied Imaging).

Klonogen potentiale og tumourgeneity

In vitro

-begrænsende fortynding assay.

JoPaca-1-celler blev podet i en 96-brønds plade i en en-til-en fortyndingsserie starter ved 125 celler per brønd, hver fortynding i 16 replikater. Mediet blev ikke ændret for at muliggøre autokrin signalering. Efter 10 dage blev brøndene viser tydelige kolonier talt. Efter 15 dage blev kolonier viser forskellige morfologiske fænotyper fotograferet.

In vivo

-begrænsende fortynding assay.

Indledende xenograft blev udført ved at injicere 1 mio celler i NOD. cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl (NOD /SCID /γ eller NSG) mus. For at vurdere in vivo-tumorfremkaldende i JoPaca-1, 104, 103 og 102 celler, henholdsvis blev injiceret i 70 pi Matrigel (2 mg /ml) (BD, Heidelberg, Tyskland) i pancreas legeme NSG mus. Vellykket transplantation af tumorer og efterfølgende vækst blev overvåget ved regelmæssig palpering af implantationsstedet.

For at kvantificere klonogene potentiale og tumor-initierende frekvens blev data analyseret af en regression-fit algoritme (ELDA) [32].

H anti-cytokeratin 19 anvendes på 1:50; anti-cytokeratin AE1 /AE3 (kode M3515, DakoCytomation) anvendes ved 1:300; anti-CD133 /1 (AC133) (130-090-422, Miltenyi Biotech) anvendes på 1:50; og en universel negative kontrol indeholder muse IgG (IS750, DakoCytomation), der anvendes ved 1:02 fortynding. Objektglassene blev inkuberet ved 4 ° C i 16 timer. Til påvisning af det primære antistof, et sekundært anti-muse-antistof konjugeret med peroxidase (K4001, DakoCytomation) blev påført i overensstemmelse med producentens anvisninger. Farvereaktionen med diaminobenzodine (DAB) blev modfarvet med hæmatoxylin. Endelig blev slides ses ved hjælp af en Axioplan 2 mikroskop og billeder med en AxioCam HRc CCD-kamera (Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Tyskland). Scale barer blev tilføjet i den medfølgende AxioVision 4-softwaren.

Immunofluorescens

For immunfluorescens af mesothelin og cytokeratin 19, JoPaca-1, BxPC-3 og HDPE C7 celler blev dyrket i kultur slides (kat . 354.559, BD Biosciences), fikseret med 2% paraformaldehyd og permeabiliseret med 0,2% Triton X-100 i 5 min. Objektglas blev blokeret i phosphatbufret saltvand (PBS) med 10% bovint serumalbumin (BSA) og epitoper hentes med PBS suppleret med 10% proteinase K. IgG1 antistoffer mod mesothelin K1 (kat. Sc-33.672, Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Tyskland ) og cytokeratin 19 (klon RCK108, Code-Nr. M 0888, DakoCytomation, Hamborg, Tyskland) samt muse IgG1 (MCA928, Serotec, Puchheim, Tyskland) som en negativ kontrol blev anvendt i en fortynding på 1:50. Det sekundære antistof Alexa Fluor 488 ged anti-mus IgG1 (A-11001, Life Technologies) blev anvendt i en fortynding på 1:500. Objektglas blev monteret med vandigt medium indeholdende 4 ‘, 6-diamidin-2-phenylindol (DAPI) til kontra-plet kerner (sc-24941, Santa Cruz Biotechnology). Billeder blev taget på en bred felt mikroskop udstyret med et AxioCam CCD-kamera (Zeiss Cell Observer, Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Tyskland).

Fluorescent assisteret celle (FACS)

Angivelse af CD133 blev detekteret ved FACS (FACS Canto II, BD Biosciences, Heidelberg, Tyskland) under anvendelse af phycoerythrin konjugeret CD133 /2 (293C3) og CD133 /1 (AC133) antistoffer (Milteny Biotech, Bergisch Gladbach, Tyskland). Aktivitet af ALDH1 blev målt ved hjælp Aldefluor substrat +/- DEAB inhibitor (StemCell Technologies, Grenoble, Frankrig). ALDH-lyse celler (ALDH

br) blev påvist i FITC kanal og kompenseret mod phycoerythrin og omvendt ved hjælp individuelt mærkede celler som kontroller. Ekspression af triplet CD44 /CD24 /ESA blev testet ved hjælp af følgende antistoffer fra BD Biosciences: (. Cat 347.200) (. Cat 560.533) EpCAM (ESA) APC, CD44-PE-Cy7, CD24-FITC (kat 555.427.) . Inkubation af celler med antistoffer og substrater, FcR blokerende og vasketrin blev udført ifølge producentens anvisninger.

hele genomet sekventering

Genomisk DNA af cellelinierne JoPaca-1 (passage 8) og BxPC-3 blev ekstraheret ved anvendelse af standard protokoller. Hele genom sekventering og læse justering blev foretaget ved hjælp af en Illumina HighSeq 2000 sequencer på Centre National de Génotypage (Evry, Frankrig). Data for de øverste 17 ikke-synonyme kodning gener muteret i bugspytkirtelkræft blev opnået fra Sanger Institute katalog af somatiske mutationer i kræft hjemmeside (https://www.sanger.ac.uk/cosmic) [33]. Desuden blev tre gener medtaget fra OMIM databasen under søgeordet “kræft i bugspytkirtlen” (https://www.omim.org/entry/260350) [34]. Alle disse gener blev kontrolleret for exoniske ikke-synonyme mutationer i BxPC-3 og JoPaca-1 (tabel S2). Desuden blev ikke-kodning variationer forbundet med kræft i bugspytkirtlen fås fra genom-brede associationsstudier (GWAS) (tabel S3). Opregningen af ​​muterede og vildtype læser blev gjort ved hånden ved hjælp af Ensembl genom browser [35] og integrativ genom seeren [36] tælle hver kortlagt læst.

Sanger sekventering af

KRAS

regionen omkring codon 12 af

KRAS

blev amplificeret fra cDNA genereret fra cellelinier ved standard PCR ved hjælp Phusion polymerase (F-530, Fermentas, St. Leon-Rot, Tyskland) og de følgende primere : KRAS-F (5′-CCC CGC CAT TTC GGA CTG GG-3 ‘) og KRAS-R (5′-ACT CCT CTT GAC CTG CTG TGT CG-3’). PCR-produkterne blev sekventeret ved GATC (Constance, Tyskland) under anvendelse af primer KRAS-F.

Resultater

JoPaca-1-celler stammer fra dårligt differentieret duktalt adenokarcinom i pancreas

til isolering af primære tumorceller, blev frisk væv opnået fra en 46-årig mandlig patient, der lider af kræft i bugspytkirtlen, som gennemgik en pylorus-bevarelse pancreatecto-duodenectomy (pp-Whipple operation). Han døde fem måneder efter operationen. Den histopatologiske undersøgelse af vævet afslørede en dårligt differentieret duktalt adenokarcinom i pancreas, med tumor infiltration af duodenum, den intrapankreatiske galdegang og peripancreatic blødt væv. Perineural, lymphogenic og hematogenic tumor infiltration kan findes såvel som to lymfeknudemetastaser i 22 regionale lymfeknuder. Den TNM stadie var pT3, PN1 (2/22), G3. Klinisk var der ingen forekomst af fjerne orgel metastaser. Den primære cellelinie JoPaca-1 blev isoleret fra resekterede kræftvæv som beskrevet detaljeret i afsnittet metoder. Den resulterende population af rene tumorceller blev frosset efter fire vækst passager. Til eksperimenterne nedenfor rapporterede blev celler på 6 til 19 passager anvendes. Cellerne blev dyrket i standard cellekulturmedium IMDM suppleret med 10% FCS og 1% PS.

subkloner af JoPaca-1 afslører fænotypisk heterogenitet af forældremyndigheden befolkningens

Enkelte celler af JoPaca-1 dyrket i fuldstændig isolation gav anledning til kolonier, som udviste en varierende morfologi (fig. 1). Typisk kunne observeres to former for vækst: tæt kontakt ø-dannelse og ingen kontakt spredning (Fig 1B, C.). Cellular heterogenitet blev også afspejlet i de mange forskellige celle figurer, der blev observeret. Rund og vesikulær celler opstod som gjorde en spindel-lignende fænotype. Også kunne dannelsen af ​​lange pseudopodier ses (fig. 1D-F). Begge kan også påvises forskellige vækst- egenskaber og de forskellige celle figurer i forældrenes befolkning (fig. 1A), der angiver dens god repræsentation af de isolerede sub-kloner.

Fase kontrast præsenteres af JoPaca-1 parentale celler og subkloner viser forskellige vækstkarakteristika og morfologier. A. JoPaca-1 parental cellepopulation. B, C. To forskellige vækstegenskaber kan observeres: close-kontakt ø-dannelse (B) og ingen kontakt spredning (C). D-F. Tre forskellige celle figurer blev observeret:. Rund og vesikulær (D), spindel-lignende (E), og pseudo-pod danner (F) celler

JoPaca-1 celler er tetra- at pentaploid og genomisk ustabile

JoPaca-1 blev anholdt i metafase at studere karyotype og kromosomforandringer. Metafasespredninger på 26 celler blev analyseret. De viste en tetra- til pentaploidic karyotype med fem almindeligt observerede kromosomafvigelser (fig. 2). Det er de translokationer t (17; 5) (5; 17), t (7; 4), t (13; 12) og t (2; 9) og en inversion af kromosom 13 (I13). I alt blev 47 forskellige afvigelser observeret i de 26 karyograms. Men for de relativt hyppige afvigelser fra ovenstående fleste (38) blev kun observeret én gang. Tre andre translokationer blev fundet to gange eller tre gange (tabel S1). Y-kromosomet blev tabt i 20 ud af 26 karyograms.

Et repræsentativt karyogram af JoPaca-1 er vist her. JoPaca-1 er en tetra- til penta-ploidic cellelinie. Nedenfor oversigten billedet, er de fem mest almindeligt observerede afvigelser i 26 karyograms præsenteret. Translokationer kan identificeres ved hybridisering af forskelligt farvede prober resulterer i dobbelt-farvet kromosomer. Inversion af kromosom 13 (I13) er fusion af to q-arme på kinetochore. Y-kromosomet er ofte tabt i tumorceller som det er i denne repræsentation.

JoPaca-1 viser forøget resistens mod gemcitabin løbet BxPC-3

JoPaca-1-celler blev sammenlignet til BxPC-3 i deres svar på gemcitabin, standard first-line kemoterapeutisk behandling af kræft i bugspytkirtlen. I fravær af lægemidlet, fordoblingstiden var 28 timer for JoPaca-1 og 19 timer for BxPC-3. Under en 72 timer vækstperiode, svarer det til 3.79 celledelinger af BxPC-3 og 2,57 i JoPaca-1. For at opdele 3,79 gange, ville JoPaca-1 kræver 106 timer. Derfor er en forlænget inkubation med gemcitabin havde en stærkere virkning på cellelevedygtighed JoPaca-1 (fig. 3A). Sammenlignet med BxPC-3, JoPaca-1 udviste en væsentligt højere tolerance over for gemcitabin med en IC

50 af 28 nM sammenlignet med 11 nM for BxPC-3, selv efter halvdelen af ​​cellepopulationen undergået en ekstra runde af mitose (3.79+ 0,49 = 4,28 celledelinger = 120 h) (fig. 3b). Derfor øget resistens af JoPaca-1 er uafhængig af hastigheden for proliferation.

BxPC-3 og JoPaca-1-celler vi behandlet med stigende koncentrationer af gemcitabin i 72, 96 og 120 timer. Cellelevedygtighed blev normaliseret til de ubehandlede kontroller. Datapunkter repræsenterer gennemsnitsresultater af seks gentagne forsøg med standardafvigelser indikeret ved fejlsøjler. A. Forøgelse inkubationstid med gemcitabin resulterer i forøget cytotoksicitet for JoPaca-1. B. Cellernes levedygtighed blev sammenlignet mellem 3.79 og 4.28 celledelinger for BxPC-3 og JoPaca-1 hhv. JoPaca-1 viser en højere tolerance over for gemcitabin end BxPC-3, selv efter forlænget inkubation af 0,49 celledelinger.

JoPaca-1 celler er meget tumorgene og har øget klonogene potentiale

Til etablere klonogenisk potentiale JoPaca-1 blev celler i passage 10 talt og podet i en 1 til 1 fortyndingsrækken i to 96-brønds plader startende fra 125 celler per brønd ned til 4 celler pr. Hver fortynding blev udført 16 gange. Efter 15 dages inkubation blev brønde indeholdende forskellige kolonier talt. Computational analyse af kimtal ved hjælp af “Extreme LDA” algoritme [32] viste, at en celle i 48 (ca. 2%) var i stand til at danne en koloni (fig. 4A). Denne klonogene potentiale er ti gange højere end den etablerede cellelinie Capan-1 med 0,2% [19].

Klonogen potentiale og tumourgenicity af JoPaca-1 blev bestemt ved begrænsende fortynding assays

in vitro

og

in vivo

. A. Fortynding af celler i en plade med 96 brønde og optælling af kolonier indeholdende celler efter 10 dage føre til en klonogen potentiale 1 celle i 48 som beregnet af ELDA [32]. B. ortotopisk injektion af 10.000, 1.000 og 100 JoPaca-1 celler i 6 NOD.Cg-

Prkdc

SCID Il2rg

tm1Wjl

mus hver resulterede i dannelsen af ​​tumorer, som blev skåret ud, vejet og fotograferet. Gennemsnitlige tumorer vises.

For at etablere tumourgenicity af JoPaca-1

in vivo

, tre grupper af seks immune kompromitteret NOD.Cg-

Prkdc

scid Il2rg

tm1Wjl

mus blev injiceret orthotopisk med 10

4, 10

3, og 10

2 celler. Efter 100 dage, alle mus var stadig i live. I alt havde 11 mus dannede tumorer: 6/6 for dyrene med 10

4-celler, 4/6 med 10

3-celler og 1/6 med 10

2-celler (fig 4B.). Tumor-initierende frekvens blev estimeret ved ELDA algoritme ved 1 celle i 831 med en nedre og øvre grænse på 1 i 2114 og 1 i 327 hhv. Tumorerne blev udskåret og vejet. Tumorvægten korrelerer direkte med antallet af injicerede celler. Med 10

4 celler, den gennemsnitlige tumorvægt var 927 mg; induktion med 10

3 celler gav anledning til tumorer i 618 mg i gennemsnit. Den enkelte tumor som følge af 10

2 celler havde 300 mg.

JoPaca-1 celler invaderer omgivende normale væv og viser metastaserende potentiale in vivo

Den primære tumor havde invaderet glatte muskelvæv af den proksimale duodenum (fig. 5A). Xenotransplantattumorer blev ikke indkapslet; desuden de afslørede en invasiv foran med områder af infiltrativ tumor ekspansion i det tilstødende normale bugspytkirtlen væv (fig. 5B) Metastaser kunne observeres i en ud af tre mus under indledende forsøg, men blev ikke analyseret yderligere (fig. 5C).

Vist her er H E pletter af primær (A) og xenograft (B) vævssnit. A. glat muskelvæv i duodenum blev infiltreret af tumorceller af den primære tumor. B. Invasiv foran xenotransplantattumorer med områder af infiltrativ tumor ekspansion i det tilstødende normale bugspytkirtlen væv (pil hoveder). C. En ud af tre NSG mus udviklede metastase i indledende forsøg, når 1 mio celler blev injiceret orthotopisk (pilespidser).

Primære og xenotransplantattumorer rejst fra JoPaca-1 har meget ens histologi

Histopatologisk de xenotransplantattumorer viser en høj grad af lighed med den primære tumor. Cellulær morfologi og vækstmønstre blev samlet dårligt differentieret karakteriseret ved en enkelt cellulær eller solid vækst. Men områder af mikropapillær vækstmønstre og kanalsystem formationer blev fundet i både primær og xenograftvæv (fig. 6A). Desuden blev vandrende og invasive opførsel observeret at en tilsvarende grad. Primære og xenograft væv viste perineurale infiltration og invasion i lymfoide og blodkar (Fig 6B, CII og 11C.)

Vist her er H . E pletter af primære og xenotransplantattumorer. A. Primær og xenotransplantattumorer viser lignende differentiering fænotyper spænder fra overordnet dårlig differentiering (-) i løbet mikropapillær vækst (x) til mere differentierede kanalsystem formationer (*). B. Perineuronal invasion kan observeres i både primære og xenotransplantattumorer (pilespidser). C. Vist her er områder af tumor nekrose, afgrænsede af neutrofile granulocytter (Ci, asterisk) og tumor infiltration af lymfekar (C ii, pil hoved). D. Fordeling af stroma (S) i primær og xenograft tumorvæv. Tumorceller fra begge prøver er indlejret i desmoplastiske tumor stroma. Mens stroma i den primære tumor er dispergeret i hele tumoren, er det mere lokaliseret i xenotransplantat.

Features grund af de immunologiske karakteristika blev naturligvis mere udtalt i den primære tumor end i xenograft som NSG mus er ude af stand montering af en medfødt eller adaptiv immunreaktion. Disse immunologiske funktioner omfatter områder af tumor nekrose, der blev afgrænset af neutrofile granulocytter (fig. 6Ci) samt infiltrerende inflammatoriske celler, primært lymfocytter og granulocytter. I den primære tumor celler indlejret i desmoplastiske tumor stroma. Xenotransplantattumorer er delvist afbrudt af stromale væv samt. Her er disse områder lokaliseret og ikke som allestedsnærværende som i den primære tumor (fig. 6D).

JoPaca-1 udtrykker cytokeratiner og tumormarkør mesothelin

Immunhistokemi af cytokeratiner blev udført på primære og xenograft tumor vævssnit. Både, primære og xenotransplantattumorer farvet positivt for pan-cytokeratin kloner AE1 og AE3. Ekspression af cytokeratiner i den primære tumor var lidt mere spredt end i de xenotransplantater, hvor det tydeligt farvede de epitelceller, der beklæder den luminale side af kanalerne. Mere specifikt ekspression af cytokeratin 19 var endnu mere karakteristisk duktal i begge væv. Isotypekontroller var negative (fig. 7). Immunofluorescens bekræfter udtryk for cytokeratin 19 i isolerede JoPaca-1 celler. Cytokeratin 19 er et mellemprodukt filament protein og blev udtrykt af JoPaca-1 ved den voksende foran en celle koloni (fig. 8A). Endvidere blev JoPaca-1 testet for ekspression af tumormarkør mesothelin. Den etablerede pankreatisk cancercellelinie BxPC-3, og den normale pancreas ductal cellelinje HDPE c7 blev anvendt som positive og negative kontroller, henholdsvis. kunne detekteres ekspression af mesothelin i JoPaca-1 og BxPC-3-celler, men ikke i den normale pankreatiske duktale celler HDPE c7. Isotype-kontroller var negative (fig. 8B).

Immunhistokemi blev udført på primære og xenograft tumor skiver. Cytokeratiner AE1 /AE3 og mere specifikt cytokeratin 19 blev udtrykt i duktale strukturer af primære og xenotransplantattumorer (brun). Isotypekontroller var negative.

Fase kontrast præsenteres der viser mesothelin og cytokeratin 19 som påvist i fast JoPaca-1, BxPC-3 og Æske med HDPE C7 celler. Begge proteiner blev mærket med primær og FITC-konjugeret sekundært antistof (grøn). Kerner blev farvet med DAPI (blå). Isotypekontroller var negative. A. Cytokeratin 19 udtrykkes ved den voksende foran JoPaca-1 celler. B. JoPaca-1 og den etablerede cellelinie BxPC-3 både udtrykker mesothelin mens den normale pancreas ductal cellelinje HDPE c7 ikke gør.

JoPaca-1-celler er stærkt beriget med cancer stamcellemarkører

selvfornyende cancer stamceller menes at være den drivende kraft bag tumorprogression og ansvarlig for resistens mod kemoterapi.