PLoS ONE: Hypoxi-induceret Modulation af apoptose og Bcl-2-familien Proteiner i Different Cancer Cell Types

abstrakt

Hypoxi spiller en vigtig rolle i resistensen af ​​tumorceller over for kemoterapi. Imidlertid er de nøjagtige mekanismer bag denne proces ikke godt forstået. Ifølge cellelinierne, hypoxi forskelligt påvirker celledød. Undersøgelsen af ​​virkningerne af hypoksi på apoptose induceret af 5 kemoterapeutiske lægemidler i 7 cancercelletyper viste, at hypoxia generelt inhiberede lægemiddelinduceret apoptose. I de fleste tilfælde virkningen af ​​hypoxi var den samme for alle lægemidlerne i én celletype. Ekspressionsprofilen af ​​93 gener involveret i apoptose samt proteinniveauet af BCL-2 familie proteiner blev derefter undersøgt. I HepG2-celler, som er stærkt beskyttet mod celledød ved hypoxi, hypoxi faldt den overflod af næsten alle de pro-apoptotiske Bcl-2 familie-proteiner, mens ingen af ​​dem er faldet i A549-celler, der ikke er beskyttet mod celledød ved hypoxi. I HepG2-celler, hypoxi faldt NOXA og BAD overflod og ændret elektroforetiske mobilitet BIM

EL. BIM og NOXA er vigtige mediatorer af etoposid-induceret celledød i HepG2-celler og hypoxi-induceret ændring af disse proteiner er mange eller post-translationelle modifikationer delvis forklare kemoresistens. Endelig modulation af overflod og /eller af de post-translationelle modifikationer af de fleste proteiner fra Bcl-2-familien af ​​hypoxi involverer p53-afhængige og -uafhængige veje og er celletype-afhængig. En bedre forståelse af disse celle-til-celle variation er afgørende for at overvinde hypoxi-induceret modstand og at forbedre kræftbehandlingen

Henvisning:. Sermeus A, Genin M, Maincent A, Fransolet M, Notte A, Leclere L, et al. (2012) Hypoxi-induceret Modulation af apoptose og Bcl-2-familien Proteiner i forskellige Cancer celletyper. PLoS ONE 7 (11): e47519. doi: 10,1371 /journal.pone.0047519

Redaktør: Elad Katz, University of Edinburgh, England

Modtaget: Juni 4, 2012; Accepteret: 12. september 2012; Udgivet: 5. november 2012 |

Copyright: © 2012 Sermeus et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. AS og AN er Research Fellow af FNRS (Fonds de la Recherche Scientifique, Belgien). MG og LL er understøttet af Fria (Fonds pour la Recherche dans l’Industrie et l’Agriculture, Belgien). HR er modtager af en FNRS-Télévie tilskud. Denne artikel præsenterer resultaterne af den belgiske Program på universitetscenter polakker af Type initieret af den belgiske stat, Statsministeriet, Science Policy Programming. Den ansvaret påhviler dets ophavsmænd. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kræft er en af ​​de vigtigste dødsårsager i de udviklede lande. Behandlinger omfatter ofte anvendelsen af ​​kemoterapi, men lægemiddelresistens er en almindelig årsag til svigt og tilbagefald behandling. De fleste kemoterapeutiske lægemidler inducerer celledød ved at udløse apoptose. Apoptose er reguleret af proteiner fra Bcl-2 (B-celle-lymfom-2) familie, der hovedsagelig virker på det mitokondrielle niveau. Denne familie af proteiner kan opdeles i tre kategorier efter funktion og struktur [1] proteiner. Første, Bax-lignende proteiner, såsom BAX (BCL-2 associeret × protein) og BAK (BCL-2 homolog antagonist /killer), er død faktorer. Når den er aktiveret, de oligomerise på mitokondrierne og inducere mitokondriske ydre membran permeabilisering, hvilket provokerer celledød. BCL-2-lignende proteiner, såsom Bcl-2, BCL-xL (B-celle-lymfom-ekstra stor), Bcl-w og MCL-1 (myeloid celleleukæmi 1), er overlevelsesfaktorer. De danner heterodimerer med BAX /BAK og hæmmer deres indsats. Endelig BH3 (BCL-2 homologi domæne 3)-kun proteiner, såsom BID (BH3-interagerende domæne død agonist), BAD (BCL-2-antagonist af celledød), BIM (BCL-2-interagerende mediator af celle død), BIK (BCL-2 interagerende killer), PUMA (p53 opreguleret modulator af apoptose) og NOXA, inducere apoptose ved at neutralisere de antiapoptotiske BCL-2-lignende molekyler, og for nogle af dem, ved direkte at aktivere BAX /BAK. Hos raske celler, BH3-only proteiner er enten ikke til stede eller holdes inaktive eller afsondret. Efter proapoptotiske signaler, bliver de transkriptionelt opreguleret og /eller posttranslationelt modificeret (og /eller relocalised) at opnå deres fulde proapoptotiske funktion [1], [2].

En af de vigtigste årsager til resistens over for kemoterapi -induceret apoptose er p53 mutation. p53 er faktisk en central aktør til induktion af apoptose i stressede celler [3], [4] En anden velkendt årsag til resistens er tumor hypoxi [5]. Virkningerne af hypoxi på kræftceller er celletype afhængige og forskellige alt efter intensiteten og varigheden af ​​den manglende O

2. Alvorlig og langvarig hypoxi kan påbegynde apoptose eller nekrose mens mild hypoxi er beskyttende [6], [7]. Faktisk mild hypoxi forstyrrer flere komponenter af apoptotiske vej på det transskriptionelle samt ved posttranslationel niveau.

Tidligere resultater fra vores gruppe viste, at hypoxia beskytter tumorceller fra apoptose induceret af kemoterapeutiske midler. Hypoxi beskytter HepG2 celler mod etoposid-induceret apoptose samt MDA-MB231-celler mod paclitaxel-induceret apoptose [8], [9], [10]. Men i andre celletyper, kan hypoxi have nogen virkning eller endda forværre apoptose induceret af kemoterapeutiske midler. Det er for eksempel tilfældet for etoposid-induceret apoptose af A549 og MCF-7-celler samt for epirubicin-induceret apoptose af MDA-MB231-celler [8], [10]. Disse resultater har også understreget, at cellereaktioner på hypoksi er meget kompleks, der involverer forskellige signaltransduktionsveje samt flere transkriptionsfaktorer. Især p53 transskription faktor synes at spille en vigtig rolle i cellen opførsel under hypoxi [8]. Målet med dette arbejde er at forstå, hvordan hypoxi kan forskelligt påvirke det kemoterapeutiske stof-induceret apoptose i kræftceller. Derfor vi først udvidet vores tidligere observationer under anvendelse af 7 cancercellelinjer, der stammer fra forskellige organer og med forskellige p53 status, udsat for 5 apoptoseinducerende lægemidler anvendt i kemoterapi, der er målrettet forskellige cellulære veje. I de fleste tilfælde hypoxi delvis forebyggelse celledød og virkningen af ​​hypoxi var den samme for alle lægemidlerne i én celletype. For det andet observerede vi, at hypoxi modulerede overflod af de fleste proteiner fra Bcl-2-familien i en celletype-afhængig måde. For det tredje, i HepG2-celler, der er beskyttet af hypoxi mod etoposid-induceret celledød, observerede vi et fald i BAD og NOXA protein niveau samt en ændring i den elektroforetiske mobilitet af BIM

EL (BIM ekstra lang) i hypoxia- inkuberede celler. Resultater fra ugyldiggørelse undersøgelser tyder på, at den kombinerede tab af BIM og NOXA under hypoxi i det mindste delvis tegnede sig for kemoresistens.

Materialer og metoder

Cell Culture og Hypoxi Incubation

Menneskelig hepatomaceller HepG2-celler, humane lunge carcinom A549-celler, humant brystadenocarcinom MDA-MB231-celler, humane hepatoma Hep3B celler, humane osteogene sarkomer U2OS celler, humane colon adenocarcinom HT-29-celler og menneskelig prostataadenokarcinomceller PC-3-celler (ATCC) blev holdt i kultur i 75-cm

2 polystyren kolber (Costar) med henholdsvis D-MEM (lav glucose) (Gibco), MEM (Gibco), RPMI 1640 (Gibco), RPMI 1640 (Gibco) indeholdende 50 U /ml penicillin og 50 ug /ml streptomycin (Gibco), Mc Coy s 5A-medium (Gibco), RPMI 1640 (Gibco) og F12 Kaighn medium (Gibco) indeholdende 10% FCS og inkuberet under en atmosfære indeholdende 5% CO

2.

hypoxi eksperimenter blev cellerne inkuberet i serumfrit CO

2-uafhængig medium (Invitrogen) suppleret med 0,5 mM L-glutamin (Sigma) med eller uden etoposid (Sigma), methotrexat (Sigma), paclitaxel (Molecular Probes), cisplatin (Sigma) eller camptothecin (Sigma) i 16 timer. Inkubationstiden under hypoksi blev udført i hjemmelavede inkubatorer, der indeholder 99% N

2 og 1% O

2. Niveauet af hypoxi i mediet i vore eksperimentelle betingelser er 10 mm Hg af opløst oxygen i mediet. Dette niveau af hypoxi opnås efter ca. 10 minutters inkubation. PO

2-niveau blev målt ved anvendelse af et opløst oxygen måler (Inolab Oxi 730) udstyret med en Cellox 325 probe. Normoksiske kontrol celler blev inkuberet under de samme betingelser, men i normal atmosfære (21% O

2)

siRNA transfektion

siGENOME SMARTpool menneske (Dharmacon, der anvendes ved 50 nM). BCL2L11 ( BIM, M-004.383-02), PMAIP1 (NOXA, M-005.275-03), BAD (M-003.870-02) eller TP53 (M-003.329-03) blev transficeret med DharmaFECT1 transfektion reagens (Dharmacon, der anvendes på et 1:500 fortynding). Ved kombination BIM og NOXA siRNA blev hver siRNA anvendes ved 25 nM. Den siGENOME RISC-Free Kontrol siRNA (D-001.220-01, Dharmacon, anvendes ved 50 nM) eller siGENOME Ikke-Targeting siRNA Pool # 1 (D-001.206-13, Dharmacon, anvendes ved 50 nM) blev anvendt som negative kontroller. Celler blev inkuberet i 24 timer med transfektionsmedium og mediet blev derefter erstattet med frisk medium med 10% FCS. 6 timer senere (eller 30 timer senere for BIM siRNA) blev celler inkuberet under hypoxi eller normoxi med kemoterapeutiske midler eller ej.

Subcellulær Fraktionering

Celler, podet i 75-cm

2 kolber, blev høstet i saccharose M /4 og homogeniseret med 3 slag af en B stempel i en Dounce. Homogenatet blev centrifugeret 10 minutter ved 1418

g

(Labofuge 400R Heraeus Instruments). Supernatanten blev udvundet og centrifugeret ved 81.085

g

(Beckman L7-35, rotor 50 Ti) for en periode afhængig af mængden. Pelleten blev resuspenderet i saccharose M /4 og navngivet MLP fraktionen. Supernatanten blev koncentreret ved centrifugering i Amicon Ultra-4 rør (Millipore) og navngivet S fraktionen. Alle prøverne blev endelig homogeniseret ved lydbehandling.

Western blot-analyse

Protein ekstraktion blev udført som beskrevet i [9]. Proteiner blev separeret ved SDS-PAGE på 15% polyacrylamidgel, på 4-12% NuPAGE Bis-Tris-geler med MES-buffer (Invitrogen) eller på 3-8% NuPAGE Tris-Acetat-geler (Invitrogen) og derefter overført til en PVDF-membran (Hybond-P, Amersham for kemiluminescensdetektion eller Immobilon FL, Millipore til fluorescens detektion). Kemiluminescensdetektion blev udført som beskrevet i [11] ved brug af inkubation natten over med specifikke primære antistoffer. Til fluorescens detektion blev membraner blokeret i 1 time ved stuetemperatur i Odyssey blokeringsbuffer (LI-COR) og derefter natten over ved 4 ° C i Odyssey blokeringspuffer med 0,1% Tween indeholdende et specifikt antistof. Efter 4 × 5 minutter vask i PBS-Tween 0,1%, inkubationen med det sekundære antistof (gede-anti-kanin eller anti-muse IRDye-mærket antistof, LI-COR, 1:10,000 fortynding) blev udført i 1 time i Odyssey blokering buffer med 0,1% Tween, efterfulgt af 4 vaskninger med 5 minutter i PBS-Tween og 2 vaske i PBS. Membranen blev derefter tørret i 1 time ved 37 ° C og scannet med Odyssey infrarød billeddannende system (LI-COR).

immunfluorescensfarvning

HepG2-celler blev podet ved 40.000 celler /brønd på glasafdækning objektglassene i 24-brønds plader. Efter inkubation med eller uden etoposid eller paclitaxel, blev immunfluorescensfarvning udført som beskrevet i [11]. Primært antistof i a-tubulin-farvning var muse-anti-a-tubulin (# T5186 Sigma) (1/100 fortynding). Alexa Fluor-647-konjugeret anti-muse-IgG-antistof (Molecular Probes) blev anvendt ved 1 /1.000 fortynding.

Caspase-3/7 Aktivitetsmenutast Assay

fluorogene substrat Ac-DEVD-AFC (BD Pharmingen) blev anvendt til måling caspase-3/7 Aktivitetsmenutast ifølge [12]. Celleekstrakter blev fremstillet som beskrevet i [13]. Celler blev podet i 25-cm

2 kolber. Analysen for caspase-3/7-aktivitet blev udført ifølge [8] under anvendelse af 20 ug af ekstrakter.

Lactatdehydrogenase frigivelsesassay

lactatdehydrogenase (LDH) frigivelse blev målt med “Cytotoksicitet Detection Kit “fra Roche Applied Science som beskrevet i [9]. Kulturmediet fra inkuberede celler blev fjernet og centrifugeret for at pelletere cellefragmenter og apoptotiske legemer. For at lysere cellerne, blev Triton X100 (Merck) ved 10% i PBS tilsat på denne pellet samt på cellerne forbliver fastgjort på bunden af ​​brøndene. Den procentvise LDH-frigivelse blev beregnet som følger: [LDH-aktivitet i medium (1) + LDH aktivitet af celler fragmenter og apoptotiske legemer (2)] /[(1) + (2) + LDH-aktivitet af celler, der forbliver i brøndene].

transient transfektion og Luciferase Assay

Cell transfektion blev udført i 24-brønds plader (50.000 celler per brønd for HepG2 og MDA-MB231-celler; 30.000 for A549-celler, og 40.000 til Hep3B celler) med SuperFect-reagens (Qiagen). 923 ng (1385 ng for MDA-MB231-celler) af reporterplasmidet pGL3- (PGK-HRE6) -tk-luc, som indeholder 6 HRE cis-elementer fra PGK-genet forbundet med thymidinkinase basal promotor og den ildflueluciferase gen [14], blev co-transficeret med 577 ng (115 ng for MDA-MB231-celler) af normalisering vektor (pCMV-vektor, der koder for β-galactosidase, Clontech) i medium uden serum i 6 timer (eller 3 timer for Hep3B celler før udskiftning af mediet med frisk medium). Bagefter blev cellerne inkuberet under hypoxi eller normoxi i 16 timer. Efter inkubation blev cellerne lyseret i Passive Lysis Buffer (Promega) og β-galactosidase blev analyseret parallelt med ildflueluciferaseaktivitet, analyseret under anvendelse af Luciferase Assay System (Promega).

Taqman Low Density Array

Efter inkubationen blev totalt RNA ekstraheret under anvendelse af TRI Reagent Solution (Applied Biosystems). mRNA indeholdt i 2 ug totalt RNA revers transkriberet under anvendelse af “High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit” fra Applied Biosystems ifølge producentens anvisninger. 100 ng af retrotranskriberet total RNA i 50 pi blev derefter blandet med 50 pi af den “Taqman Universal PCR Master Mix” (Applied Biosystems) og fyldt i en af ​​de 8 påfyldningsportene af den mikro-array. “TLDA Menneskelig Apoptose Panel” er 384-brønds mikrofluide kort, der indeholder analyser for 96 humane gener. De gør det muligt at udføre 96 real-time PCR-reaktioner samtidigt til 4 prøver. mRNA-ekspression niveau blev kvantificeret under anvendelse tærskelcyklen metoden med 18S som reference-genet.

RT Real-time-PCR for mRNA Kvantificering

Efter inkubationen totale RNA blev ekstraheret under anvendelse TRI Reagent Solution (Applied Biosystems). mRNA indeholdt i 2 ug totalt RNA revers transkriberet under anvendelse af SuperScript II revers transkriptase (Invitrogen). Frem og bak primere sekvenser findes i tabel S1 og blev designet ved hjælp af Primer Express 1.5 software (Applied Biosystem). Amplifikationsreaktion assays indeholdt 1 × SYBRGreen PCR Master Mix (Applied Biosystem) og primere (Applied Biosystems, 300 nM). RPL13A blev brugt som reference genet for normalisering og mRNA ekspressionsniveauet blev kvantificeret ved hjælp af den tærskel cyklus metode.

Heatmap og statistiske analyser

Heatmaps blev genereret med de data, omdannes i logaritme bund 2 resultater for TDLA (n = 1) og af midlerne til tre værdier for QRT-PCR-resultater. Statistiske analyser blev udført med ANOVA 1 og Tukeys flere sammenligning tests med GraphPad Prism.

Resultater

Hypoxi har forskellige virkninger på Drug-induceret celledød i forskellige celletyper

for at opnå yderligere indsigt i de mekanismer initieres af hypoxi, der fører til cancer celle modstand, vi udvidet vores tidligere observationer, der anvender andre cancercellelinier stammer fra forskellige organer og med forskellige p53 status og andre apoptoseinducerende kemoterapeutiske lægemidler rettet mod forskellige cellulære veje . De anvendte cellelinier er HepG2 (p53 vildtype-hepatomceller), A549 (p53 vildtype lungecarcinomceller), U2-OS (p53 vild type osteogene sarcomaceller), MDA-MB231 (p53 mutant brystadenokarcinomceller), HT-29 (p53 mutant colon adenocarcinoma celler), Hep3B (p53 null hepatomceller), og PC-3 (p53 null prostataadenokarcinomceller) celler. De kemoterapeutiske midler valgt, er etoposid (a topoisomerase II inhibitor), methotrexat (et DNA og RNA-syntese inhibitor), paclitaxel (en hæmmer af mikrotubulusdynamik), cisplatin (et alkyleringsmiddel) og camptothecin (a topoisomerase I-inhibitor).

første er koncentrationen af ​​lægemiddel til brug på hver celletype blev valgt ved at analysere caspase-3/7 Aktivitetsmenutast efter 16 timer inkubation med lægemidlerne. I hvert tilfælde blev en koncentration inducerer moderat apoptose valgt. For midler inducerer ingen caspaseaktivitet, blev deres samlede toksicitet vurderet ved måling lactatdehydrogenase (LDH) frigivelse 40 timer efter inkubation med midlerne. Når koncentrationerne blev valgt, blev virkningen af ​​hypoxi (1% O

2) på celledød induceret af hvert middel i hver celletype overvåges af de to samme teknikker (figur 1).

HepG2 , A549, U2OS, MDA-MB231, HT-29, blev Hep3B og PC-3 celler inkuberet under normoxi (21% O

2) eller hypoxi (1% O

2) i fravær (CTL) eller tilstedeværelse af etoposid (ETO), paclitaxel (SKAT), cisplatin (CIS) eller camptothecin (CPT) for 16 (A, C, E, G, J) eller 40 timer (B, D, F, H, i, K) . Den anvendte koncentration for hvert molekyle er angivet i graferne (i uM). (A, C, E, G, J) Caspase-3/7 blev analyseret ved måling af fluorescensen af ​​frit AFC frigivet fra spaltning af caspase-3/7 Specifikke substrat Ac-DEVD-AFC. Resultater udtrykkes i relative fluorescensenheder (RFU) som middelværdi ± 1 SD (n = 3). (B, D, F, H, I, K) LDH-frigivelse blev vurderet. Resultaterne er angivet i procenter som middelværdi ± 1 SD (n = 3). (A-K) Statistisk analyse blev udført med ANOVA 1. ns: ikke væsentlig; *: P 0,05; **: P 0,01; ***: P 0,001. Symboler over et normoxisk kolonne er en sammenligning med normoxisk kontrol og symboler over en hypoksisk kolonne er en sammenligning med den tilsvarende normoxisk tilstand (med det samme lægemiddel).

Vi observerede, at i almindelighed, den p53 muteret eller nul-celler er vanskeligere at dræbe end p53 vildtypeceller. I de fleste tilfælde virkningen af ​​hypoxi på celledød var den samme for alle molekyler i én celletype. Men denne effekt varierede alt efter celletype. Vi bemærkede også, at hypoxi havde oftere en beskyttende effekt mod celledød end en skærpende effekt. For eksempel hypoxi beskyttet HepG2 og MDA-MB231-celler mod celledød induceret af alle de testede mens vi ikke observeret nogen effekt eller en forværring af lægemiddel-induceret celledød af hypoxi i A549 og Hep3B celler molekyler. Hypoxi kan derfor beskytte p53 vildtype såvel som p53 muterede celler. Alt i alt viser disse resultater genereret en matrix af data om virkningen af ​​hypoxi på apoptose induceret af 5-molekyler i 7 celletyper (tabel 1). Resultaterne viste, at virkningen af ​​hypoxia er forskellig i celletypen, men konstant for alle lægemidlerne på en celletype. Så vidt vi ved, har denne observation aldrig været gjort før.

Expression Profil af mRNA og proteiner involveret i apoptose i forskellige celletyper

For at forstå, hvorfor hypoxi beskyttet nogle cellelinjer mod narkotika-induceret død, men ikke andre, valgte vi fire cellelinjer huser forskellige p53 status og for hvor virkningen af ​​hypoxi er anderledes: HepG2, A549, MDA-MB231 og Hep3B celler. Vi brugte etoposid som celledød inducer, da det er stærk i alle fire cellelinjer og dets virkningsmekanisme er velkendt. Effekten af ​​hypoxi på paclitaxel-induceret død HepG2-celler blev også undersøgt.

etoposid og Paclitaxel er aktiv og HIF-1 er aktiveret under iltsvind i alle celletyper

Hypoxi ofte beskrevet til at inhibere den skadelige virkning af kemoterapeutiske midler [15]. For at kontrollere, om hypoxi hæmmer etoposid-induceret DNA-skader og /eller paclitaxel-induceret mikrotubuli stabilisering eller hvis det fungerer på et niveau neden for skader forårsaget af lægemidlet, blev ATM (ataksi telangiectasia muteret) fosforylering studeret 1 time efter etoposid inkubation og morfologien af ​​mikrotubuli fibre blev undersøgt efter 16 timer paclitaxel eksponering. Etoposid udløser celledød ved at inducere dobbeltstrenget DNA pauser, der fører til ATM aktivering. Resultaterne viste, at det faktisk inducerede phosphorylering af ATM i de fire celletyper. blev observeret nogen effekt af hypoxi på induktionen af ​​P-ATM, selv i HepG2 og MDA-MB231-celler, hvor hypoxi faldt den etoposid-induceret apoptose (figur 2A). I HepG2-celler, der er beskyttet af hypoxi mod paclitaxel-medieret celledød, havde hypoxi synes ikke at forhindre dannelsen af ​​tykke mikrotubuli fibre induceret af paclitaxel (figur 2B og data ikke vist). Samlet set viste disse resultater, at hypoxi beskytter cellerne nedstrøms for lægemiddel-induceret skade.

(A) Effekt af hypoxi, etoposid og paclitaxel på overflod og phosphorylering af ATM. HepG2, A549, MDA-MB231 og Hep3B celler blev inkuberet 1 time under normoxi (N, 21% O

2) eller hypoksi (H, 1% O

2) i nærvær eller ej (CTL) af etoposid (ETO, 100 pM i Hep3B-celler og 50 pM i andre celletyper) eller paclitaxel (TAX, 10 uM) i HepG2-celler. ATM og P-ATM blev påvist med nukleare proteinekstrakter ved Western blotting under anvendelse af specifikke antistoffer. Et eksperiment repræsentativt ud af tre. Ukuperede western blots er vist i fig S1. (B) Effekt af hypoxi, etoposid og paclitaxel på mikrotubuli. HepG2-celler blev inkuberet 16 timer under normoxi (21% O

2) eller hypoxi (1% O

2) i nærvær eller ikke af etoposid (50 uM) eller paclitaxel (10 uM). Efter inkubationen blev cellerne fikseret, permeabiliseres og farvet for a-tubulin ved anvendelse af et specifikt antistof. Observation blev udført under anvendelse af et konfokalt mikroskop med en konstant fotomultiplikator.

Mange beskyttende virkninger af hypoxi medieres af HIF-1 (hypoxi-inducerbar faktor-1) transskriptionsfaktoren, som er en heterodimer sammensat af en konstitutivt udtrykt underenhed, HIF-1 beta, og en underenhed stabiliseret kun under hypoxiske betingelser, HIF-1alpha [5]. Vi undersøgte derfor hvis denne faktor effektivt blev aktiveret ved hypoxi i cellelinierne, hvor hypoxi ikke har en beskyttende virkning (figur 3). Hypoxi inducerede akkumulering af HIF-1alpha men etoposid faldt denne akkumulering i A549, MDA-MB-231 og Hep3B celler. I HepG2-celler, etoposid havde ingen eller en svag inhiberende virkning ifølge eksperimentet. er allerede blevet observeret Virkningen af ​​etoposid på HIF-1alpha proteinniveau [16]. Som evalueret af luciferase reporter, HIF-1 var aktiv i hver celle type i hypoxi og dette korrelerer med mRNA overflod af to af dets målgener (IdhA og BNIP3).

HepG2, A549, MDA-MB231 og Hep3B celler blev inkuberet 16 timer under normoxi (N, 21% O

2) eller hypoksi (H, 1% O

2) (AD) i nærvær eller ej (CTL) af etoposid (ETO, 100 uM i Hep3B-celler og 50 pM i de andre celletyper) eller paclitaxel (TAX, 10 uM) i HepG2-celler (A, C, D). (A) HIF-1alpha blev påvist i totale celleekstrakter ved Western blotting under anvendelse af et specifikt antistof. Alpha-tubulin blev anvendt som indlæsning kontrol. Et eksperiment repræsentativt ud af tre. Ukuperede western blots er vist i fig S1. (B) Før inkubering blev celler cotransficeret med pGL3- (PGK-HRE6) -tk-luc reporter plasmid, der koder for ildflueluciferase og pCMVß normalisering plasmid. Resultater er udtrykt som gennemsnit af forholdet mellem ildflueluciferaseaktivitet, og ß-galactosidase-aktivitet ± 1 SD (n = 3). Statistisk analyse blev udført med ANOVA 1. ***: P 0,001. Symboler er en sammenligning mellem de normoksiske og hypoxiske betingelser af samme celletype. (C, D) Efter inkubation totalt RNA blev ekstraheret, forelagt revers transkription og derefter amplifikation i nærvær af SYBR Green og specifikke primere til BNIP3 (c) eller IdhA (D). RPL13A blev anvendt som housekeeping-gen til data normalisering. Data er givet i fold-induktion som middelværdi ± 1 SD (n = 3). Statistisk analyse blev udført med ANOVA 1. ns: ikke væsentlig; *: P 0,05; **: P 0,01; ***: P 0,001. Symboler over de hypoxiske kolonner er en sammenligning med den tilsvarende normoxisk tilstand (med det samme lægemiddel).

Som konklusion, det faktum, at hypoxi beskytter HepG2 og MDA-MB231 celler mod døden, men ikke A549 og Hep3B celler kunne ikke forklares ved en forskel i etoposide- eller paclitaxel-induceret skade eller i HIF-1-aktivering.

ekspressionsprofil af mRNA’er er involveret i apoptose

Resultater fra figur 2 antyder, at forskellen effekt af hypoxi på celledød sker nedstrøms for induktion af celleskader. Vi hypotese således at hypoxi påvirker signaltransduktionsvejene, der udløser apoptose. Disse veje er især afhængig af p53, men også på andre transkriptionsfaktorer. Genekspressionsstudier blev således udført for at finde gener, hvis ekspression er differentielt reguleret af hypoxi i beskyttede celler sammenlignet med ikke-beskyttede celler. Taqman Low Density Arrays (Applied Biosystems) muliggør studiet af den overflod af 93 mRNA’er, der vides at være involveret i apoptose processen (samt 3 husholdning mRNA’er) blev anvendt. Resultaterne er præsenteret som en Heatmap i figur 4, mens de numeriske værdier er vist i tabel S2. Som forventet, observerede vi induktion af HIF-1-målgener (BNIP3, BNIP3L og GAPDH) efter 16 timers hypoxi i de fire celletyper. Induktion af p53-målgener (Apaf-1, BAK1 og BAX) blev observeret i HepG2 og A549-celler efter 16 timers inkubation etoposid men ikke i p53 muterede (MDA-MB231-celler) eller nul (Hep3B celler) celler. P53 målgen PMAIP1 (NOXA) blev induceret ved etoposid i alle celletyper. Salg

Resultater blev opnået under anvendelse af “TLDA Humant Apoptose Panel” (Applied Biosystems) (TLDA). HepG2, A549, MDA-MB231 og Hep3B celler blev inkuberet 16 timer under normoxi (N, 21% O

2) eller hypoxi (H, 1% O

2) i nærvær eller ikke af etoposid (E, 100 pM i Hep3B-celler og 50 pM i de andre celletyper) eller paclitaxel (T, 10 uM) i HepG2 celler. Efter inkubering blev total RNA ekstraheret, forelagt revers transkription og derefter til TLDA analyse. 18S blev anvendt som housekeeping-gen til data normalisering. Faktiske numeriske værdier er vist i tabel S2. Gener, der er vist med fed skrift er gener, hvis ekspression blev valideret af QRT-PCT.

Vi derefter søgte gener, hvis ekspression profil er parallel med celledød profil i hver af de fire celletyper, dvs. gener, hvis ekspression blev nedreguleret af hypoxi i HepG2 og MDA-MB231-celler og upåvirket eller øget i A549 og Hep3B celler, eller omvendt. Kunne imidlertid ikke en sådan ekspressionsprofil observeres. Interessant ekspressionen af ​​BCL2L11 (også kaldet BIM), BIK, CASP10, CASP3 blev DEDD2, NALP1 og TRADD faldt med hypoxi i etoposid-inkuberet HepG2-celler, mens deres ekspression blev forøget eller umodificeret i A549-celler, der korrelerer med den apoptotiske profil disse to celletyper. Desuden BIRC3 og MCL1 ekspressionsprofil var inverse af den apoptotiske profil for HepG2 og A549-celler. Ekspressionsprofilen af ​​disse gener er valideret af enkelt realtid RT-PCR-reaktioner. Resultaterne er præsenteret som en Heatmap i figur 5, mens de numeriske værdier er vist i tabel S3. Profilen for BAK1, BAX, BBC3 (også kaldet PUMA) og PMAIP1 (også kaldet NOXA) blev også valideret da de er velkendte mediatorer af etoposid-induceret celledød. De fleste af de opnåede resultater ved brug Taqman Low Density Arrays blev bekræftet. Det skal dog bemærkes, at ekspressionen af ​​næsten alle undersøgte gener blev reduceret med hypoxi i alle etoposid-eksponerede celler.

HepG2, A549, MDA-MB231 og Hep3B celler blev inkuberet 16 timer under normoxi (N, 21% O

2) eller hypoksi (H, 1% O

2) i nærvær eller ikke af etoposid (E, 100 um i Hep3B-celler og 50 pM i andre celletyper) eller paclitaxel (T, 10 uM) i HepG2 celler. Efter inkubering blev total RNA ekstraheret, forelagt revers transkription og derefter til realtids-PCR i nærværelse af SYBR Green og specifikke primere. Faktiske numeriske værdier er angivet i tabel S3. Gener, der er vist med fed skrift er gener, hvis ekspression blev vurderet på proteinniveauet ved western blot-analyser.

ekspressionsprofil af proteiner involveret i apoptose

Ud at være reguleret af ændringer i genet ekspression, de fleste af de involveret i apoptose proteiner vides at blive også reguleres på posttranslationelle niveau [2]. Etoposid og paclitaxel inducerer apoptose ved hovedsageligt at aktivere indre vej [17], [18], [19], som reguleres af den overflod og den subcellulære lokalisering af proteiner fra Bcl-2-familien. Vi studerede derfor proteinet overflod af BCL-2 familie-proteiner i de fire celletyper samt den subcellulære lokalisering af nogle af dem i HepG2 og A549-celler (figur 6).

HepG2, A549, MDA-MB231 og Hep3B celler blev inkuberet 16 timer under normoxi (N, 21% O

2) eller hypoksi (H, 1% o

2) i nærvær eller ej (CTL) af etoposid (ETO, 100 pM i Hep3B celler og 50 pM i de andre celletyper) eller paclitaxel (TAX, 10 uM) i HepG2 celler. (A) Proteiner blev påvist i totale celleekstrakter ved Western blotting under anvendelse af specifikke antistoffer. alpha-tubulin blev anvendt som indlæsning kontrol. Et eksperiment repræsentativt ud af tre. Ukuperede western blots er vist i fig S1. (B) Efter inkubering blev subcellulær fraktionering udført, og proteiner blev påvist i MLP (mitokondrier-lysosomer-peroxisom) og S (cytosol) fraktioner ved western blotting, ved hjælp af specifikke antistoffer. TOM20 og β-actin blev anvendt som lastning kontrol for MLP og S fraktioner henholdsvis. Et eksperiment repræsentativt ud af tre. Ukuperede western blots er vist i figur S1.

Vi først studeret de pro-apoptotiske BAX og BAK proteiner. BAX total protein niveau blev steg svagt med etoposid i HepG2, A549 og Hep3B celler men forblev upåvirket i MDA-MB231-celler. Hypoxi faldt en smule BAX overflod i HepG2-celler, men havde ingen virkning på andre celletyper. Dette protein var til stede i MLP (mitochondria-lysosom-peroxisom) fraktion og i cytosolen i HepG2 og A549-celler. Etoposid steg BAX overflod i cytosolen i HepG2-celler og i MLP del af A549-celler; denne stigning blev forhindret af hypoxi.