PLoS ONE: Amplified gener kan være overudtrykt, Uændret eller nedreguleret i livmoderhalskræft Cell Lines

Abstrakt

Flere kopital-ændrede regioner (CNA’er) er blevet identificeret i genomet af livmoderhalskræft, især, amplifikationer af 3q og 5p. Men bidrag kopi-nummer ændringer i cervikal carcinogenese er uløst, fordi genom-dækkende der findes en manglende sammenhæng mellem kopi-nummer ændringer og genekspression. I denne undersøgelse har vi undersøgt, om CNAs i cellelinjerne Calo, CaSki, HeLa, og SiHa blev associeret med ændringer i genekspression. I gennemsnit 19,2% af celle-line genomer havde CNA’er. Imidlertid kun 2,4% omfattede minimale tilbagevendende regioner (materialefjernelseshastigheder) fælles for alle cellelinier. Ud fra følgende betragtninger 3q havde begrænset fælles gevinster (13%), blev 5p helt duplikeret gentagne. Hele genomet, kun 15,6% af gener lokaliseret i CNAs ændrede genekspression; derimod satsen i materialefjernelseshastigheder var op til 3 gange dette. Chr 5p blev bekræftet helt forstærket af FISH; blev dog højst 33,5% af de udforskede gener i 5p dereguleret. I 3. kvartal, denne sats var 13,4%. Selv i 3q26, som havde 5 materialefjernelseshastigheder og 38,7% gentagne fået SNP’er, satsen var kun 15,1%. Interessant, blev op til 19% af deregulerede gener i 5p og 73% i 3q26 nedreguleret, hvilket tyder på yderligere faktorer var involveret i gen-undertrykkelse. De deregulerede gener i 3. kvartal og 5p fandt sted i klynger, tyder lokale kromatin faktorer kan også påvirke genekspression. I regioner amplificeret diskontinuerligt, nedreguleret gener steget støt som antallet af amplificerede SNP’er forøget (p 0,01, Spearmans korrelation). Derfor kan delvis genamplifikation fungere i silencing genekspression. Yderligere gener i 1q, 3q og 5p kunne inddrages i cervikal carcinogenese, specielt i apoptose. Disse omfatter

PARP1

i 1q,

TNFSF10

og

ECT2

i 3. kvartal

og CLPTM1L

,

AHRR

,

PDCD6

, og

DAP

i 5p. Samlet set genekspression og copy-nummer profiler afslører andre end gen dosering faktorer, som epigenetiske eller kromatin domæner, kan påvirke genekspression inden for de helt forstærkede genomsegmenter

Henvisning:. Vazquez-Mena O, Medina-Martinez I , Juárez-Torres E, Barrón V, Espinosa A, Villegas-Sepulveda N, et al. (2012) Amplified gener kan være overudtrykt, Uændret eller nedreguleret i livmoderhalskræft cellelinjer. PLoS ONE 7 (3): e32667. doi: 10,1371 /journal.pone.0032667

Redaktør: Alessandro Marcello, International Center for Genetic Engineering og Bioteknologi, Italien

Modtaget: September 5, 2011; Accepteret: 30 januar 2012; Udgivet: 7 marts 2012

Copyright: © 2012 Vazquez-Mena et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af det nationale Råd for Videnskab og Teknologi (CONACYT), giver numrene 8135 /A1, 24.341 (til JB) og 80680 (til SK), og National University of Mexico (UNAM), tildele nummer SDI.PTID.05.2 ( til JB). OVM, AE, IMM, og VB var modtagere af et stipendium fra CONACYT. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Livmoderhalskræft (CC) er den anden mest almindelige kræftform hos kvinder over hele verden, der påvirker 500.000 personer hvert år, og det er den vigtigste dødsårsag for kvinder med kræft i udviklingslandene [1]. De virale oncoproteiner E6 og E7 af de humane papillomavirus højrisiko-(HPV) spiller en vigtig rolle i carcinogenese. De inhiberer forskellige cellulære mål, herunder tumor-suppressor proteiner p53 og pRB, forstyrre vigtige cellulære processer, såsom apoptose og cellecykluskontrol, og føre til genomisk ustabilitet og neoplastisk udvikling [2]. På trods af skader forårsaget af oncoviral proteiner, CC er en sjælden komplikation af den virale infektion, fordi de fleste infektioner er forbigående og ikke udvikle sig til neoplastiske læsioner. I gennemsnit tager det 12-15 år, før en persisterende HPV infektion kan, via præmaligne stadier af cervikal intraepithelial neoplastiske læsioner (CIN), føre til CC [3]. Disse resultater tyder på HPV-infektion alene ikke forårsager sygdom og andre faktorer, såsom abnorme værtsgener, kan være forbundet med udviklingen af ​​invasiv cancer. Adskillige genomiske regioner er blevet identificeret med ændringer i antallet af DNA-kopier (kopital-ændrede regioner, CNA’er) i CC gennem en analyse af tumoren genomet ved anvendelse af fremgangsmåder såsom komparativ genomisk hybridisering (CGH), fluorescens in situ hybridisering (FISH ), og mikroarrays af SNP’er. Gevinster i 1q, 3q, 5p, 8Q, og 20Q og udeladelser i 2q, 3P, 4p, 4q, 5q, 6Q, 8 p, 11q, 13q, 18q, og XQ er ofte blevet rapporteret i både CC [4] – [10 ] og CC-afledte cellelinier [9], [11] – [16]. Genomiske ubalancer kan bidrage til dereguleret ekspression af onkogener og tumorsuppressorgener i cancerceller, og ophobningen af ​​sådanne ændrede gener er blevet korreleret med tumorprogression [17]. Men bidraget fra disse ændringer livmoderhalskræft carcinogenese er stadig et spørgsmål om forhandling. Gevinster af 3q [5] – [9], [18], [19] og 5p [5], [13], [20] – [22] er den hyppigste kromosomale ændringer i cervikale carcinomer, og de har også været beskrevet i andre faste tumorer [23] – [25]. Den mindste konsensus region 3q forstærkning i CC kort i kromosomale cytobands 3q26-27 [6] – [9], [14], [18], hvilket tyder på nogle gener i disse regioner kan være involveret i livmoderhalsen carcinogenese. Nogle af dem, herunder

tert

[26], [27] og

PIK3CA

[28], betragtes kandidat onkogener for CC. Store områder af 3. kvartal, herunder loci hvor

tert

og

PIK3CA

er placeret, er blevet bekræftet forstærket af FISH i mellemfasen kerne af cervikale tumorer og metafase Chr i cellelinjer [14], [29]. Imidlertid har en detaljeret karakterisering af disse forstærkede gener ikke er blevet udført, og kun gevinsten af ​​

PIK3CA

er blevet valideret ved kvantitativ PCR [28]. Det er ikke blevet påvist, at

tert

opreguleres i tumorprøver eller cellelinjer, hvor det er forstærket, og sammenhængen mellem forstærkningen og opregulering af

PIK3CA

gen er stadig kontroversiel. Forstærkning af

PIK3CA

er ikke forbundet med øget genekspression i tumorprøver [30], [31]. Det har imidlertid været forbundet med en forøget mængde af proteinet ved Western blot i cellelinier [28] og øget proteinaktivitet i tumorer [32] og cellelinier [28]. I hvilket omfang disse tilbagevendende kromosomale ændringer er relevante for tumor udvikling er stadig stort set ukendt. På den anden side er den fulde amplifikation af 5p veldokumenteret af FISH i tumorprøver og cellelinjer [13], [16], [29]. Nogle forstærkede gener nærede af denne region, og foreslog at være involveret i CC, såsom

SKP2

,

TERT

,

TRIO

,

RNASEN

, og

PRKAA1

, har vist sig at være opreguleret i tumorprøver [22] og cellelinier [13], [16]. Men genom-dækkende, er der observeret nogen sammenhæng mellem antal kopier og genekspression, selv i kromosomale arme helt forstærkede ligesom 5p eller 3q. I cellelinjer der 5p forstærket, blev kun 22% af de undersøgte gener opreguleret. Tilsvarende invasive tumorer eller cellelinier, der har amplificeret 3q viste endda en lavere andel af opregulerede gener [16]. Den manglende sammenhæng mellem kopi nummer (CN) og genekspression [16], [31] tyder på, at nogle af de ændrede områder identificeret af SNP eller mCGH arrays kunne være CN-ændret diskontinuert og ikke alle gener inden for regionerne er berørt. Men rollen som kopi nummer i gen deregulering er ikke undersøgt i detaljer genom-dækkende og kun bestemte regioner, er blevet undersøgt [16], [31], [33]. I denne undersøgelse har vi undersøgt, om de KN ændringer i cellelinjer, genom-dækkende på et gen-for-gen-niveau, blev forbundet med ændringer i genekspression. Til det formål blev de KN ændringer af hele genomet og niveauet for ekspressionen af ​​mere end 20.000 gener udforsket i 4 cellelinjer ved hjælp af de 100 K SNP og Human Gene 1.0 ST mikroarrays fra Affymetrix.

Resultater

Identifikation af gener potentielt ændret i kopi nummer

Hver celle linje havde i gennemsnit 49,167 kopital-ændrede SNP’er (KN-AS, 42,6% af alle SNPs evalueret), hovedsagelig gevinster (45,5%) og enkelt sletninger (48,5%). Amplifikationer (5,5%) og især dobbelt sletninger (0,5%) var sjældne begivenheder. I alt 1065 forskellige CNA’erne blev identificeret i de 4 celle undersøgte linjer, 599 gevinster og 466 sletninger. I gennemsnit cellelinjer havde 273 ± 32 (interval, 240-317) CNAs og den samlede CN-ændrede genom var ca. 19,2%. Når CNA’er af de 4 cellelinjer blev justeret (fig S1), 108 minimale tilbagevendende regioner (materialefjernelseshastigheder) blev identificeret (tabel S1). De havde en middelstørrelse på 787 kb (interval, 3.4-16,755 kb), og mængden af ​​DNA indeholdt i hele sættet af materialefjernelseshastigheder svarede til 2,4% af genomet. De tilbagevendende SNPs, som udgjorde materialefjernelseshastigheder kun udgjorde 5,8% af alle evaluerede SNP’er. Kun 10 kromosomale arme havde en større og statistisk signifikant sats (mærket med en stjerne i figur 1). Tre af dem havde kun vundet SNP’er (1q, 3q, og 5p), 6 havde kun slettet SNP’er (4p, 13q, 18q, 20p, 21p, og XQ), og en (11q) havde både vundet og slettet SNPs. Det er bemærkelsesværdigt, at 94% af de 2.045 evaluerede SNP’er i 5p blev amplificeret, hvilket antyder, at hele 5p blev kopieret (figur 2A). Procentdelen af ​​ændrede SNP’er i de andre arme var meget lavere end i 5p, undtagen i 21p, som havde 100% ændrede SNPs. Der var imidlertid kun 5 evaluerede SNP’er i denne arm (figur 1). På den anden side, 45 ud af 297 cytobands havde en signifikant højere tilbagevendende ændrede SNP’er end hele genomet, de fleste af dem er placeret i kromosomerne identificeret ovenfor (tabel S2). Cytobands med de højere satser omfattede 9 forstærket (1q31, 5p12, 5p13, 5p14, 5p15, 3q24, 3q26, 7p11, 7q32) og 6 udgår (4p16, 11q23, 11q25, 13q12, 13q14 og 18q11).

på venstre side er antallet af SNP’er placeret i hvert kromosomale arm angivet, som blev undersøgt af 100 K microarray. På højre side, er antallet af gener lokaliseret i hver arm angivet, som blev undersøgt for ændringer i genekspression ved ST1.0 udtryk microarray. Hver søjle repræsenterer procentdelen af ​​tilbagevendende ændrede SNP’er (venstre) eller deregulerede gener (højre) fælles for 4 cellelinjer. De kromosomale arme er angivet i den midterste kolonne. Arme mærket med asterisk havde en gennemsnitlig antal CN-ændrede SNP’er højere og statistisk signifikante (p 0,05, chi-square test) sammenlignet med hele genomet betyder. Arme med en statistisk signifikant dereguleret gen berigelse blev mærket med “a” (identificeret med både chi-square test og PAGE), “b” (kun identificeret med chi-square test, p 0,05) eller “c” (kun identificeret med PAGE).

Panel A viser kopi nummer log forhold

2 af undersøgte i Chr 5 af 100 K SNP microarray i HeLa, CaSki, SiHa og Calo SNPs. Paneler B til D viser fold ændring af genekspression af gener evalueret af ST1.0 udtryk microarray beliggende i MRR 5-1 (n = 64), MRR 5-4 (n = 44), og MRR 5-5 (n = 37) ved 5p. Søjlerne repræsenterer opreguleres gener, nedreguleret gener og gener uden ændring i genekspression. Generne er ordnet efter position i genomet. SAM metode blev anvendt til analyse, ved hjælp af cut-off værdier af fold ændring af ≥1.5 eller ≤0.66 for op- eller nedreguleret gener og fold opdagelse sats (FDR) på 0%. Gener tidligere rapporteret i forbindelse med livmoderhalskræft er mærket med en asterisk (IPA system) eller cirkler (PubMed).

Under forudsætning af, at CNAs og materialefjernelseshastigheder løbende blev ændret regioner, at identificere gener med KN ændringer, de blev justeret med samtlige menneskelige gener efter deres position i genomet (fig S1). Antallet af ændrede gener pr cellelinie varierede fra 6.864 i Calo til 17.829 i SiHa (gennemsnit, 11,669 gener, tabel 1). Interessant manglede 14 materialefjernelseshastigheder gener og antallet af gener i de resterende materialefjernelseshastigheder (n = 94) var i området fra 1 til 103. I alt 1.264 gener blev placeret i materialefjernelseshastigheder, 619 udgår, 626 opnået og 19 udgår i nogle celler og opnået i andre (tabel S3).

Gen-ekspression analyse af 20,741 gener i CC cellelinjer

Den mængde mRNA transskriberet fra 20,741 gener blev sammenlignet mellem de enkelte cellelinjer eller alle fire cellelinier sammen og 10 normale cervikale epitel kontroller. Den rå data blev standardiseret med den robuste mikrochip gennemsnit (RMA) algoritme af FlexArray software og gener med et andet udtryk niveau blev identificeret med “Betydning Analyse af Microarrays” (SAM) metode ved hjælp afskæringsværdier for fold ændring på ≥ 1,5 og en fold opdagelse sats (FDR) på 0% (se Materialer og fremgangsmåder). Det gennemsnitlige antal gener udtrykt differentielt mellem cancerceller og kontrolgruppen var 3,127 og varierede fra 2.069 (10%) i SiHa til 5.295 (25,5%) i HeLa (se tabel 1). Når eksperimenter de 4 cellelinjer blev taget sammen som en gruppe, 3.122 gener (15,1%) blev fundet udtrykkes forskelligt i forhold til den for kontrolgruppen, 1,434 opreguleret og 1.688 nedreguleret (tabel S4).

Frekvensen af deregulerede gener blev beregnet i hvert kromosomal arm og cytoband. Kun 7 kromosomale arme (4q, 5p, 15q, 16p, 16q, 18q og 19p) viste en større og statistisk signifikant (p 0,05, chi-square) procentdel af deregulerede gener sammenlignet med hele sættet (15,1%; figur 1). Arm 5p havde den største procentdel (33,5%) af deregulerede gener efterfulgt af 16q (22,1%), 16p (21,3%), 18q (21%), 15q (20,8%), 19p (20,4%) og 4q (18,9%) . I 5p, 16p, 16q og 19p de opreguleres gener fremherskende, mens der i 4. kvartal, 15Q og 18q de nedreguleret gener dominerende (figur 1). Kun 10 ud af 297 cytobands også fået større og statistisk signifikant hastighed, de fleste af dem ligger i disse kromosomer (Tabel S2). Cytobands med de højere satser var 19p12 (61,8%), 15q11 (52,5%) og 5p15 (45,1%). De fleste af disse Chr og cytobands blev bekræftet med PAGE-analyse (figur 1 og tabel S2), der betragter i beregningerne, foruden antallet af deregulerede gener, den gennemsnitlige værdi af fold ændring (FC, se materiale og metoder). Men 8 Chr og 29 cytobands, ikke afdækket med chi i anden-test blev også detekteret beriget af deregulerede gener med denne metode (mærket med en hævet “c” i figur 1, tabel S2), hvilket indikerer, at i modsætning til procentsats, middelværdien værdier for FC var signifikant forskellige i forhold til det globale gennemsnit

En høj statistisk signifikant positiv korrelation (p 0,01). blev fundet mellem værdierne for QRT-PCR og mikro-arrays i alle 23 gener evalueret med begge metoder . Korrelationskoefficienterne varierede fra 0,61 til 1,0 og den gennemsnitlige var 0,82. Figur 3 viser den gennemsnitlige intensitet af mRNA af 9 gener placeret på 1q (PARP1), 3q (MCM2, ECT2,

NAALDL2

,

NLGN1

, TNFSF10 og

RFC4

) og 5p (

TRIO, CLPTM1L

), som blev evalueret med QRT-PCR og microarrays. Disse forsøg antydede, at hele datasættet af HG1.0ST mikroarrays var pålidelige.

Panel A viser eksperimenter af mikroarrays og panel B de QRT-PCR-forsøg. Paneler viser middelværdien ± standardafvigelse udtryk intensitet af 9 KN-ændrede gener placeret på 1q (

PARP1

), 3q (

MCM2

,

ECT2

,

NAALADL2

,

NLGN1

,

TNSF10

og

RFC4

) og 5p (

TRIO og CLPTM1L

). For begge metoder intensiteter er udtrykt i relative enheder (se materialer og metoder).

Korrelation af kopi-nummer ændringer med genekspression

Analyse af genekspression i hele sættet af CNAs og materialefjernelseshastigheder.

Kun 63% af KN-ændrede gener kunne evalueres for ændringer i genekspression med mikrochip HG1.0ST. På den anden side, fra 20,741 gener undersøgt for ændringer i ekspression i gennemsnit 35,4% af dem blev identificeret med potentielle ændringer i kopiantal i cellelinjer (tabel 1). Andelen af ​​deregulerede gener var lidt højere i gruppen af ​​gener med KN ændringer end i gruppen af ​​gener uden KN ændringer (15,6% vs. 14,8%; p 0,05, chi-square). En højere forskel blev fundet i gruppen af ​​tilbagevendende ændrede gener (18,8% vs. 14,9%; p = 0,0035, chi-square). Disse små forskelle kunne tyde på enten at de fleste gener er identificeret med potentielle ændringer i kopien nummer er faktisk ikke slettet eller vundet, eller at de er ændret i kopi nummer uden ændringer i genekspression. I det første tilfælde kan den CNA’er have været CN-ændrede diskontinuerligt. I den anden, de CNAs var formentlig CN-ændret kontinuerligt, men genekspression kunne have været moduleret af andre faktorer. Interessant i gennemsnit 69,1% af potentielt CN-ændrede gener i hver cellelinje ikke have ændret SNPs; snarere, blev de placeret mellem 2 ændrede SNP’er i CNA’er (fig S1). Resten (30,9%) havde fra 1 til 282 ændrede SNPs (betyder, 6 ± 10). Det blev imidlertid forventet, at gener lokaliseret i en fuldt ændret region ville blive dereguleret lignende måde, uanset antallet af SNP’er.

En indirekte måde at teste denne hypotese var globalt at undersøge, om procentdelen af ​​deregulerede gener stiger som antal SNP’er /gen eller området stiger. I hele sættet af CNAs, har hastigheden for deregulerede gener ikke vokse med antallet af SNP’er pr CNA steg, men snarere forbliver ensartet omkring 15,6% (figur 4A). Derimod i materialefjernelseshastigheder, øget tendens fra 14,5% i gener lokaliseret i materialefjernelseshastigheder med 1-100 SNPs til 36,1% i gener lokaliseret i materialefjernelseshastigheder med mere end 500 SNPs (p data ikke vist). Disse data tyder på, at materialefjernelseshastigheder med højere antal SNP’er er mere tilbøjelige til at være helt CN ændret. Den omstændighed, at procentdelen af ​​deregulerede gener forøget lineært som antallet af ændrede SNPs pr gen steg (p 0,01, Mantel-Haenszel lineær-by-lineær association chi-squared test, figur 4B), tyder på, at mange af disse regioner var CN-ændret diskontinuert.

figuren viser de procentvise tendenser i deregulerede gener som antallet af KN-ændrede SNP’er pr region (panel A) eller gen (panel B) steg. MRR omfatter generne huses af de minimale tilbagevendende regioner er fælles for de 4 cellelinjer. Den lineære sammenhæng mellem de variable i alle undtagen en plot (CNAs, panel A) var statistisk signifikant, p. 0,01, Mantel-Haenszel lineær-by-lineær association chi-squared test

En lagdelt analyse blev udført for at klarlægge den præcise forhold mellem disse variabler. I puljen af ​​CNA’er, procentdelen tendens deregulerede gener øges med antallet af SNP’er /genet, enten de var placeret i CNAs have mindre eller mere end 500 SNP’er eller lav eller høj tæthed af SNP’er (data ikke vist). Disse data antyder fleste CNAs ikke CN-ændrede kontinuerligt. I sæt af tilbagevendende ændrede gener, udviklingen i deregulerede gener afveg hvis de var placeret i materialefjernelseshastigheder med mindre eller mere end 500 SNPs. I førstnævnte gruppe, var den samme som observeret i hele sættet af CNAs tendensen (p 0,001, Mantel-Haenszel lineær-by-lineær association chi-squared test figur 5A), hvilket tyder på at de blev også CN-ændret diskontinuert. Det er bemærkelsesværdigt, at i de diskontinuerte CNAs (data ikke vist) eller materialefjernelseshastigheder, ascendant tendens skyldes nedreguleret gener, enten de blev slettet (for materialefjernelseshastigheder, p = 0,01, Spearmans korrelation, figur 5B) eller forstærkes (for materialefjernelseshastigheder , p 0,01, Spearmans korrelation, figur 5C). I tilfældet med de 2 amplificerede materialefjernelseshastigheder der har mere end 500 SNP’er, selv om tendensen af ​​deregulerede gener faldt en smule fra 40,8% til 28,6% med antallet af SNP’er /genet (figur 5A), var det ikke statistisk signifikant (p = 0,333, Mantel-Haenszel lineær-by-lineær association chi i anden-test). Det er bemærkelsesværdigt, at denne undergruppe af materialefjernelseshastigheder viste den største procentdel af deregulerede gener (36,1%, 39 ud af 108; Figur 5D), med over 89,7% opreguleret (35 ud af 39; Fig 5D). Disse data tyder disse materialefjernelseshastigheder er mere tilbøjelige til at være helt CN ændret. Interessant, er disse 2 materialefjernelseshastigheder placeret på 5 p, allerede armen demonstreret som fuldt forstærkes. One (MRR 5-1) ligger i cytoband 5p15, og den anden (MRR 5-4) ligger i cytoband 5p14 (tabel S1).

I panel A, den procentvise udvikling i deregulerede gener sammenlignes blandt de gener lokaliseret i materialefjernelseshastigheder med 1-100, 101-500, og 500 SNP’er. Tendenserne for op- og nedreguleret gener er vist i paneler B (47 slettede materialefjernelseshastigheder, 500 SNP’er), C (51 forstærkede materialefjernelseshastigheder, 500 SNP’er), og D (2 forstærkede materialefjernelseshastigheder, 500 SNP’er). Det samlede antal gener undersøgt for ekspression og indgår i analysen af ​​paneler B, C og D var 390, 267, og 108, henholdsvis. Tallene over søjlerne angiver antallet af deregulerede gener.

genekspressionsanalyse enkelte MRR.

En anden måde at undersøge det faktiske kopi-antal status materialefjernelseshastigheder er ved at sammenligne procentdel af liberaliserede gener i hver MRR med den for hele sættet af MMRs. I princippet forventes det, at hvor MRR er faktisk slettes eller vundet, bør de fleste af de gener lokaliseret inden for dette MRR ændre ekspression på samme måde som KN ændring. Kun 61,9% (783 af 1264) af gener lokaliseret i 85 materialefjernelseshastigheder blev undersøgt for ændringer i ekspression. Den procent af de samlede deregulerede gener var 18,8% (147 af 783), og kun 32 materialefjernelseshastigheder havde en højere end denne procentdel. Det er dog kun i 4 af dem, to fik (MRR 3-13 og 5-1, Tabel S1) og 2 udgår (MRR 4-4 og 13-2, tabel S1), forskellen mod hele sættet (18,8%) var statistisk signifikant. Af særlig note er MRR 5-1, fordi 43,8% af de undersøgte gener (28 ud af 64) blev dereguleret og p-værdi var meget lav (4,5 × 10

-6; chi-square). Af disse blev 27 gener opreguleres og kun 1 (

FBXL7

) blev nedreguleret (figur 2B). Som forventet var procentdelen af ​​overudtrykte gener var ens i undergrupperne af gener med (50%) eller uden (38,9%) ændrede SNP’er (p 0,05, chi-square; data ikke vist). Den høje procentdel af opregulerede gener i begge undergrupper af gener antyder kraftigt, at denne MRR er fuldt duplikeret. De andre 3 regioner (MMRs 3-13, 4-4 og 13-2) havde en højere procentdel af deregulerede gener (57,1%, 75% og 46,2 henholdsvis), men de havde kun begrænsede gener evalueret for udtryk og p-værdier var lige under 0,05 (tabel S1). Det er vigtigt at bemærke, at hvis alle gener lokaliseret i materialefjernelseshastigheder blev udforsket og deregulerede gener blev fundet i samme forhold, ville forskellen på disse 3 materialefjernelseshastigheder fra middelværdien være stærkere, og 2 ekstra materialefjernelseshastigheder kunne identificeres (materialefjernelseshastigheder 1-4 og 19-2; tabel S1). Interessant, MRR 3-13 ligger i 3q26, en cytoband ofte forstærket i CC. De andre potentielt vundet MRR indeholder mere end 500 SNPs (MRR 5-4), er identificeret i analysen viste ovenfor, ikke har en procentdel af deregulerede gener langt højere end gennemsnittet til at være statistisk signifikant (p 0,05; chi-square test ), fordi kun 25% (n = 11) af de 44 undersøgte for ekspression gener dereguleret.

genekspressionsanalyse af kromosom arme og cytobands.

korrelation mellem CN og genekspression analyseret af kromosomale arme og cytobands var meget dårlig. Kun 5p viste en klar sammenhæng mellem CN og genekspression (figur 1), da den høje procentdel af tilbagevendende vundet SNP’er (94%) korreleret med en høj andel af opregulerede gener (27,7%). Korrelationen var specielt højere i 5p15 og 5p12 hvor hastigheden af ​​opregulerede gener øges op til 45,1% (tabel S2). I mindre grad, var højere procentdele af slettede SNP’er korreleret med berigelse af nedreguleret gener i 4p, 13q og 18q (figur 1). De øvrige 6 arme og 37 af de 43 resterende cytobands, identificeret med en høj procentdel af KN-AS, viste ikke nogen gen berigelse sammenlignet med hele genomet, herunder 3q (13,4%) og 3q26 (15,1%), der udelukkende havde vundet SNP’er men nedreguleret gener dominerende (7,8% i 3. kvartal, figur 1, og 11% i 3q26, tabel S2). Når 3q blev analyseret separat i hver cellelinje, blev en høj andel af vundne SNP’er findes i Calo (93,5%) og HeLa (87,2%, figur 6). Imidlertid er andelen af ​​deregulerede gener steg kun omkring 2 gange i HeLa (23,4%), men ikke i Calo (12,7%) sammenlignet med den i CaSki (13,9%) og SiHa (9,4%). På den anden side, 4q, 5q, 6Q, 14q, 15q, 16q, 16p, 17q, 19p og 20Q, som også viste en berigelse af liberaliserede gener, havde ingen eller en meget lav procentdel af KN-AS (figur 1). Dette er også tilfældet for 31 af de 39 cytobands der viste en signifikant berigelse af deregulerede gener. Det er især berygtet i 15q11 og 19p12, som ikke havde tilbagevendende ændret SNP’er, men viste nedreguleret mere end 50% af de udforskede gener (Tabel S2).

Panel A viser kopitallet log

2 forholdet mellem SNP’er undersøgt i Chr 3 ved 100 K SNP mikroarray i HeLa, CaSki, SiHa og Calo. Paneler B til D viser fold ændring af genekspression af gener evalueret af ST1.0 udtryk microarray placeret på 3q26 (n = 73), 3q27 (n = 63), og 3q28-29 (n = 66). Generne er ordnet i henhold til den position i genomet. Se legenden i figur 2 for yderligere information.

Analyse af 5p, 3q og 1q.

Selvom den fulde 5p arm syntes at blive forstærket (figur 2A), er det værd bemærke, at omkring 2/3 af gener placeret i denne arm ikke var liberaliseret, og fra de deregulerede gener, 9 blev fundet nedreguleret (figur 2B-D). Endvidere blev andelen af ​​deregulerede gener ikke jævnt fordelt langs 5p, fordi det var meget højere i MRR 5-1 (5p15, 43,8%, figur 2B) end i MRR 5-4 (5p14.3-5p13.2; 25% , figur 2C) og MRR 5-5 (5p13.1-5p12; 24,3%, figur 2D). Nedreguleret gener var næsten fraværende i MRR 5-1, men steg i materialefjernelseshastigheder 5-4 og 5-5. Det er bemærkelsesværdigt, at 48,8% af deregulerede gener i 5p, især i MRR 5-1, blev fordelt i klynger på 2 eller flere sammenhængende deregulerede gener (figur 2B). Denne fordeling var statistisk signifikant fra en tilfældig fordeling (p 1 × 10

-8, chi i anden-test), hvilket antyder, at ud over segmentet amplifikation, placeringen af ​​gener i den samme region i kromatin, eventuelt til en løkke plan, kan påvirke genekspression. Adskillige gener tidligere rapporteret, og formodes at være involveret i livmoderhalskræft carcinogenese, ligesom

BRD9

,

POLS

,

SDHA

, og

TRIO

, blev også identificeret opreguleret og beliggende i MRR 5-1 (figur 2B).

Figur 6 viser intensiteten (log

2-forhold) af undersøgte i Chr 3 (figur 6A) og ekspressionen gange ændring af gener SNPs evalueret på 3q26-29 (figur 6B-D), hvor der er gener ofte identificeret eller forbundet med CC. Kun 3q26 havde materialefjernelseshastigheder (materialefjernelseshastigheder 3-11, 3-12, 3-13, og 3-14, figur 6B). En meget lav procentdel af deregulerede gener pr cytoband vises (~13%), især i 3q28 /3q29. Men 31,9% af deregulerede gener, i lighed med dem, der undersøges i 5p blev placeret sammen i grupper på 2 eller flere gener, indskudte med adskillige gener uden ændringer i genekspression. I tilfælde af 3q26 (figur 6B), der er en klynge, på linie med materialefjernelseshastigheder 3-13 og 3-14, herunder 3 nedreguleret (

TNFSF10

,

NLGN1

, og

NAALADL2

) og 2 opreguleres gener (

AADACL1

og

ECT2

). På den anden side er der 1 MRR (3-12), havde gener med ingen ændringer i genekspression. I 3q27, der er en klynge med 5 overudtrykte gener (

ALG3

,

ECE2

,

CAMK2N2

,

PSMD2

, og

EIF4G1

). Det er bemærkelsesværdigt, at gener som

tert

,

PIK3CA

(3q26), og

LAMP3

(3q27) blev hverken KN ændret gentagne eller opreguleret (Figur 6B og C).

Figur 7 viser signalintensiteten (log

2-forhold) af undersøgte i Chr 1 (figur 7A) og MRR 1-15 (figur 7F) SNP’er, ekspressionen gange ændring af gener evaluering 4 materialefjernelseshastigheder (1-8, 1-9, 1-14 og 1-15, figur 7B-E) og kopiantallet af PARP1 genet evalueret af qPCR (7G). I lighed med 3. kvartal, hvor stor en procentdel af deregulerede gener pr cytoband i 1q var meget lav (gennemsnit = 13%), og kun 1q21 havde en højere sats end hele genomet (22,2%, tabel S2). Selv i de materialefjernelseshastigheder, kun gennemsnitligt 17% af gener var de-reguleret (beregnet ud fra tabel S1) og den lille forskel (2,5%) sammenlignet med hele 1q (14,5%, figur 1), ikke var statistisk signifikant. I figurerne 7B-E er vist materialefjernelseshastigheder (1-8, 1-9, 1-14 og 1-15), som havde større antal gener udforskes for ændringer i ekspression (tabel S1). I MRR 1-9 (fig 7C), det er berygtet, at ingen af ​​de 27 gener udforsket blev opreguleret i stedet to af dem blev nedreguleret (MNDA og DARC). I modsætning hertil MRR 1-15 (figur 7E), 7 af 33 (21,2%) udforskede gener blev opreguleret, herunder PARP1. I lighed med 5p og 3q, de deregulerede gener var ofte (37,9%) placeret sammen i grupper på 2 eller flere gener indskudt med adskillige gener uden ændringer i genekspression. Dette ses tydeligt i materialefjernelseshastigheder 1-8 (figur 7B), 1-14 (figur 7D) og 1-15 (figur 7E). Amplifikationen af ​​PARP1 genet blev valideret i de fire cellelinier ved qPCR med en TaqMan assay (figur 7G). Interessant, antallet af kopier korrelerede med den gennemsnitlige intensitet (log2 forholdet) af de 110 SNP’er placeret i MRR 1-15 udforskes med 100 K microarray (figur 7F). Betragtninger Calo, CaSki og HeLa havde omkring 4 kopier af PARP1 genet og en log2 forhold omkring 0,2, SiHa havde 10 kopier og en log2 ratio på 0,4.

Panel A viser kopi nummer log2 forholdet mellem SNPs undersøgt i Chr 1 af 100 K SNP mikroarray i HeLa, CaSki, SiHa og Calo. Paneler B til D viser fold ændring af genekspression af gener evalueret af ST1.0 udtryk microarray placeret på materialefjernelseshastigheder 1-8, 1-9, 1-14 og 1-15. Generne er ordnet efter position i genomet. For panel F, gennemsnittet ± S.D. af log2 forholdssignal af 110 SNP’er placeret i MRR-15 blev afbildet. I panel G er vist kopiantallet af PARP1 gen beregnet af qPCR i tredobbelte eksperimenter. Se legenden i figur 2 for yderligere information.

Fluorescerende in situ hybridisering (FISH)

Det eksemplar nummer 5p15 region, hvor MRR 5-1 er placeret, blev undersøgt en. b. c. d. en. b. c. d. en. b. en. b.