PLoS ONE: høj ekspression af IGFBP7 i fibroblaster induceret af kolorektal Cancer Cells Er Co-Reguleret af TGF-β og Wnt signalering i en Smad2 /3-Dvl2 /3-afhængig måde

Abstrakte

fibroblaster i tumor mikromiljø er en afgørende faktor i kræft progression og kan være et lovende mål for kræftbehandling. Insulin-lignende vækstfaktor bindende protein 7 (IGFBP7) er kendt som en tumorsuppressor i kolorektal cancer (CRC). Den foreliggende undersøgelse undersøgte den induktive mekanisme IGFBP7 ekspression i fibroblaster ved supernatant fra CRC cellelinie SW620. Resultaterne viste, at ekspressionen af ​​IGFBP7 var opreguleret i fibroblasterne, når de behandles med SW620 supernatant og exogent TGF-β1. Den IGFBP7 induceret af SW620 supernatant eller TGF-β1 blev delvist inhiberet af TGF-β1 specifikt antistof AF og TGF-β1-receptorantagonist SB431542. Wnt signaling målrettede gener, c-Myc, CCND1 og proteinerne Dvl2 /3, blev alle opreguleret i fibroblaster udtrykker høje niveauer af IGFBP7, og opreguleringen kunne inhiberes både af Wnt signalering antagonist Dickkopf-1 ( DKK1) og af TGF-β1-receptorantagonist SB431542. Afslutningsvis CRC-celler fremmer høj ekspression af IGFBP7 i fibroblaster, sandsynligvis gennem co-regulering af TGF-β og Wnt signalering i en Smad2 /3-Dvl2 /3 afhængig måde. Tilsammen tyder disse data, at fibroblaster kunne være en roman terapeutisk mål i tumor terapi

Henvisning:. Rao C, Lin SL, Ruan WJ, Wen H, Wu DJ, Deng H (2014) høj ekspression af IGFBP7 i fibroblaster induceret af kolorektal Cancer Cells Er Co-Reguleret af TGF-β og Wnt signalering i en Smad2 /3-Dvl2 /3-afhængig måde. PLoS ONE 9 (1): e85340. doi: 10,1371 /journal.pone.0085340

Redaktør: Neil A. Hotchin, University of Birmingham, England

Modtaget: Juli 7, 2013; Accepteret: December 4, 2013; Udgivet: 10. januar, 2014

Copyright: © 2014 Rao et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Natural Science Foundation i Zhejiang-provinsen (LY12H16027), National Natural Science Foundation of China (30.870.971) og Major Program for National Natural Science Foundation of China (81.090.420, 81.090.421). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kolorektal cancer (CRC) er en af ​​de mest ondartede tumorer truer menneskets overlevelse verdensplan, ranking tredje blandt alle maligne tumorer [1]. Invasionen og metastase af tumorceller er den vigtigste dødsårsag. De fleste undersøgelser har fokuseret på selve tumoren, men den vigtige rolle mikromiljøet i tumorudvikling er også blevet almindeligt anerkendt.

En tumor kan opfattes som et sår, der ikke heler, dets invasion og metastase er ikke kun bestemt af de kræftceller, men også af tumorstroma [2]. Micro-metastaser danne længe før en tumor kan diagnosticeres, og tumor-stroma interaktion spiller en vigtig rolle under tumorprogression. Fibroblaster er en af ​​de vigtigste celle komponenter i tumorstroma, hvor de altid erhverve en aktiveret fænotype [3]. Ligesom i fibrose, forbliver fibroblaster i tumorer vedvarende aktiveres; de udskiller og modulere den ekstracellulære matrix (ECM) i stroma, som spiller en vigtig rolle under tumorprogression [3] -. [5]

IGFBP7 er et secerneret protein, som vides at være en tumorsuppressor i bryst- , hjerne, colon, lunge, lever og pancreascancer [6] – [11]. Det er en celle-klæbende glycoprotein fra -30 kD [12]. In vivo er forskellige ekspressionsmønstre for IGFBP7 findes i forskellige tumortyper. IGFBP7 ekspression er lav i glioblastom, lungecancer, pancreascancer og leverkræft [6], [9], [10], [13], mens både forøget og nedsat ekspression af IGFBP7 er blevet rapporteret i bryst- og prostatacancer [14] – [17]. Disse fund tyder på, at rollen som IGFBP7 i tumorceller er kompleks, men undersøgelser af IGFBP7 i tumor stromaceller selv er sjældne. I en rapport, blev IGFBP7 fundet at fremme angiogenese i endotelceller [18], selv om den nøjagtige rolle IGFBP7 i fibroblaster er stadig ukendt.

Under tumor-stroma-interaktioner, fibroblaster kan påvirkes af parakrin signalering genereret af cancerceller. Blandt disse signalings, er TGF-β antages at være den mest potente én. TGF-p-aktiverede fibroblaster skabe et vigtigt pro-invasion og pro-angiogenese niche for tumorudvikling [19] – [21]. Det er blevet rapporteret, at TGF-β-signalering virker hovedsageligt gennem Smad pathways [22]. Efter aktivering, TGF-β ligand binder til TGF-β-receptor I /II (TβRI /II), og de phosphorylerede TβRI rekrutterer og phosphorylerer receptor-regulerede Smads (R-Smads). Den TβRII-ALK5 kompleks aktiverer Smad2 /3, mens TβRII-ALK1 kompleks aktiverer Smad1 /5/8. Når den er aktiveret, R-Smads phosphorylerer og danner komplekser med Smad4, og flytte ind i kernen for at regulere transkriptionelle aktivitet [23].

Udover TGF-β-signalering, Wnt signalering spiller også en vigtig rolle i CRC udvikling . Rapporter har påpeget, at -90% af CRC tilfældene skyldes mutationer af Wnt signalvejen [24]. Ved kanoniske Wnt-aktivering, Wnt-ligander binder til Frizzled receptorer og LRP (low-density lipoprotein receptor-relateret protein) at fremme phosphorylering af LRP i et Dvl-afhængig måde [25], [26]. Derefter p-LRP rekrutterer Axins fra nedbrydningen komplekset til cellemembranen, hjælper β-catenin at undslippe nedbrydning. De akkumulerede β-catenin bevæger sig fra cytoplasmaet til cellekernen, og danner et transkriptionsaktiveringsdomæne kompleks med TCF /LEF. TCF /LEF-β-catenin nukleare kompleks aktiverer transkriptionen af ​​Wnt signaling target gener, såsom c-myc, CCND1, FGF20, DKK1 og WISP1, som regulerer celleproliferation og differentiering [26] – [29].

i denne undersøgelse anvendte vi supernatanten fra SW620, en CRC cellelinie, som er afledt af den metastatiske tumor i et colorektalt carcinom, og HELF som er en af ​​de kanoniske fibroblast cellelinjer. Det faktum, at både SW620 og HELF er IGFBP7 negative cellelinjer gør fortolkning af vores resultater mere entydig. Formålet med denne undersøgelse er at undersøge udtryk mønster af IGFBP7 i fibroblaster og mekanismen bag det.

Materialer og metoder

Reagens og antistoffer

TGF-β1 rekombinant protein blev købt fra PeproTech, USA. AF (TGF-β1 neutraliserende antistof) og DKK1 rekombinant protein blev indkøbt fra R Kanin-anti-β-actin-antistof, Santa Cruz, USA. Sekundære antistoffer for Odyssey blev indkøbt fra Li-COR, USA.

Cellekulturer

fibroblast (HELF) og CRC-cellelinje SW620 var begge dyrket i RPMI1640 (Gibco, USA) suppleret med penicillin- streptomycinopløsning (100 U /ml penicillin, 0,1 mg /ml streptomycin, Gibco, USA), 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum, 50% supernatant af CRC-cellelinje SW620. Dyrkningsmedium blev skiftet dagligt i 3 dage, for begge cellelinier. Alle cellelinjer blev holdt ved 37 ° C i en CO 5%

2 atmosfære.

Fremstilling af SW620 supernatant

CRC cellelinje SW620 blev udpladet i dyrkningskolber (8 × 10

5 celler) i RPMI1640 tilsat penicillin-streptomycin Solution (som ovenfor), og 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (Gibco, USA). Alle cellelinjer blev holdt ved 37 ° C i en CO 5%

2 atmosfære. Supernatanten (SW620-S) blev opsamlet efter 2 dage, filtreret med et 0,22 um filter membran (Millipore, Irland) og opbevaret ved -80 ° C.

Cell behandling Salg

fibroblaster dyrket i dyrkningskolber blev vasket med PBS to gange og derefter erstattet af RPMI1640 alene eller 50% RPMI1640 suppleret med 50% frisk SW620-S, forskellige koncentrationer af rekombinant TGF-β1 protein, med eller uden aF, SB431542 for forskellige tidsrum; behandlingerne blev opdateres hver 3. dag, og ekspressionen af ​​IGFBP7 blev påvist ved kvantitativ realtids-PCR, RT-PCR og Western blot-analyse.

Kvantitativ realtids-PCR (Q-PCR) og RT-PCR

Totalt RNA fra behandlede eller ubehandlede fibroblaster blev ekstraheret med TRIzol Reagent (Invitrogen, USA) og revers transkriberet til cDNA under anvendelse af Superscript II revers transkriptase (Takara, Japan). Q-PCR-reaktioner blev udført med SYBR Premix Ex Taq (Takara, Japan) på ABI 7900HT Hurtig Real-Time PCR System (Applied Biosystems, USA). Primere anvendt til Q-PCR blev udformet ifølge GeneBank (tabel S1). Q-PCR var som følger: 10 sekunder denaturering ved 95 ° C, 5 sekunder denaturering ved 95 ° C, 30 sekunder annealer forlængelse ved 60 ° C i 40 cykler. Fluorescens blev detekteret ved afslutningen af ​​hver fase. Den udskrift af IGFBP7 blev normaliseret til referatet niveau af husholdning gen GAPDH. RT-PCR-reaktioner blev udført med Taq (Takara, Japan). RT-PCR-betingelser var som følger: 5 minutters denaturering ved 94 ° C, 30 sekunder denaturering ved 94 ° C, 30 sekunder annealing ved 59 ° C, 30 sekunder forlængelse ved 72 ° C i 30 cykler, 5 minutter forlængelse ved 72 ° C. Udskriften af ​​IGFBP7 var normaliseret til udskrift niveau af husholdning gen GAPDH.

Western blot-analyse

Fibroblaster blev lyseret i RIPA buffer. Cellelysaterne blev centrifugeret ved 1,33 × 10

5 rpm i 1 time ved 4 ° C, og proteinindholdet i supernatanten blev målt under anvendelse BCA proteinassay. 50 ug totalt proteinekstrakt blev fyldt i en 10% SDS-PAGE-gel og derefter proteiner blev overført til nitrocellulose-membran (Bio-Rad, USA). Membranen blev blokeret med 5% skummetmælk TBST (25 mM Tris-HCI, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,05% volumen /volumen Tween-20) i 2 timer ved stuetemperatur og inkuberet med primært antistof (1:1000) natten over ved 4 ° C. Efter vask med TBST 3 gange, blev blots probet med sekundært antistof (1:5000) i 1 time ved stuetemperatur. β-actin blev anvendt til at normalisere mængden af ​​proteinet indlæst prøve. Immunoblots blev scannet med Odyssey (LI-COR, USA). Semikvantitativ vurdering af båndene blev udført ved densitometrisk analyse med ImageJ software.

immunfluorescensmikroskopi

Celler på dækglas blev fikseret i kold acetone i 10 minutter. Dækglas med celler blev derefter vasket med PBS 3 gange i 5 minutter ved stuetemperatur, derefter permeabiliseret i 0,05% Triton X-100 i 20 minutter og blokeret med 10% normalt bovint serum i 30 minutter. Celler blev inkuberet med primære antistoffer fortyndet i PBS natten over ved 4 ° C. Dækglas blev vasket i PBS før inkubation i 1 time med sekundære antistoffer og 20 minutter med DAPI (1: 5000; Invitrogen). Billeder blev taget af en Zeiss LSM510 konfokal mikroskop.

Dataanalyse

Resultaterne blev udtrykt som middel ± S.E.M. af 3 eksperimenter. Den uparrede t-test blev anvendt til enkelte sammenligninger af grupper med lige varians og normalfordeling. Variansanalyse (ANOVA) efterfulgt af Newman-Keuls posttest blev anvendt til at sammenligne flere data til hver gruppe. Statistisk analyse blev udført under anvendelse af Prism software (GraphPad, USA).

P

værdier mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

Høj IGFBP7 udtryk i fibroblaster er fremkaldt af SW620-S

I betragtning af den tumor- suppressor rolle IGFBP7 i CRC cellelinier [30] og den høje ekspression i den invasive foran CRC tumorer (ikke offentliggjorte resultater), viste de foreliggende undersøgelsesresultater, SW620-S induceret IGFBP7 ekspression i fibroblaster, efter inkubation af fibroblaster i nærvær af SW620-S for forskellige længder af tid. Resultaterne viste, at SW620-S væsentlige opreguleret niveauet af IGFBP7, sammenlignet med kontrolgruppen. Fibroblaster udsat for SW620-S viste en tidsafhængig opregulering af IGFBP7 mRNA (figur 1A og 1B). Desuden blev den høje IGFBP7 ekspression også påvist i fibroblaster behandlet med supernatanten fra de andre to CRC cellelinier HT29 og LoVo (figur 1C og 1D, fig S1).

A. B. IGFBP7 mRNA-ekspression bestemt ved RT-PCR (A) og Q-PCR (B) i fibroblaster eksponeret for SW620-S i 0, 2, 4 og 6 dage henholdsvis. C. D. IGFBP7 mRNA-ekspression bestemt ved RT-PCR i fibroblaster udsat for HT29-S (C) og LoVo-S (D) i 0, 2, 4 og 6 dage. MRNA-niveauet blev normaliseret med den for GAPDH i den samme celle ekstrakter. *

P

. 0,05 mellem SW620-S-behandlede fibroblaster og kontrolgruppen (0 dage)

TGF-β1 i SW620-S inducerer IGFBP7 udtryk i fibroblaster

tidligere undersøgelse af de faktorer, der udskilles af CRC-cellelinier har vist, at cancerceller secernerer TGF-β1 i løbet af tumor-stroma-interaktioner [31]. Hvis det antages, at IGFBP7 induktion skyldtes TGF-β1, blev fibroblaster eksponeret for 5 ng /ml af exogen TGF-β1; de viste en tidsafhængig stigning i IGFBP7 mRNA (figur 2A og 2B). Endvidere fibroblaster udsat for forskellige koncentrationer af exogen TGF-β1 i området fra 5 ng /ml til 20 ng /ml for 6 dage viste en dosisafhængig stigning i IGFBP7 mRNA (figur 2C og 2D). Dataene viste, at ekspressionen af ​​IGFBP7 afhænger ikke kun til tiden, men også af koncentrationen af ​​TGF-β.

A. B. IGFBP7 mRNA-ekspression bestemt ved RT-PCR (A) og Q-PCR (B) i fibroblaster udsat for RPMI1640 eller 5 ng /ml TGF-β1 i 0, 2, 4 og 6 dage. C. D. IGFBP7 mRNA-ekspression i fibroblaster eksponeret for 0, 5, 10 og 20 ng /ml TGF-β1 i 6 dage bestemt ved RT-PCR (C) og Q-PCR (D). EFs fibroblaster blev behandlet med SW620-S eller 5 ng /ml TGF-β1 i nærvær af 0, 20, 200 ng /ml AF til 6 dage, IGFBP7 mRNA i fibroblaster blev detekteret ved RT-PCR (E), og Q-PCR (F). MRNA-niveauet blev normaliseret med den for GAPDH i den samme celle ekstrakter. *

P

0,05 mellem SW620-S /TGF-β1-behandlede fibroblaster og kontrolgruppen.

+

P

0,05 mellem SW620-S-behandlede fibroblaster med eller uden 20 ng /ml AF.

++

P

0,05 mellem SW620-S-behandlede fibroblaster med eller uden 200 ng /ml AF.

#

P

0,05 mellem TGF-p1-behandlede fibroblaster med eller uden 20 ng /ml AF.

##

P

. 0,05 mellem TGF-p1-behandlede fibroblaster med eller uden 200 ng /ml AF

For at kontrollere, at TGF-β1 blev proteinet udskilles af CRC-celler er ansvarlige for IGFBP7 induktion, anvendte vi immunodepletion med et TGF-β1-specifikt antistof (20 ng /ml aF) for at fjerne TGF-β1 fra SW620-S. Dette immundepleteret SW620-S undlod at fremkalde IGFBP7 i fibroblaster (Figur 2E). Fibroblaster behandlet med SW620-S eller TGF-β1 i nærvær af AF delvist inhiberede IGFBP7 induceret af SW620-S eller TGF-β1 alene, hvilket indikerede, at TGF-β1 var den vigtigste, men ikke den eneste faktor, der inducerede IGFBP7 ( Figur 2F).

høj IGFBP7 udtryk i fibroblaster er primært gennem TGF-β /ALK5 /Smad2 signalvejen

i TGF-β-signalering, den TβRII-ALK5 kompleks phosphorylerer Smad2 /3. For at afgøre, om induktionen af ​​IGFBP7 var gennem Smad2-afhængige signalering, blev SB431542 (en selektiv antagonist af TGF-β /ALK5 /Smad2 signalering) tilsat til fibroblaster. I fibroblaster eksponeret for SW620-S eller exogent TGF-β1 med 10 pM SB431542, den IGFBP7 induktion var delvist inhiberet (figur 3C og 3D). Høj ekspression af P-Smad2 blev påvist i fibroblaster behandlet med SW620-S for forskellige tidsrum. Denne opregulering af P-Smad2 var tidsafhængig og nåede et højdepunkt på dag 6 (figur 3B). Niveauerne af p-Smad2 (figur 3E) og TβRII (figur 3A) steg med SW620-S eller eksogen TGF-β1 blev reduceret til det normale niveau ved SB431542, hvilket indikerede, at denne opregulering var gennem TβRII-ALK5-Smad2 /3-vejen.

A. Ekspressionen af ​​TβRII blev detekteret ved Western blot. B. fibroblaster blev eksponeret for SW620-S i 0, 2, 4 og 6 dage, og p-Smad2 blev detekteret ved Western blot. De proteinniveauer blev normaliseret med den for β-actin i den samme celle ekstrakter. C.D. Fibroblaster blev eksponeret for SW620-S eller TGF-β1 i nærvær af 10 uM SB431542 i 6 dage, og IGFBP7 mRNA-ekspression blev påvist ved RT-PCR (C) og Q-PCR (D). MRNA-niveauet blev normaliseret med den for GAPDH i den samme celle ekstrakter. E. fibroblaster blev eksponeret for SW620-S eller TGF-β1 med 10 pM SB431542 i 6 dage, og ekspressionen af ​​Smad2, p-Smad2 (E) blev påvist ved Western blot. De proteinniveauer blev normaliseret med den for β-actin i den samme celle ekstrakter.

*

P

0,05 mellem SW620-S /TGF-β1-behandlede fibroblaster og kontrolgruppen.

+

P

0,05 mellem SW620-S-behandlede fibroblaster med eller uden SB431542,

#

P

0,05 mellem TGF-p1-behandlede fibroblaster med eller uden SB431542.

IGFBP7 opregulering i fibroblaster er delvist gennem aktivering af kanoniske Wnt signalvej

Siden Wnt signalvejen regulerer aktivering af fibroblaster, vi satte sig for at afgøre, om Wnt , især den kanoniske Wnt signalvejen, var en anden regulator. Fibroblaster behandlet med SW620-S viste høj ekspression af c-myc og CCND1, downstream målgener af Wnt-signalering, i en tidsafhængig måde. Den kanoniske Wnt signalering protein β-catenin detekteret ved Western blot (fig S2A) blev forøget og aktiveret som vist ved immunofluorence mikroskopi (figur S2B), som indikerede, at kanoniske Wnt signalering blev aktiveret under IGFBP7 opregulering (figur 4A og 4B).

A. B. fibroblaster blev behandlet med SW620-S i 0, 2, 4 og 6 dage, og mRNA ekspression af Wnt signalering målgener c-myc (A) og CCND1 (B) mRNA-ekspression blev vurderet ved Q-PCR. C-E. Fibroblaster blev behandlet med SW620-S i nærvær af 50 ng /ml DKK1 (Wnt-antagonist) i 6 dage, og IGFBP7 mRNA-ekspression blev påvist ved RT-PCR (C) og Q-PCR (D). MRNA-ekspression blev normaliseret med den for GAPDH i den samme celle ekstrakter. Wnt signalering protein Dvl3 blev påvist i fibroblaster ved Western blot (E). Proteinekspression blev normaliseret med den for β-actin i samme celleekstrakt. *

P

0,05 mellem SW620-S-behandlede fibroblaster og kontrolgruppen. **

P

0,05 mellem DKK1-behandlede fibroblaster og kontrolgruppen.

+

P

. 0,05 mellem SW620-S-behandlede fibroblaster med eller uden DKK1

Efter at have vist, at Wnt signalering blev aktiveret, så undersøgte vi forholdet mellem dette aktivering og den høje ekspression af IGFBP7. DKKs udskilles glycoproteiner, der vides at antagonisere kanoniske Wnt signalering [32]. Når fibroblaster blev behandlet med DKK1, den høje ekspression af IGFBP7 induceret af SW620-S blev delvist hæmmet (figur 4C og 4D). Wnt signalproteiner Dvl2 /3 detekteret ved Western blot blev hæmmet med DKK1 (figur 4E), hvilket antyder, at opregulering af IGFBP7 var tæt knyttet til den kanoniske Wnt signalvejen. Derfor kan de faktorer, der er ansvarlige for den høje ekspression af IGFBP7 være TGF-β1 og Wnt-ligander som Wnt3a der aktiverede TGF-β og Wnt signalvejen.

TGF-β og Wnt kanoniske signaleringsvej samarbejder i regulering af høj ekspression af IGFBP7 i fibroblaster

for at klarlægge forholdet mellem TGF-β og Wnt signalvejen, vi behandlede fibroblaster med TGF-β1, og fandt, at det også øget niveau af c-myc , CCND1 og DKK1; Desuden blev denne opregulering delvis inhiberet af SB431542 (figur 5A-5C). Disse resultater blev set på proteinniveauet, da Dvls proteiner er positive mediatorer af Wnt signalering placeret nedstrøms for Frizzled receptorer og opstrøms for β-catenin. Dvl3 var opreguleret af TGF-β1 behandling (figur 5D), hvilket indikerer, at Wnt signalering blev aktiveret under interaktionen og denne ændring blev vendt ved TGF-β antagonist SB431542, hvilket antyder, at med TGF-β signaleringsaktivering, Wnt signalering var også aktiveret. Vi fandt derfor, at der findes en ny cross-talk mellem Wnt og TGF-β-signalering som var Dvl2 /3-Smad2 /3-afhængig.

A-D. Fibroblaster blev eksponeret for SW620-S eller TGF-β1 i nærvær af 10 uM SB431542 for 6 dage, og mRNA ekspression af Wnt-signal målgener c-Myc (A), CCND1 (B) og DKK1 (C) blev vurderet ved Q-PCR. mRNA-ekspression blev normaliseret med den for GAPDH i den samme celle ekstrakter. Ekspressionen af ​​Dvl3 blev påvist ved Western blot (D). Proteinekspression blev normaliseret med den for β-actin i samme celleekstrakt. *

P

0,05 mellem SW620-S-behandlede fibroblaster og kontrolgruppen. **

P

. 0,05 mellem TGF-p1-behandlede fibroblaster og kontrolgruppe

+

P

0,05 mellem SW620-S-behandlede fibroblaster med eller uden SB431542.

#

P

0,05 mellem TGF-p1-behandlede fibroblaster med eller uden SB431542. E. Model af høj ekspression af IGFBP7 induceret af tumorcellen-fibroblast-interaktioner. F. TGF-β-signal-aktivering opregulerer Smad2 /3 og Dvl2 /3 med opregulering af Wnt målgener c-myc, CCND1 og DKK1, således at IGFBP7 er overudtrykt.

diskussion

Disse eksperimenter har vist, at supernatanten fra SW620 cellelinje (SW620-S) induceret IGFBP7 i fibroblaster hovedsageligt gennem samregulering af TGF-β /ALK5 /Smad2 signalering og kanoniske Wnt signalering . Dette er det første bevis på den mekanisme ligger til grund for høje IGFBP7 ekspression i fibroblaster under tumor-stroma-interaktioner. Vores hypotese er, at IGFBP7 er en af ​​de nedstrøms målgener af TGF-β /Smad2 og kanoniske Wnt signalering, selvom den nøjagtige position af IGFBP7 fortsat kræver yderligere undersøgelse.

I denne undersøgelse har vi vist, at CRC-celler inducerede en høj ekspression af IGFBP7 (figur 5E). Som IGFBP7 er en tumor suppressor, har de fleste forskning om IGFBP7 fokuseret på selve tumorcellerne. I en tumor xenograft model, for eksempel overekspression af IGFBP7 hæmmede væksten af ​​melanom [33]. Hvorfor gør tumorcellerne udskiller faktorer, der inducerer IGFBP7 hvilket igen undertrykker deres egen vækst? Dette kan være resultatet af modstanden af ​​fibroblaster til tumorcellerne. Hvad er betydningen af ​​høj ekspression af IGFBP7 i fibroblaster? På nuværende tidspunkt er dette vanskeligt at vurdere, fordi der er lidt forskning om, hvilken rolle IGFBP7 i tumor stroma. IGFBP7 blev fundet stærkt udtrykt i Kar gliom [34]; det kan interagere med ekstracellulære matrix-protein til at inducere adhæsionen og migrationen af ​​endotelceller [35], [36]. Pen og kolleger rapporterede også, at IGFBP7 i endotelceller kan inducere angiogenese [18]. Andre fandt, at IGFBP7 sandsynligvis deltager i aktiveringen og proliferationen af ​​fibroblaster [37]. Disse iagttagelser antyder, at IGFBP7 i tumorceller i stroma kan spille en helt anden rolle fra IGFBP7 i stromacellerne af tumorer. Vores upublicerede data viste, at IGFBP7 kan korrelere med aktiveringen af ​​fibroblaster, men den nærmere betydning af sin høje ekspression i fibroblaster er stadig ukendt og kræver yderligere undersøgelse.

Vores resultater viste, at IGFBP7 ekspression i fibroblaster er tæt forbundet med TGF-β secerneres af CRC-celler. Også ekspressionen af ​​IGFBP7 er ikke kun tidsafhængig, men også dosisafhængig med hensyn til TGF-β. Antistoffet og inhibitor af TGF-β bekræftede dette resultat. Det er blevet rapporteret, at TGF-β-signalering også har reguleret ekspression af IGFBP7 i hjernens endotelceller [18], et yderligere eksempel på et stroma celle rum. Og vi ved, TGF-β /Smad3 signalering er blevet betragtet som tumorsuppressor under tumorprogression siden TGF-β-induceret CDKN1A (P16) og CDKN2B (P15) ekspression er korreleret med tumorinhibering [38]. anden forskning finder imidlertid, at CTGF og PAI-1, den nedstrøms målgen af ​​TGF-β /Smad3 signalering, er korreleret med en høj risiko for metastase i brystcancer [39]. Det foreslår TGF-β /Smad3 kan omvendt fremme invasionen og migration i det sene stadie af tumordannelse [40], [41]. Derfor spekulerer vi, at TGF-β secerneres af cancerceller fremmer IGFBP7 ekspression i fibroblaster kan mindske tumor suppressor rolle for fibroblaster i tumorvæv.

Forholdet IGFBP7 og Wnt-signalering er ikke undersøgt, og vores undersøgelse er den første til at vise, at Wnt signalering kan regulere ekspressionen af ​​IGFBP7 i fibroblaster. Det er blevet rapporteret, at Wnt /β-catenin signalering regulerer differentieringen af ​​fibroblaster, hvilket antyder, at Wnt /β-catenin signalering er en vigtig regulator af fibroblast fænotype [42]. Dette antyder, at Wnt signalering kan påvirke IGFBP7 gennem mediering differentiering status fibroblaster.

Wnt signalering vides at blive aktiveret, når fibroblaster aktiveres af TGF-β [43]. Her har vi bemærket, at Wnt signalering er aktiveret under IGFBP7 induktion i fibroblaster af TGF-β. Det er mærkeligt, at bortset fra c-myc og CCND1, ekspressionen af ​​DKK1 var også opreguleret af TGF-β. Vi ved, at DKK1 er en kanonisk antagonist af Wnt-signalering. Disse offentliggjorte resultater er derfor i strid med vores resultater. Men derudover må vi konstatere, at DKK1 er også target-genet af Wnt signalering [28]. Dette kan være en negativ feedback-mekanisme mellem disse to signalveje. Disse to signaler kan samarbejde under IGFBP7 induktion i fibroblaster. Med hensyn til, hvordan de samarbejder: Vi fandt, at de var forbundet med Smad2 /Dvl3. Der er flere forklaringer på interaktionen mellem disse to signalveje. En tilstand af interaktionen mellem Wnt /β-catenin og TGF-β /Smads signaler er samspillet mellem Smads og β-catenin /TCF4 [44]. En anden tilstand kan være ved Wnt5a inducere dannelsen af ​​MARK2 /Dvl3 /Smad4 komplekset [45]. Endnu en anden tilstand kan være Wnt3a fremme en cancerassocierede fibroblaster-lignende fænotype i fibroblaster, delvist gennem TGF-β /Smad2 signalering aktivering ved en β-catenin-afhængig mekanisme [46], hvilket indikerer, at Wnt og TGF-β-signalering er knyttet af Smad. Fra vores resultater, i fibroblaster, aktivering af Wnt induceret af TGF-β var mest sandsynligt gennem opregulering af Smad og Dvl3. Vi konkluderer derfor, at Dvl3 kan være en roman punkt i krydstale mellem TGF-β og Wnt signalveje i fibroblaster. Smad2 /3 og Dvl2 /3 kan danne en slags forbindelse, der kunne forbinde TGF-β og Wnt-signalering (fig 5F). Det er blevet rapporteret, at TGF-β og Wnt signalering co-regulere bestemmelse af mesenkymale stamceller celleskæbner i mammae celler, inklusiv induktion af cancer stamceller. Derfor kan kombinationen af ​​disse to signalveje være en mekanisme bag nogle forhold som fibrotiske sygdomme [47] -. [49]

Vi ved, at parakrin signalmolekyler udskilt af CRC celler under tumor stroma interaktioner omfatter TGF -β, Wnt og nogle andre faktorer, og at disse kan ændre de omkringliggende fibroblaster. Vi ved også, at fibroblaster i tumor stroma er ansvarlige for syntesen af ​​MMP og kollagen fibre. MMP’er hjælp tumorceller invaderer basalmembranen, mens kollagen fibre giver tumorceller med en bekvem fysisk substrat, hvorover at migrere [50]. Dette er grunden til fibroblaster i tumor stroma er blevet kaldt “Distant angribere og switchere” [51].

Alt i alt tumoren-stroma interaktion er en kompleks proces. Under denne proces kan tumorceller udskiller faktorer at ændre differentiering af normale fibroblaster, og de ændrede fibroblaster til gengæld secernerer faktorer, der påvirker udviklingen af ​​tumorinvasion og migration. Vi har præsenteret data, der indikerer den mekanisme for, hvordan IGFBP7 kan være involveret i denne interaktion, og denne interaktion, understreger inddragelsen af ​​tumor stromale fibroblaster, kunne danne fokus for en ny terapeutisk tilgang til forvaltningen af ​​kræft.

Støtte Information

figur S1.

HT29-S og LoVo-S inducere høj ekspression af IGFBP7 i fibroblaster. Semi-kvantitativ analyse af mRNA-ekspression IGFBP7 niveau bestemt ved RT-PCR i fibroblaster udsat for HT29-S (A) og LoVo-S (B) i 0, 2, 4 og 6 dage. MRNA-niveauet blev normaliseret med den for GAPDH i den samme celle ekstrakter. *

P

0,05 mellem HT29-S /LoVo-S-behandlede fibroblaster og kontrolgruppen (0 dage)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0085340.s001

(TIF)

Figur S2.

β-Catenin er aktiveret under opregulering af IGFBP7 i fibroblaster. A. fibroblaster blev behandlet med SW620-S eller TGF-β i 6 dage, og ekspressionen af ​​Wnt signalering protein β-catenin blev detekteret i fibroblaster ved Western blot. Proteinekspression blev normaliseret med den for β-actin i samme celleekstrakt. *

P

0,05 mellem TGF-p1-behandlede fibroblaster og kontrolgruppe. B. fibroblaster blev behandlet med SW620-S eller TGF-β i 6 dage og β-catenin (rød) og DAPI (blå) blev påvist i fibroblaster ved immunfluorescens mikroskopi (oprindelig forstørrelse x 1000)

doi:. 10,1371 /tidsskrift .pone.0085340.s002

(TIF)

tabel S1.

Q-PCR Primere

doi:. 10,1371 /journal.pone.0085340.s003

(DOC)

Tak

Vi vil gerne takke for Dr. Brian Eyden (Manchester) for engelsk redigering, skabe debat og revision af manuskriptet. Vi takker professor Mao-De Lai og laboratorie medlemmer om hjælp og rådgivning under hele dette arbejde.