PLoS ONE: Protein underskrift lungekræft Tissues

Abstrakt

Lungekræft er stadig den mest almindelige årsag til kræft-relaterede dødsfald. Vi anvendte en meget multiplex proteomisk teknologi (SOMAscan) at sammenligne protein udtryk underskrifter af ikke småcellet lungekræft (NSCLC) væv med sunde tilstødende og fjerne væv fra kirurgiske resektioner. I denne første rapport fra SOMAscan anvendes på væv, fremhæver vi 36 proteiner, der udviser de største udtryk forskelle mellem matchede tumor og ikke-tumorvæv. Koncentrationerne af tyve proteiner øges og seksten faldt i tumorvæv, tretten af ​​dem er hidtil ukendte for NSCLC. NSCLC væv biomarkører identificeret her overlapper et centralt sæt identificeret i en stor serum-baserede NSCLC studiet med SOMAscan. Vi viser, at der kan anvendes i stor skala sammenlignende analyse af proteinekspression at udvikle nye histokemiske prober. Som forventet relative forskelle i proteinekspression er større i væv end i serum. De kombinerede resultater fra væv og serum præsentere den mest omfattende udsigt til dato af de komplekse ændringer i NSCLC proteinekspression og give vigtige konsekvenser for diagnostik og behandling

Henvisning:. Mehan MR, Ayers D, Thirstrup D, Xiong W , Ostroff RM, Brody EN, et al. (2012) Protein underskrift lungekræft væv. PLoS ONE 7 (4): e35157. doi: 10,1371 /journal.pone.0035157

Redaktør: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, Italien

Modtaget: November 28, 2011; Accepteret: 9 marts 2012; Udgivet: 11 april, 2012 |

Copyright: © 2012 Mehan et al. . Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering: SomaLogic finansieret den proteomisk biomarkør forskning. SomaLogic havde en rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, og forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har læst tidsskriftets politik og har følgende konflikter: M Mehan, D Ayers , D Zichi, R Ostroff, E Brody, J Walker, L Gold, T Jarvis, N Janjic, og S Wilcox er fuldtidsansatte i SomaLogic. D Thirstrup og G Baird har modtaget forskningsmidler fra SomaLogic. Disse interesser ændrer ikke forfatternes overholdelse af PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Progression fra sund tilstand til sygdom er ledsaget af ændringer i protein-ekspression i de ramte væv. Sammenlignende forhør af den menneskelige proteom hos raske og syge væv kan tilbyde indsigt i biologi sygdom og føre til opdagelsen af ​​nye biomarkører for diagnostik, nye mål for terapeutisk intervention, og identifikation af patienter med størst sandsynlighed vil få gavn af målrettet behandling. Især er der et akut behov for nye diagnoser for tidlig påvisning af lungekræft. Med henblik på behandling og prognose, er lungecancer klassificeres patologisk som enten småcellet (15%) eller ikke-småcellet (85%). Lungekræft er den hyppigste årsag til kræftdødsfald, hovedsagelig fordi 84% af tilfældene er diagnosticeret på et fremskredent stadium, med en fem-års overlevelse på mindre end 15% [1] – [3]. Worldwide i 2008 blev 1,5 millioner mennesker diagnosticeret og 1,3 millioner døde – en overlevelsesprocent uændret siden 1960 [4]. Patienter diagnosticeret med NSCLC på et tidligt tidspunkt og behandles kirurgisk at fjerne deres tumorer oplever en 86% fem års overlevelse [1], [2].

Vi udviklede nylig en ny affinitet-baserede proteomisk teknologi til biomarkør opdagelse, der i øjeblikket måler over 1.000 proteiner fra små prøvevolumener af plasma eller serum (f.eks ~ 10 pi plasma) med lave detektionsgrænser (median værdi på 300 fM), 7 logfiler over samlede dynamikområde (-30 fM – 1 pM ved anvendelse prøvefortynding), og 5% median variationskoefficient [5]. Denne teknologi, der kaldes SOMAscan, muliggøres ved SOMAmers (Slow Off-rate Modified Aptamerer), en ny klasse af protein bindende reagenser, der indeholder kemisk modificerede nukleotider, som i høj grad udvide de fysisk-kemiske diversitet nukleinsyrebiblioteker. Sådanne modifikationer indføres funktionelle grupper, der ofte findes i protein-protein-interaktion, antistof-antigen interaktioner og interaktioner mellem små molekyler lægemidler med deres protein-targets, men er fraværende i naturlige nukleinsyrer. Disse ændringer er kompatible med SELEX (Systematisk Evolution af ligander ved eksponentiel Berigelse) proces, der anvendes til at skabe SOMAmers såvel som standard DNA-metoder, herunder PCR og hybridisering. Samlet, anvendelsen af ​​disse ændringer udvider udvalget af mulige mål for SELEX, resulterer i bedre bindingsegenskaber, og letter udvælgelse af SOMAmers med langsomme dissociationshastigheder [5].

SOMAscan er en meget multiplekset platform til kvantitativ måling proteiner i komplekse matricer, såsom plasma eller serum, hvor en signatur af proteinkoncentrationer omdannes til en tilsvarende DNA signatur, som derefter kvantificeret på en kommerciel mikromatrice platform [5]. Kort fortalt ligevægt binding mellem en blanding af SOMAmers og proteiner opnået i opløsning, efterfulgt af fjernelse af ubundet arter ved successive perle-baserede immobiliseringstrin ledsaget med omfattende vaskning. Høj specificitet, allerede en iboende træk ved SOMAmers er desuden forbedret med inddragelse af dextransulfat under bindende og vasketrin. Dextransulfat, der ligesom nukleinsyrer er en polyanion, er effektiv, fordi sammenhørende SOMAmer-protein-komplekser er mere kinetisk stabile end ikke-specifikke komplekser. Ved afslutningen af ​​assayet, specifikke SOMAmer-proteinkomplekser forbliver hvorfra SOMAmers kan elueres under denatureringsbetingelser, hybridiseret på kommercielt tilgængelige mikroarrays, og gælder kvantificeret gennem en fluorofor kovalent koblet til SOMAmer. I det væsentlige, analysen drager fordel af dobbelte karakter SOMAmers som både foldede bindingsenheder med definerede former og unikke nukleinsyresekvenser genkendelige med specifikke hybridiseringsprober. Anvendeligheden af ​​dette assay er tidligere blevet vist i samtidige målinger af et stort antal proteiner spænder fra lav picomolære til høj mikromolære koncentration i plasma og serum og kliniske biomarkør undersøgelser af kronisk nyresygdom og lungekræft [5], [6].

Resultater

proteomiske analyse af NSCLC kirurgiske resektioner

i denne rapport, vi udførte storstilet proteinekspression analyse af homogeniserede lunge vævsprøver fra kirurgiske resektioner opnået fra otte ikke-småcellet lungecancer (NSCLC) patienter. Alle NSCLC patienter var rygere i alderen fra 47 til 75 år og diagnosticeret med patologi-bekræftet NSCLC stadier IA gennem IIIB (tabel 1). Vi opnåede tre prøver fra hver resektion: tumorvævsprøve, tilstødende ikke-tumorvæv (1 cm tumor) og fjern uengagerede lungevæv (længst kant af resektion fra tumoren). Der blev draget omsorg for at bevare integriteten af ​​vævet, med alle prøver blive frosset inden for 5-10 minutter efter excision. Total proteinkoncentration blev justeret og normaliseret i hvert homogenat for proteomisk profilering efterfulgt af analyse på vores biomarkør opdagelse array til bestemmelse af koncentrationen af ​​820 humane proteiner som for nylig beskrevet [5].

Disse protein koncentrationsmålinger, udtrykt som relative fluorescensenheder (RFU), tillade store sammenligninger af protein underskrifter blandt prøver (fig. 1). Vi sammenlignede første proteinekspressionen niveauer mellem de hosliggende og fjerne vævsprøver for hver patient (fig. 1A). Samlet set frembringes af de fleste analytter var ens i tilstødende og fjernt væv. I denne sammenligning kun én analyt (fibrinogen) udviste mere end en to-fold forskel mellem de to kontrolprøver. Fibrinogen-koncentrationen var højere i tilstødende ikke-tumorvæv end fjernt ikke-tumorvæv. Fibrinogen er den opløselige prækursor af fibrin, som omdannes af thrombin under koagulering. Fibrinafsætninger forekommer inden tilstødende stroma af de fleste tumorer, primært i den ekstracellulære matrix (ECM), hvor fibrin og andre ECM-proteiner fremme og støtte tumor vækst processer herunder, celleproliferation, adhæsion, invasion, migration og angiogenese [7].

Signal forskelle mellem tilstødende og fjernt væv (panel A), tumor og tilstødende væv (panel B) og tumor og fjernt væv (felt C) er udtrykt som log

2 median forhold. Den punkterede linie repræsenterer to-gange ændring (log

2 = 1).

I modsætning hertil sammenligning af tumorvæv med ikke-tumorvæv (tilstødende eller fjernt) identificerede 11 (1,3%) proteiner med mere end fire-fold forskelle og 53 (6,1%) proteiner med mere end to-fold forskelle (fig. 1B og 1C). De resterende (93,9%) proteiner viste relativt små forskelle mellem tumor og ikke-tumorvæv. Nogle proteiner blev væsentligt undertrykt, mens andre blev forhøjet i tumorvæv i forhold til tilstødende eller fjerntliggende væv. Differentiel ekspression af proteiner mellem tilstødende og tumorvæv, eller mellem distale og tumorvæv, var den samme overordnede. Ændringer i mellem tumor og distale væv var generelt noget større sammenlignet med tumor og tilstødende væv (fig. 1), hvilket viser, at de fleste observerede protein ændringer er specifikke for den lokale tumor miljø. Figur 2 viser en varme kort skildring af resultaterne. Der var en tendens til protein ændringer, der afspejler patologisk stadium, hvilket kan indikere, at proteinekspression korrelerer med sygdomsbyrde. I betragtning af den lille prøvestørrelse, kunne korrelationer med histologisk klassifikation ikke afkobles fra scenen.

Prøverne vises i kolonner og adskilt i fjern ikke-tumor, der støder ikke-tumor og tumorvæv. Inden for hver vævstype prøverne adskilt i adenocarcinomer (AC) eller pladecellecarcinomer (SCC). Tallene over hver kolonne svarer til patientens koder. Proteinerne vises i rækker og blev beordret hjælp hierarkisk klyngedannelse.

Biomarker identifikation

For at identificere potentielle NSCLC væv biomarkører, vi kiggede for analytter med den største ændring i protein ekspressionsniveauerne mellem tumor, tilstødende, og fjerne vævsprøver. Her fremhæver vi seksogtredive proteiner med det største middelværdi fold-ændring i proteinekspression mellem tumor og ikke-tumor vævsprøver (fig. 3, tabel 2). Vi testede betydningen af ​​disse ændringer med Mann Whitney testen og krævede en p-værdi på 0,05 efter korrektion for multiple test (falsk opdagelse sats cutoff af q 0,05). Selvom antallet af prøver, vi brugte til denne undersøgelse var relativt lille, studiet bestod af parrede tumor og ikke-tumor vævsprøver fra hver enkelt. Dette giver mere magt til at identificere ændringer i en individuel og eliminerer populationsvariansen forbundet med tværsnitsundersøgelse design. Tilgængeligheden af ​​passende udvalgte referenceprøver anerkendes i stigende grad som en afgørende vigtig komponent i biomarkør opdagelse forskning [8] – [10]. Endelig har vi vurderet reproducerbarhed af denne nye metode ved at analysere tredobbelte prøver af tumor og ikke-tumor-væv resektioner for to i dette studie og fundet en 4,5% median CV mellem tredobbelte målinger for de 820 proteiner målt (fig. 4) og Spearman korrelation koefficienter 0,99 (delvist oppustet af det store RFU interval målt). Tredobbelte målinger for de 36 proteiner med største middelværdi-fold forskelle mellem tumor og ikke-tumorvæv er afbildet i fig. 5.

Proteiner med forøget (panel A) eller nedsat (panel B) niveauer i tumorvæv sammenlignet med tilstødende eller distal væv (panel A) fra otte NSCLC prøver anvendt i denne undersøgelse. Hver enkelt er angivet med et andet symbol. De vandrette linjer af hver kasse svarer til den første, anden og tredje kvartil (25% /50% /75%) og knurhår svarer til de maksimale og minimale værdier.

tumor, der støder op non-tumor, og fjerne ikke-tumor væv resektioner blev udtaget, ekstraheret og analyseret med SOMAscan proteom assay in triplo for to personer i undersøgelsen. Median CV for alle 6 tredobbelte var 4,5% (sort linje).

tumor, der støder ikke-tumor, og fjerne ikke-tumor væv resektioner blev udtaget, udvundet, og analyseres med det SOMAscan proteomics assay in triplo for to personer (patienter 56 og 61) i studiet. Prøverne farvet af individuelle og tumor prøver fremhævet som trekanter. Y-aksen er på en logaritmisk skala.

High-indhold proteomisk analyse af biologiske prøver aktiveret af vores multiplex assay tillader uvildig opdagelse af sygdomsrelaterede proteiner. Til dato har vi gennemført flere blod-baserede kliniske biomarkør undersøgelser af humane sygdomme, herunder lungekræft [6] og kronisk nyresygdom [5]. Disse undersøgelser har identificeret nye potentiel sygdom biomarkører samt biomarkører, der tidligere er blevet rapporteret. Den aktuelle undersøgelse følger denne tendens. Omkring en tredjedel (13/36) af de potentielle NSCLC væv biomarkører identificeret her roman, til vores bedste viden. De resterende to tredjedele (23/36) er tidligere blevet rapporteret som differentielt udtrykte proteiner eller gener i NSCLC tumor væv (tabel 2). Nyhed blev bestemt ved at udføre litteratursøgning i Pubmed og på internettet ved hjælp af de potentielle biomarkører ‘gen navne og protein aliaser som identificeret af UniProt.

De potentielle biomarkører kan klassificeres bredt i fire biologiske processer, der er forbundet med vigtige kendetegn for tumorbiologi [11] som vist i tabel 3: 1) angiogenese, 2) vækst og metabolisme, 3) inflammation og apoptose, og 4) invasion og metastase. Ganske vist er disse praktiske, men ukorrekte klassifikationer der tilnærmer et meget komplekst og dynamisk system, hvor disse molekyler ofte spille flere og nuancerede roller. Derfor er den specifikke tilstand af et givet system i sidste ende påvirker ekspressionen og funktionen af ​​en bestemt molekyle. Vores forståelse af de biologiske fundament for disse systemer er langt fra afsluttet. Med SOMAscan platform, er vi begyndt at udforske den kvantitative ekspression af et stort antal proteiner i forskellige væv og sygdomsprocesser. Disse data giver nye koordinater for at hjælpe kortlægge dynamikken i disse systemer, som igen vil give en mere fuldstændig forståelse af biologien af ​​denne sygdom. Resultaterne fra den aktuelle undersøgelse giver et nyt perspektiv på NSCLC tumor biologi, med både kendte og nye elementer.

Angiogenese

Angiogenese driver væksten af ​​nye blodkar til at understøtte tumorvækst og metabolisme. Reguleringen af ​​angiogenese er en kompleks biologisk fænomen kontrolleret af både positive og negative signaler [11]. Blandt de potentielle NSCLC væv biomarkører identificeret i denne undersøgelse (. Figur 3) var velkendte positive og negative angiogenese regulatorer, som alle er tidligere blevet observeret i NSCLC tumorvæv [12] – [16]. Disse omfatter det prototypiske angiogenese inducer VEGF og inhibitorer endostatin og thrombospondin-1 (TSP-1). VEGF er en kraftig vækstfaktor, som fremmer ny blodkarvækst; VEGF blev kraftigt opreguleret i NSCLC tumorvæv, i overensstemmelse med tidligere observationer [12], herunder vores undersøgelse af serumprøver fra NSCLC-patienter [6]. Det er værd at bemærke, at VEGF oprindeligt blev opdaget som tumorcelle-udskilt vaskulær permeabilitet faktor (VPF), der øgede utætheder af tumor-associerede blodkar for store molekyler, såsom fibrinogen, som normalt er begrænset til plasma [17]. Denne aktivitet kan have dybtgående virkninger på sammensætningen af ​​proteiner forbundet med tumorvæv. Endostatin er et proteolytisk fragment af collagen XVIII og en stærk inhibitor af endotelcelleproliferation og angiogenese [13]. TSP-1 og den tilknyttede TSP-2 var væsentligt opreguleret i NSCLC tumorvæv. TSP-1 og TSP-2 er ekstracellulære matrixproteiner med komplekse, kontekstafhængige virkninger moduleret gennem en række interaktioner med celleoverfladereceptorer, vækstfaktorer, cytokiner, matrixmetalloproteinaser og andre molekyler. Archetypically i modelsystemer, TSP-1 og TSP-2 inhiberer angiogenese ved inhibering endotelcelleproliferation gennem CD47-receptoren (ikke målt i denne undersøgelse) og inducere endotelcelle apoptose gennem CD36 receptoren. Der er også tegn for proangiogene påvirkninger for TSP-1 og TSP-2 [18]. Endelig rapporterede TSP-1 og TSP-2 relative og absolutte ekspressionsniveauer i NSCLC væv varierer [16], [19] – [21] sandsynligvis på grund af deres komplekse funktioner. I vores undersøgelse har vi også fundet, at CD36 var nedreguleret i NSCLC tumorvæv, hvilket kunne indikere en tilpasning af tumorceller reducere følsomheden over for TSP-1 og TSP-2-medieret apoptose.

vækst og metabolisme

Ti af de potentielle NSCLC biomarkører vi identificeret er forbundet med vækst og metabolisme funktioner. Halvdelen af ​​disse biomarkører er involveret i den komplekse hormonale regulering af cellulær vækst og energimetabolisme. Tre insulin-lignende vækstfaktor bindende proteiner (IGFBP’er), som modulerer aktiviteten af ​​insulin-lignende vækstfaktorer (IGF’er), var opreguleret i NSCLC-tumorer (IGFBP-2, -5 og -7). Adskillige rapporter har vurderet kvalitativt IGFBP-2, -5 og -7 i NSCLC (tabel 2) og foreslå højere ekspression i NSCLC væv end i normalt væv. Insulin og IGF virker som hormoner, der stærkt påvirker cellevækst, stofskifte, og overlevelse. Kræftceller er ofte afhængige af disse molekyler til vækst og proliferation [11]. IGFBP-2 er også blevet forbundet med et anti-apoptotisk virkning via caspase-3 [22]. Disse hormoner er på sin side nedbrydes af insulysin [23], hvis koncentration var højere i NSCLC tumorvæv. Hormonet adiponectin styrer lipid metabolisme og insulinfølsomhed, og vi fandt adiponectin nedreguleret i NSCLC tumorer. De resterende fem biomarkører, kulsyreanhydrase III, NAGK, TrATPase, tryptase β-2, og MAPK13, er alle enzymer med kendte roller i cellulær metabolisme (tabel 3).

Inflammation og Apoptose

inflammation og apoptose er kendetegnende for kræft biologi, og vi finder en række potentielle biomarkører forbundet med disse processer, som tidligere har været forbundet med NSCLC (tabel 2). Vi fandt caspase-3 højere koncentrationer i NSCLC tumorvæv. Caspase-3 er blevet forbundet med metastase [24]. Et andet bemærkelsesværdigt eksempel er opløselig receptor for fremskreden glycosylering slutprodukter sRAGE, som er blevet rapporteret at være dramatisk nedreguleret i NSCLC væv [21], [25]. Denne konstatering er i overensstemmelse med vores måling, hvor sRAGE havde den største observerede ændring for proteiner, der er lavere i tumor end i ikke-malignt væv. En hypotese er, at RAGE spiller en rolle i epitel organisation, og reducerede niveauer af RAGE i lungetumorer kan bidrage til tab af epitelvæv struktur, der kan føre til malign transformation [25]. Adskillige kemokiner, såsom BCA-1, CXCL16, IL-8 og NAP-2, ændres i vores undersøgelse, i overensstemmelse med den hypotese, at invasion af tumorer med celler fra de medfødte og adaptive arme af immunsystemet giver bioaktive molekyler, påvirker proliferative og angiogene signaler [11].

invasion og metastase

Den største gruppe af potentielle biomarkører indeholder proteiner, der fungerer i celle-celle og celle-matrix interaktioner og er involveret i invasion og metastase . Mange er tidligere blevet rapporteret at være associeret med NSCLC. Mest bemærkelsesværdigt er to af matrix-metalloproteaser, MMP-7 og MMP-12, som bidrager til proteolytisk nedbrydning af ekstracellulær matrix komponenter og behandling af substrater, såsom vækstfaktorer. For eksempel er den vigtigste substrat for MMP-12 er elastin. Sådanne fremgangsmåder er velkendte for at spille en rolle i skabelsen af ​​tumor mikromiljøer. Vi observerede MMP-7 og MMP-12 opreguleret i NSCLC væv, hvilket er i overensstemmelse med lignende undersøgelse, der anvendte antistof-baserede målinger [26]. Over-ekspression af MMP-7 og MMP-12 er blevet forbundet med dårlig prognose i NSCLC [26]. MMP-12 niveauer er blevet korreleret med lokalt recidiv og metastatisk sygdom [26]. Det er interessant at bemærke, at to af de otte fag havde normale niveauer af MMP-12, mens de andre seks havde 15-50 gange forhøjelse af MMP-12 i tumorvæv sammenlignet med ikke-tumorvæv.

SOMAmers som histokemi sonder til NSCLC biomarkører

Forståelse af forskelle i proteinekspression mellem tumor og ikke-tumorvæv kan identificere nye histokemi mål. Denne fremgangsmåde er tidligere anvendt med MMP-12 og andre [27]. Sådanne prober kan aktivere mere præcise molekylære karakterisering af tumorer og deres indvirkning på det omgivende stroma. Vi har tidligere vist, at fluoroforen-mærkede SOMAmers giver hurtig og selektiv histokemisk farvning i frosne vævssnit [28]. Her undersøgte vi væv farvning af flere af de SOMAmers, der blev identificeret som biomarkører i vores analyse af vævshomogenisater. Frosne vævssnit blev skåret fra den samme tumor resektion anvendes til biomarkør opdagelse. For eksempel TSP-2-farvning med en fluorofor-mærket SOMAmer i tumorvæv var slående og lokaliseret overvejende i områder med fibrøse stromal ardannelse (fig. 6A), men en sådan farvning var stort set fraværende i normalt væv (fig. 6B). Dette er i overensstemmelse med den rapporterede rolle TSP-2 i matrix modulation [18], [29]. I modsætning hertil i normalt lungevæv, makrofagen mannose receptor (MRC1) SOMAmer farvning lokaliseret til overfladen af ​​alveolære makrofager (fig. 6D) som forventet for dette mål [30]. Tumor vævsprøver, som mangler alveolerne, viste lidt MRC1 farvning (fig. 6C). Figur 6E viser MRC1 SOMAmer farvning udføres samtidig med antistof-baserede immunfluorescens for andre mål (cytokeratiner og CD31), hvilket indikerer muligheden for multipleksing SOMAmer og antistofreagenser i histologiske undersøgelser. Tissue farvning med SOMAmers var således i overensstemmelse med homogenatet profiler, hvor TSP-2 blev forhøjet og MRC1 blev nedsat i tumor versus raske væv. Vi bekræftede SOMAmer farvede mønstre af TSP-2 og MRC1 med antistoffer Figur 7. overensstemmelse mellem histokemiske farvningsresultater med retningen af ​​ændringen i proteinekspression mellem tumor og sunde vævshomogenisater giver yderligere beviser for, at de identificerede biomarkører er forbundet med sygdom. Storstilet proteomisk sammenligning mellem væv beskrevet her er også en kraftig fremgangsmåde til identifikation af nye histokemiske prober.

(A) Thrombospondin-2 SOMAmer (rød) farvning fibrocollagenous matrix omgiver en tumor reden. (B) tilsvarende normale lunge prøve farvet med thrombospondin-2 SOMAmer (rød). (C) makrofag mannose receptor SOMAmer (rød) farvning spredt makrofager i en lunge adenocarcinom. (D) makrofag mannosereceptoren SOMAmer (rød) farvning talrige alveolære makrofager i et afsnit af normal lungeparenkym. (E) Multicolor billede fremhæver cytomorphologic fordeling af makrofag mannose receptor SOMAmer farvning: Grøn = Cytokeratin (AE1 /AE3 antistof), Rød = CD31 (EP3095 Antibody), og Orange = SOMAmer. Alle kerner i denne figur er modfarvet med DAPI.

TSP-2 er identificeret i serielle frosne snit af en enkelt lunge karcinom eksemplar af (A) en hjemmelavet kanin polyklonale TSP-2 polyklonale antistof, (B) den præimmunserum fra kaniner anvendt til at fremstille hjemmelavede polyklonale antistof, (C) en kommerciel (Novus) kanin polyklonalt TSP-2-antistof, og (D) TSP-2 SOMAmer. TSP-2 SOMAmer blev anvendt til at farve frosne snit af normal og malign lungevæv, med standard Avidin-Biotin-Peroxidase farveudvikling, at demonstrere forskellige morfologiske fordelinger: (E) stærk farvning af den fibrotiske stroma omkring tumor reder, med minimal cytosoliske farvning af carcinomaceller, (F) kraftig farvning af den fibrotiske stroma omkring tumor reder i en mucinous adenocarcinoma, med ingen signifikant farvning af carcinomaceller, (G) normalt lungevæv, der viser stærk cytosolisk farvning af bronkial epitel og spredte alveolære makrofager, og (H) stærk cytosolisk farvning af et adenocarcinom, med ingen signifikant farvning af ikke-fibrotisk, overvejende inflammatorisk stroma.

Nogle generelle forbehold i relation til opdagelsen af ​​potentielle NSCLC biomarkører er værd at bemærke. Første behøver den omstændighed, at et protein er forbundet med tumorvæv ikke, at det er specifikt for tumorvæv. For eksempel inflammation, ekstracellulær matrix remodellering, hypoxi, og vævsnekrose ledsager tumorudvikling, men også mange andre ikke-maligne tilstande, såsom skade, sårheling eller infektion. For det andet kunne biomarkører vi identificeret afspejle en forskel i forholdet mellem celletyper, der udgør en tumorprøve sammenlignet med det normale lungevæv. For eksempel, hvis tumorvæv består af cancercelle overvækst, nogle af biomarkører forventes at være specifikt for denne celletype (i dette tilfælde, epitelceller), transformeret eller ej. Tilsvarende, hvis en tumor vævsprøve er enten mere eller mindre vaskulariseret end det omgivende normale væv, kan der observeres en ændring i ekspressionen af ​​endotelcellespecifikke proteiner. Faktisk observerede vi signifikant lavere koncentrationer af ESAM, et protein specifikt til endotelceller, sammenlignet med matchede, ikke-tumorvæv. Vi bekræftede denne histokemisk, som vist i figur 8, hvor vi målte 35 gange mere ESAM-positive endotelceller i fjern ikke-tumorvæv sammenlignet med tumorvæv. Endelig SOMAmers, ligesom alle affinitet reagenser, binder og genkender specifikke epitoper af målproteiner generelt i en konformation-afhængig måde, og nogen bestemt måling afspejler tilgængeligheden af ​​denne epitop.

ESAM farvning er vist i lunge tumor ( A, C) og normal lunge (B, D) fjernt fra tumoren. Endotelceller er synligt mere rigelige i den normale lunge sektion, i overensstemmelse med den høje vaskularisering af den normale lunge. Rå billeder er vist i A og C, med ESAM-positive celler identificeret af CellProfiler algoritme markeret med et “1” i billeder B og D.

Sammenligning af NSCLC væv og serum biomarkører

vi har for nylig afsluttet en NSCLC undersøgelse [6], hvori vi analyserede 1.326 serumprøver fra fire uafhængige centre kliniske undersøgelser under anvendelse af samme proteom platform og et protein menu næsten identisk med den, der anvendes til væv (813/820 proteiner). Undersøgelsen omfattede patienter diagnosticeret med patologisk eller klinisk fase I-III NSCLC og en kontrol population med en historie af langvarig brug af tobak, herunder aktive rygere og eksrygere med mindst 10 pack-års cigaretrygning. Tager omfattende forholdsregler for at redegøre for præ-analytiske variabler, vi identificeret 44 kandidat biomarkører, og udviklet en 12-protein panel, der adskiller NSCLC fra kontrol med 91% sensitivitet og 84% specificitet i et træningssæt, og 89% sensitivitet og 83% specificitet i et blindet, uafhængig verifikation sæt. Tilgængeligheden af ​​denne database giver os mulighed for at sammenligne ændringer i proteinekspression i væv og serum fra patienter med NSCLC.

Mens den anvendte metode til at analysere protein profiler i prøver fra disse to NSCLC undersøgelser er den samme, nogle væsentlige forskelle er værd at bemærke. Først blev observeret serum præ-analytisk variation mellem studiecentre, måske maskering nogle kræft biomarkører [6]. For det andet, i NSCLC væv undersøgelse rapporteret her, hver tumor prøve har sin egen kontrol væv (tilstødende og fjern ikke-tumor), mens større NSCLC serum undersøgelse nødvendigvis er sammensat af case og kontrolprøver fra forskellige individer. Alligevel differentiel ekspression af proteiner i sera fra NSCLC-patienter i forhold til kræft-fri kontrol sammenlignet med NSCLC vævsprøver giver nyttig viden (fig. 9, tabel 4). Det mest slående observation er, at relative ændringer i proteinekspression er større i væv end i serum. Dette resultat kunne forventes, da tumorvæv er kilden til ændringerne i proteinekspression, som er så, selvom helt frigivet i omløb, fortyndet mange gange i samlede volumen af ​​blod. Denne tendens er tydelig i den aflange fordeling af datapunkter langs x-aksen i figur 9, hvor akser er tegnet i samme skala til at illustrere dette punkt. Elleve af de analytter, der er vist i figur 3 som ændret i tumorvæv blev også udtrykkes forskelligt i sera fra patienter med NSCLC forhold til kontroller (udfyldt røde cirkler i fig. 9). Det er værd at bemærke, at vores publiceret NSCLC serum undersøgelse [6] ikke måle MMP-12, som denne undersøgelse identificeret som en top væv biomarkør. I efterfølgende NSCLC serum undersøgelser blev MMP-12 måles og vi fandt det var også en top serum biomarkør med en KS-afstand på 0,42 (tabel 2). Dette tyder på, at forhøjet serum MMP-12 direkte afspejler NSCLC tumor biologi. De fleste andre biomarkører fælles for væv og serum også ændre sig i samme retning, men nogle få ikke. Lokale koncentrationer af proteiner i en vævshomogenat klart behøver ikke korrelerer med cirkulerende niveauer af proteiner, og inverse sammenhænge kan give et fingerpeg om en omfordeling af visse biomarkører i syge versus normale væv.

De to øverste paneler viser log2 forholdet (LR) afledt af serumprøver mod log nøgletal stammer fra tilstødende væv og fjernt væv hhv. De nederste fire paneler funktionen zoomet dele af plots ovenfor, fremgår af farven af ​​plottet (grøn for faldet, og rød for øget ekspression sammenlignet med ikke-tumorvæv). Analytter vist i figur 2 er blevet mærket og analytter omtalt i publikationen på serumprøver er vist i fyldte røde symboler rødt.

Diskussion

Opdagelsen af ​​nye biomarkører med påviselig diagnostisk eller klinisk anvendelighed har været en betydelig udfordring i de senere år [8]. Årsagerne til dette er: allestedsnærværelse af præ-analytiske og analytiske artefakter, manglen på passende sund-state kontrol, spørgsmål vedrørende studere design, og det er vanskeligt at detektere små ændringer i protein niveauer i meget lave koncentrationer. Denne udfordring er særligt udtalt med kræft biomarkører hvor formålet er ofte at finde biomarkører for en lille malignitet i blodet på en relativt stor menneskelig krop på et tidligt tidspunkt.

Den nyligt afsluttede National Lung Screening Trial (NLST) rapporterede en betydelig dødelighed fordel ved screening for NSCLC med lav dosis CT og afsløre tidlige stadie sygdommen i en høj risiko befolkning [31].