Abstrakte
Vi evaluerede den mekanisme af capsaicin-medieret ROS generation i bugspytkirtelkræftceller. Frembringelsen af ROS var omkring 4-6 gange mere sammenlignet med kontroldyr og så tidligt som 1 time efter capsaicin behandling i BxPC-3 og AsPC-1-celler, men ikke i normale HDPE-6-celler. Den generation af ROS blev hæmmet af katalase og EUK-134. At afgrænse den mekanisme af ROS-generering blev enzymatiske aktiviteter af mitokondriel kompleks-I og kompleks-III bestemmes i de rene mitokondrier. Vores resultater viser, at capsaicin inhiberer ca. 2,5-9% og 5-20% af kompleks-I-aktivitet og 8-75% af kompleks-III-aktivitet i BxPC-3 og aspC-1 celler henholdsvis som var attenuable af SOD, katalase og EUK-134. På den anden side, capsaicin behandling inhiberede ikke komplekse-I eller kompleks-III-aktiviteter i normale HDPE-6-celler. ATP niveauer blev drastisk undertrykt ved capsaicin behandlingen i begge BxPC-3 og AsPC-1-celler og svækket af katalase eller EUK-134. Oxidation af mitokondrier-specifik cardiolipin var væsentligt højere i capsaicin-behandlede celler. BxPC-3 afledt ρ
0-celler, som mangler mitokondrie-DNA, var fuldstændigt resistente over for capsaicin medieret ROS-generering og apoptose. Vores resultater viser, at frigivelsen af cytochrom c og spaltning af både caspase-9 og caspase-3 på grund af forstyrrelse af mitochondriemembranpotential signifikant blokeret af katalase og EUK-134 i BxPC-3 celler. Vores resultater viser yderligere, at capsaicin behandling ikke kun hæmmer den enzymatiske aktivitet og ekspression af SOD, katalase og glutathionperoxidase men også reducere glutathion niveau. Over-ekspression af katalase ved transient transfektion beskyttet cellerne fra capsaicin-medierede ROS-generering og apoptose. Endvidere tumorer fra mus oralt fodret med 2,5 mg /kg capsaicin viser nedsat SOD-aktivitet og en stigning i GSSG /GSH-indholdet sammenlignet med kontroller. Tilsammen vores resultater tyder inddragelse af mitokondrie kompleks-I og III i capsaicin-medieret ROS generation og fald i antioxidant niveauer resulterer i alvorlig skade på mitokondrier, der fører til apoptose i bugspytkirtelkræftceller
Henvisning:. Pramanik KC, Boreddy SR, Srivastava SK (2011) rolle mitokondrie Electron transportkæde komplekser i Capsaicin medieret oxidativ stress førende til apoptose i bugspytkirtelkræftceller. PLoS ONE 6 (5): e20151. doi: 10,1371 /journal.pone.0020151
Redaktør: Michael Polymenis, Texas A M University, USA
Modtaget: 14. marts 2011; Accepteret: 19. april, 2011; Udgivet: 25 maj, 2011
Copyright: © 2011 Pramanik et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Cancer Institute, National Institutes of Health R01 CA129038; R01 CA106953. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
kræft i bugspytkirtlen er en af de mest dødbringende af alle de faste maligniteter i USA [1]. har været rettet bestræbelser mod udviklingen af adjuvans og neoadjuvant terapier i et forsøg på at forbedre overlevelsesraten [1]. Pancreascancer reagerer generelt dårligt til konventionelle behandlingsmodaliteter, såsom kemoterapi og strålebehandling [2]. Desværre, toksicitet og iboende modstand af kemoterapeutisk middel, såsom 5-fluoruracil (5-FU) og gemcitabin i bugspytkirtelkræft er stadig årsager til dårlig prognose [3]. Der er ikke enighed om optimale terapeutiske midler i bugspytkirtelkræft, derfor udvikling af nye metoder til at forebygge og behandle kræft i bugspytkirtlen er en vigtig mission. Epidemiologiske undersøgelser fortsat støtte den forudsætning, at kost rig på frugt, grøntsager og nogle krydderier kan være beskyttende mod forskellige menneskelige maligniteter, herunder kræft i bugspytkirtlen, og at forbruget af chili peber kan beskytte mod gastrointestinale kræftformer [4], [5], [6 ], [7], [8], [9], [10].
Capsaicin, et homovanillinsyre derivat (N-vanillyl-8-methyl-nonenamid) er en aktiv og krydret bestanddel af hot chili peber (fig. 1A) [11], [12] og har været anvendt som tilsætningsstof for lang tid over hele verden, især i sydasiatiske og latinamerikanske lande [13], [14], [15], [16 ], [17]. Dette alkaloid er blevet anvendt til behandling af smerter og inflammation, der er forbundet med en række sygdomme [18], [19], [20], [21]. Adskillige nylige studier har vist, at capsaicin har antiproliferativ virkning i hepatisk [22] gastrisk [23] prostata [24] kolon [25] og leukæmiske celler [26]. Capsaicin generelt udøver sin fysiologiske respons ved at stimulere vanilloidreceptor 1 (TRPV-1) receptor, dog receptor uafhængige virkninger af capsaicin er blevet observeret i cancerceller [25], [26], [27]. Capsaicin undertrykker væksten af kræftceller ved NF-kB inaktivering, ROS generationer, celle-cyklus anholdelse og modulerende EGFR /HER-2 veje [28], [29], [30], [31], [32], [33 ]. Den nøjagtige molekylære mekanisme, som capsaicin forårsager oxidativt stress og apoptose er fortsat uklar. Vi har tidligere vist, at capsaicin-induceret apoptose i bugspytkirtelkræftceller var forbundet med ROS-generering og mitokondriel forstyrrelser [34]. Men den nøjagtige mekanisme, som capsaicin forårsager ROS generation og celledød var ikke klart.
(
A
) Struktur af capsaicin. Apoptose fremkaldende virkninger af capsaicin (150 pm, 24 timer) i (
B
) BxPC-3, (
C
) AsPC-1 og (
D
) HPDE- 6-celler, blev bestemt ved anvendelse annexin-V /FITC og propidiumiodid og analyseret ved flow cytometery. Resultater er udtrykt som middelværdi ± SD (n = 4) af fire uafhængige forsøg. * Statistisk anderledes sammenlignet med kontrol som analyseret ved t-test (
P 0,05
). (
E
) BxPC-3-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af capsaicin i 24 timer og (
F
) Cell blev behandlet med forskellige tidsintervaller med 150 pM capsaicin og analyseret ved immunoblotting til spaltning af caspase-9, caspase-3 og PARP som beskrevet i Materialer og Metoder. Hver Blottet blev strippet og probet igen med anti-β-actin-antistof for at sikre lige protein loading. Disse forsøg blev udført tre gange uafhængigt med lignende bemærkning i hvert eksperiment.
I den foreliggende undersøgelse viser vi, at capsaicin forårsager ROS (superoxidradikal og hydrogenperoxid) generering ved at inhibere mitokondrisk kompleks-I og kompleks-III-aktivitet og ATP niveauer i BxPC-3 og AsPC-1 humane bugspytkirtelkræft cellelinjer, uden at påvirke BxPC-3 afledt ρ
0 og normale HDPE-6 celler. Samtidig katalase og glutathionperoxidase aktivitet og ekspression blev undertrykt af capsaicin behandling. Supplere cellerne med PEG-katalase, PEG-SOD, EUK-134 (katalase mimick) eller transfektion af celler med katalase næsten helt blokeret capsaicin medieret ROS generation og apoptose. Desuden tumorer fra 2,5 mg /kg capsaicin behandlede mus udviste nedsat SOD-aktivitet og en stigning i GSSG /GSH niveau. Denne undersøgelse giver en direkte beviser for, hvordan capsaicin anvender mitokondrier at forårsage oxidativ stress, der fører til apoptose i bugspytkirtelkræftceller.
Resultater
Capsaicin udløser apoptose i bugspytkirtelkræftceller, men ikke i normal HDPE-6 celler
Apoptose blev bestemt ved flow cytometery hjælp annexin-V /FITC og propidiumiodid. Behandling af BxPC-3 og AsPC-1-celler med 150 pM capsaicin i 24 timer resulterede i omkring 2,5-5 folder øges i apoptose (fig. 1B-C). Interessant, capsaicin undladt at inducere apoptose i normale HPDE-6-celler (fig. 1D). Den apoptoseinducerende virkning af capsaicin blev yderligere bekræftet ved Western blotting. Som vist i fig. 1E, capsaicin behandling forårsagede signifikant aktivering af caspase-9, caspase-3 og PARP som tydeligt ved deres respektive kløfter i en koncentrationsafhængig måde. På den anden side, havde capsaicin behandling ikke forårsaget nogen spaltning af caspaser eller PARP i normale HPDE-6-celler (data ikke vist). I en tid, afhængig undersøgelse, kløvning af caspase 9/3 og PARP var tydeligt ved 16 og 24 timer af capsaicin behandling (fig. 1F).
Capsaicin forårsager generation af mitokondrie ROS i bugspytkirtelkræftceller
Intracellulær ROS-generering af capsaicin blev vurderet ved flowcytometri under anvendelse hydroethidine (HE) og DCFDA. Som vist i fig. 2A, på en tidsafhængig undersøgelse, capsaicin behandling forårsagede omkring 8-9 folder stigning i superoxidradikal inden 1-2 timer, som faldt med 24 timer som målt ved HE fluorescens ved hjælp af flow cytometery. Tilsvarende dannelsen af hydrogenperoxid ved capsaicin behandling steg med 4-7 folder inden 1-2 timer og faldt derefter men opretholdt niveauer over superoxid af 24 timer, som målt ved DCF fluorescens ved flow cytometery (fig. 2B). Den generation af ROS var så tidligt som 1 time i forhold til kontrol i BxPC-3 celler. For at se, om antioxidanter kan blokere ROS-generering blev celler forbehandlet med PEG-SOD (100 U /ml), PEG-katalase (500 U /ml) eller 50 pM EUK -134 (en celle gennemtrængelig katalase mimetikum) før capsaicin behandling. PEG-SOD næsten fuldstændig blokeret superoxidradikal generation henviser PEG-katalase blokerede fuldstændigt hydrogenperoxid generation målt ved HE og DCF fluorescens henholdsvis ved flow cyometery (fig S1A-B). For at bekræfte specificiteten af antioxidanter, vi brugte PEG-katalase til at blokere superoxid radikal generation. Som forventet, PEG-katalase fuldstændigt undladt at blokere superoxidradikal generation (fig S1c). Tilsvarende PEG-SOD undladt at blokere hydrogenperoxid generation (data ikke vist). I efterfølgende eksperimenter, vi målte total ROS (superoxid radikal + hydrogenperoxid) generation. Tilsvarende capsaicin behandling forøget total ROS-generering ved ca. 2,5-4,5 gange i AsPC-1-celler med maksimum ved 2 timers behandling (fig. 2C). Capsaicin behandling bevirkede ikke nogen signifikant ROS-generering i normale Æske med HDPE-6-celler, hvilket antyder, at normale celler er resistente over for virkningerne af capsaicin (fig. 2D). I en kombinationsbehandling, vores resultater viser, at PEG-SOD, PEG-katalase og EUK-134 væsentligt blokerede capsaicin medieret samlede ROS produktion i BxPC-3 celler (Fig. 2F).
(
A
) og (
B
) BxPC-3-celler blev behandlet med DMSO eller 150 uM capsaicin til forskellige tidspunkter og farvet med HE og DCFDA og analyseret for superoxidradikal og hydrogenperoxid henholdsvis flow cytometery. (
C
) AsPC-1, (
D
) HDPE-6, (
E
) BxPC-3 ρ
0 celler blev behandlet med 150 pM capsaicin i 2, 4 og 24 timer og analyseret for total ROS-generering (superoxid og hydrogenperoxid) ved flowcytometer efter farvning af cellerne med HE og DCFDA. Resultater er udtrykt som middelværdi ± SD (n = 3) fra fire uafhængige forsøg og data repræsenterer gange forøgelse af ROS generation i forhold til kontrol. * Statistisk anderledes sammenlignet med kontrol som analyseret af envejs ANOVA efterfulgt af Bonferroni post-hoc test
P 0,05
). (
F
) Effekt af antioxidanter på capsaicin medieret samlede ROS generation i BxPC-3 celler. Celler blev behandlet med PEG-SOD (100 U /ml), PEG-katalase (500 U /ml) eller EUK-134 (50 uM) i 1 time efterfulgt af 150 uM capsaicin i 2 timer. Resultater er udtrykt som middelværdi ± SD (n = 3) af fire uafhængige forsøg. * Statistisk forskellig i forhold til kontrol (
P 0,05
) og ** statistisk forskellig sammenlignet med capsaicin behandling (
P 0,05
), som analyseres ved envejs ANOVA efterfulgt af Bonferroni indlæg -hoc test.
BxPC-3 afledt ρ
0-celler var fuldstændigt resistente over for capsaicin medieret ROS generation
for at forankre bidrag mitokondrier i ROS generation af capsaicin, vi genereret ρ
0 varianter af BxPC-3-celler. ρ
0-celler blev dannet og opretholdt ved inkubering BxPC-3-celler med 60 ng /ml ethidiumbromid og 50 mg /ml uridin i 12 uger og karakteriseret ved PCR for at bekræfte udtømningen af mtDNA og normal oxidativ phosphosrylation som tidligere rapporteret [35]. Overlevelsen af ρ
0-celler er afhængig af ATP afledt af anaerob glycolyse. ρ
0-celler er i stand til at generere ROS fra ETC kompleks som de mangler normal oxidative fosforylering [35], [36]. Sammenlignet med vildtype BxPC-3-celler blev totalt ROS-generering slet ikke observeret i BxPC-3 ρ
0-celler efter behandling med capsaicin (fig. 2E). Tilsammen vores resultater antyder, at BxPC-3 ρ
0-celler var helt modstandsdygtigt over for virkningerne af capsaicin i forhold til vildtype BxPC-3-celler.
Capsaicin behandling inhiberer ETC Complex-I og Complex -III aktiviteter
Mitochondrial ETC komplekser er de store generatorer af ROS i celler og væv. Da vi observerede ROS generation af capsaicin, vi ønskede at se, om mitokondrier er involveret i denne proces. Vi bestemt derfor de enzymatiske aktiviteter og udtryk for mitokondrie kompleks-I, kompleks-II, kompleks-III og kompleks-IV i capsaicin behandlet BxPC-3, AsPC-1, HPDE-6 og BxPC-3 ρ
0-celler. Capsaicin behandling inhiberer kompleks-I-aktivitet med ca. 5-20% i BxPC-3 og 2,5-9% i AsPC-1-celler henholdsvis sammenlignet med respektive kontroller (fig. 3A-B). På den anden side, som forventet, capsaicin inhiberede ikke kompleks-I-aktivitet i BxPC-3 ρ
0 celler (som mangler mitokondrie-DNA) og normale HDPE-6-celler (fig. 3C). Dernæst ønskede vi at undersøge, om dette fald i kompleks-I-aktivitet kan svækkes ved antioxidanter. Vores resultater viser, at forbehandling af celler med katalase eller EUK-134 væsentligt blokeret fald i komplekse-I-aktivitet ved capsaicin (fig. 3D). Yderligere capsaicin behandling nedsatte signifikant proteinniveauer med kompleks-I-protein-kompleks efter 4 timers behandling på en tidsafhængig undersøgelse og katalase eller EUK-134 forhindrede denne ændring (fig. 3E-F). Tilsvarende blev kompleks-III-aktivitet ved capsaicin inhiberet af 8-75% i begge BxPC-3 og AsPC-1-celler (fig. 4A-B). Ikke desto mindre, capsaicin undladt at formindske kompleks-III-aktivitet i BxPC-3 ρ
0-celler (fig. 4C). En beskeden nedgang i kompleks III aktivitet blev imidlertid observeret i Æske med HDPE-6 celler ved capsaicin behandling (fig. 4C). Faldet i kompleks-III-aktivitet i BxPC-3-celler ved capsaicin blev svækket af katalase og EUK-134 (Fig. 4D). Efter aftale med aktivitetsdata, udtryk for komplekst-III proteinkompleks blev drastisk reduceret i BxPC-3 celler efter capsaicin behandling (fig. 4E). Virkningen af capsaicin på proteinniveauet af komplekse-III blev ophævet af katalase og EUK-134 (fig. 4F). Vores resultater viser, at mitokondriel kompleks-III er mere involveret i capsaicin medieret ROS-generering i sammenligning med komplekse-I. Capsaicin havde ingen effekt på komplekse-II og IV (data ikke vist). Tilsammen indikerer disse resultater, at hæmning af mitokondrie kompleks I og kompleks-III ved capsaicin årsag ROS generation.
enzymaktiviteter om mitokondriel kompleks jeg blev der i de rene mitokondrier isoleret fra kontrol og 150 uM capsaicin behandlet (
A
) BxPC-3 og (
B
) AsPC-1 celler for 2, 4 og 24 timer. (
C
) Sammenligning af kompleks-I-aktivitet i AsPC-1, BxPC-3, BxPC-3 ρ
0 og HDPE-6 celler behandlet med 150 pM i 24 timer. (
D
) Capsaicin medieret fald i kompleks-I-aktiviteten blev forhindret ved præ-behandling af BxPC-3-celler med katalase (2000 U /ml) og EUK-134 (50 uM) i 1 time efterfulgt af 150 iM capsaicin i 24 timer. Resultater udtrykkes i forhold til kontrol som middelværdi ± SD (n = 3) af tre uafhængige forsøg. * Statistisk forskellig i forhold til kontrol (
P 0,05
) og ** statistisk forskellig sammenlignet med capsaicin behandling (
P 0,05
), som analyseres ved envejs ANOVA efterfulgt af Bonferroni indlæg -hoc test. (
E
) Complex-I proteinekspression blev bestemt ved immunoblotting under anvendelse af ren mitokondrie protein isoleret fra kontrol og 150 uM capsaicin behandlet BxPC-3 celler for de angivne perioder eller (
F
) 1 h pre behandling med katalase (2000 U /ml) eller EUK-134 (50 uM) efterfulgt af 150 pM capsaicin i 24 timer. Immunoblotting for hvert protein blev udført tre gange uafhængigt og lignende resultater blev opnået. Blottene blev strippet og testet igen med anti-Cox-IV til mitokondrielle proteiner for at sikre lige protein belastning.
Mitokondriel kompleks-III-aktivitet blev bestemt i de rene mitokondrier isoleret fra kontrol og 150 uM capsaicin behandlet (
A
) BxPC-3 og (
B
) AsPC-1 celler for 2, 4 og 24 timer. (
C
) Sammenligning af kompleks-III-aktivitet i AsPC-1, BxPC-3, BxPC-3 ρ
0 og HDPE-6 celler behandlet med 150 pM capsaicin i 24 timer. (
D
) Capsaicin medieret fald i kompleks-III-aktivitet blev svækket ved forbehandling af BxPC-3-celler med katalase (2000 U /ml) eller EUK-134 (50 uM) i 1 time efterfulgt af 150 iM capsaicin i 24 timer. Resultater udtrykkes i forhold til kontrol som middelværdi ± SD (n = 3) af fire uafhængige forsøg. * Statistisk forskellig i forhold til kontrol (
P 0,05
) og ** statistisk forskellig sammenlignet med capsaicin behandling (
P 0,05
), som analyseres ved envejs ANOVA efterfulgt af Bonferroni indlæg -hoc test. (
E
) kompleks-III proteinekspression blev bestemt ved immunobloting hjælp rent mitokondrie protein isoleret fra kontrol og 150 uM capsaicin behandlet BxPC-3 celler for angivne tidsperioder eller (
F
) Forbehandling med katalase (2000 U /ml) eller EUK-134 (50 uM) i 1 time efterfulgt af 150 pM capsaicin i 24 timer. Ekspression af kompleks-III-proteinet blev bestemt ved immunoblotting fra isolerede rene mitokondrier som beskrevet i fremgangsmåden. Hver Blottet blev strippet og probet igen med anti-Cox-IV-antistof for at sikre lige protein loading. Disse forsøg blev udført tre gange uafhængigt med lignende resultat blev opnået i hvert forsøg.
Effekt af capsaicin på mitokondrie ATP generation
mitokondrier er den største kilde til energi til cellerne. Vi næste ønskede at vide, om capsaicin medieret forstyrrelse af mitokondrie respiratoriske komplekser påvirket ATP generation. For at bestemme niveauerne af ATP, vi evaluerede kompleks-V ATP syntase-aktivitet i mitokondrierne isoleret fra kontrol- og capsaicin behandlet BxPC-3 og AsPC-1-celler. Dannelsen af ATP er gennem kompleks-V i mitokondrierne. Capsaicin behandling forarmet ATP-niveauer med omkring 75% i begge BxPC-3 og AsPC-1-celler sammenlignet med kontrol (fig. 5A-B). Vi observerede også, at katalase og EUK-134 signifikant forhindrede faldet i ATP-niveauer som respons på capsaicin behandling (fig. 5C). For yderligere at bekræfte disse observationer blev ekspression af mitokondriel kompleks-V-protein bestemt ved western blotting. Vores resultater viser, at capsaicin behandling reducerede ekspression af komplekse-V-protein starter så tidligt som 1 time men var mere fremtrædende på 16 og 24 timer (fig. 5D). Dette fald i kompleks-V-ekspression blev svækket af katalase og EUK-134 (fig. 5E). Samlet set vores resultater viser, at capsaicin behandling drastisk forstyrrer mitokondrie funktioner skubber cellerne mod apoptose.
(
En
) BxPC-3 (
B
) AsPC-1-celler behandlet med DMSO eller 150 uM capsaicin i 24 timer, og (
C
) BxPC-3-celler blev behandlet med katalase (2000 U /ml) eller EUK-134 (50 uM) 1 time før 150 pM capsaicin behandling i 24 timer og ATP-syntase-aktivitet blev bestemt i ren mitokondrier protein isoleret fra kontrol og behandlede celler som beskrevet i metodeafsnittet. Resultater er udtrykt som middelværdi ± SD (n = 3) af tre uafhængige forsøg. * Statistisk signifikant sammenlignet med kontrol eller ** statistisk signifikant sammenlignet med capsaicin behandling, som analyseres ved envejs ANOVA efterfulgt af Bonferroni post-hoc test (
P 0,05
). (
D
) Effekt af capsaicin behandling på komplekse-V proteinekspression. BxPC-3-celler blev behandlet med DMSO eller 150 uM capsaicin for angivne tidspunkter perioder eller (
E
) BxPC-3-celler blev behandlet med katalase (2000 U /ml) eller EUK-134 (50 uM) i 1 h før behandling med 150 uM capsaicin i 24 timer. Ekspression af kompleks-V-protein blev bestemt ved immunoblotting i det rene mitokondrielle protein som beskrevet i metodeafsnittet. Hver Blottet blev strippet og probet igen med anti-Cox-IV-antistof for at sikre lige protein loading. Disse forsøg blev udført tre gange uafhængigt med lignende resultater opnået i hvert forsøg.
Capsaicin forstyrrer mitokondrielle membranpotentiale og forårsage oxidation af mitokondriel lipid
Overdreven intracellulære ROS føre cellerne for apoptose ved forstyrre mitochondriemembranpotential. Ændringen i mitochondriemembranpotential af capsaicin blev således bestemt ved farvning cellen med mitochondriemembran farvestof TMRM og analyseret ved flowcytometri. Vi fandt, at capsaicin behandling nedsatte signifikant mitokondrielle membranpotentiale i BxPC-3-celler med 26% sammenlignet med kontrol (fig. 6A). For at bekræfte, om capsaicin medieret ROS forårsager ændring i mitochondriemembranpotential blev katalase og EUK-134 anvendes. Forbehandling af celler med begge antioxidanter efterfulgt af capsaicin fuldstændig forhindret faldet i mitokondrie membranpotentiale (Fig. 6A). Gennemgået yderligere mulighed, om capsaicin fortrinsvis inducere mitokondrie lipidperoxidation i BxPC-3-celler. Til dette formål blev celler farvet med nonyl acridinorange (NAO) for at detektere oxidation af cardiolipin, et mitokondriemembranen lipidkomponent, ved fluorescensmikroskopi og flowcytometri [37]. Cardiolipin er udelukkende til stede i mitokondrier og efter at være mærket med NAO og udstillinger gul fluorescens. Når vi analyserede vores celler under fluorescensmikroskop, observerede vi, at næsten alle celler fra kontrolgruppen udviste gul farve. Men den gule farvning faldt og forvandlet til grøn i capsaicin-behandlede celler indikerer drastisk oxidation af cardiolipin (fig. 6B). Ikke desto mindre, katalase og EUK-134 forhindres fuldstændigt oxidationen af cardiolipin (fig. 6B). Disse resultater blev bekræftet ved flowcytometri, hvor vi observeret, at capsaicin forårsager cardiolipin oxidation i BxPC-3-celler som vist ved et skift i NAO-fluorescens i retning venstre (fig. 6C). Vi yderligere anvendte katalase og EUK-134 for at se, om oxidationen af cardiolipin kan forhindres. Vi fandt, at tilsætning af katalase eller EUK-134 næsten fuldstændig blokeret skiftet i NAO-farvning (fig. 6C) antyder, at faldet i NAO-fluorescens skyldtes oxidation af mitokondrisk lipid cardiolipin ved mitokondrie ROS.
(
A
) BxPC-3-celler blev behandlet med katalase (2000 U /ml) eller EUK-134 (50 uM) i 1 time efterfulgt af 150 pM capsaicin i 24 timer, og ændringen i mitochondriemembranpotential blev bestemt ved farvning cellen med mitochondriemembran farvestof TMRM og analyseret ved flowcytometri. Højre panel viser kvantificering af mitochondriemembranpotential. (
B
) Effekt af capsaicin på mitokondrie lipidperoxidation. BxPC-3-celler blev behandlet med katalase (2000 U /ml) eller EUK-134 (50 uM) i 1 time før behandling med 150 uM capsaicin i 24 timer og farvet med nonyl acridinorange (NAO) for at detektere oxidation af cardiolipin, en mitokondriemembranen lipidkomponent ved fluorescensmikroskopi, og (
D
) flowcytometri og højre panel viser kvantificering af mitokondriel cardiolipid oxidation. Repræsentativt resultat fra tre eksperimenter udført uafhængigt. * Statistisk anderledes sammenlignet med kontrol (
P 0,05
) eller ** statistisk forskellig sammenlignet med capsaicin behandling alene (
P 0,05
), som analyseres ved envejs ANOVA efterfulgt af Bonferroni post-hoc test.
capsaicin-induceret apoptose er attenuable af anti-oxidanter
Vi observerede, at capsaicin forårsager ROS generation ved at afbryde mitokondriefunktionen. Når mitokondrielle funktioner afbrydes, er cytochrom-c frigivet fra mitokondrier i cytosolen og aktivere caspase-3 kaskade, der fører cellerne i apoptose. Vi spekulerede på, om katalase og EUK-134 kunne ophæve capsaicin-induceret apoptose. Som vist i fig. 7A, PEG-SOD, PEG-katalase og EUK-134 signifikant beskyttet BxPC-3-celler fra capsaicin-induceret apoptose. Disse resultater blev yderligere bekræftet ved at evaluere frigivelse af cytochrom-c og spaltning af caspase-3 ved Western blotting. Vores resultater viser, at både katalase og EUK-134 signifikant forhindrede frigivelse af cytochrom-c i cytosolen og spaltning af caspase-3 medieres af capsaicin (fig. 7C). Det er bemærkelsesværdigt, at BxPC-3 ρ
0-celler, som er ude af stand til at producere ROS gennem mitokondrier, var fuldstændig resistente over for apoptose inducerende virkninger af capsaicin (fig. 7B), hvilket bekræfter involveringen af mitokondrier i capsaicin medieret ROS-generering og apoptose. Salg
(
A Salg) BxPC-3-celler blev forbehandlet med PEG-SOD (100 U /ml), PEG-katalase (500 U /ml) eller EUK-134 (50 uM ) i 1 time og derefter behandlet med DMSO eller 150 uM capsaicin i 24 timer, (
B
) BxPC-3 ρ
0 celler blev behandlet med DMSO eller 150 uM capsaicin i 24 timer, og apoptose blev bestemt under anvendelse af annexin-V /FITC og propidiumiodid og analyseret ved flow cytometery. Resultater er udtrykt som middelværdi ± SD (n = 3) af tre uafhængige forsøg. * Statistisk anderledes sammenlignet med kontrol (
P 0,05
) eller ** statistisk signifikant sammenlignet med capsaicin behandling (
P 0,05
), som analyseres ved envejs ANOVA efterfulgt af Bonferroni s post-hoc test. (C) Cytochrom-C og Cl-caspase-3 blev bestemt ved immunblotting i BxPC-3-celler forbehandlet med katalase (2000 U /ml) eller EUK-134 (50 uM) i 1 time før behandling med 150 uM capsaicin i 24 h. Hver Blottet blev strippet og probet igen med anti-actin-antistof for at sikre lige protein loading. Disse forsøg blev udført tre gange selvstændigt og lignende resultater blev opnået.
Capsaicin behandling forstyrrer cellulær redox homeostase resulterer i oxidativt stress
Redox homeostase i en celle skyldes en fin balance mellem det intracellulære ROS og ROS scavenging antioxidanter og enzymsystemer. Reduceret GSH er en intracellulær antioxidant og er kendt for at opretholde cellulær redox balance. Vi målte derfor intracellulære GSH-indholdet og endvidere bestemmes niveauerne af oxideret form af GSH (GSSG). Som vist i fig. 8A, capsaicin behandling steget GSSG niveauer betydeligt; og faldt GSH-indholdet indikerer forskydningen af redox ligevægt i retning pro-oxidant tilstand (fig. 8A-B). De andre enzymsystemer, som spiller rolle i redox balance omfatter superoxiddismutase (SOD), katalase og glutathionperoxidase (GPX). Superoxidradikaler dannes ved komplekse-I og kompleks-III i mitokondrierne og hurtigt omdannes til hydrogenperoxid grundet dismutation af superoxiddismutase. Som vist i fig. 8C, capsaicin behandling inhiberede 23-51% SOD-aktivitet i en tidsafhængig undersøgelse. De andre to enzymer (katalase og GPX) er involveret i afgiftende intracellulære peroxider, herunder hydrogenperoxid. Vores resultater viser, at capsaicin reducerede signifikant enzymatisk aktivitet af katalase inden 2 timer af behandlingen (fig. 8D). Disse observationer blev bekræftet ved katalase proteinekspression. Vi observerede, at katalase udtryk blev reduceret efter 2 timers capsaicin behandling (fig. 8 D-E). Gennem vores studier, bemærkede vi, at katalase eller EUK-134 tilskud forhindrede ROS generation og beskyttet cellerne fra de skadelige virkninger af capsaicin, der tydeligt viser, at katalase spiller en kritisk rolle i capsaicin medieret oxidativ stress og apoptose i bugspytkirtelkræftceller. Da glutathion peroxidase er et andet vigtigt enzym, der udnytter GSH som substrat til at afgifte hydrogenperoxid, vi fastlagt sin enzymatiske aktivitet og protein udtryk. Som det kan ses i fig. 8 F-G, capsaicin reduceret GPX-aktivitet og ekspression i BxPC-3-celler som respons på capsaicin behandling. Faktisk var ekspressionen af GPX væsentligt reduceret lige efter 1 time af capsaicin behandling. Tilsammen vores resultater antyder, at udtømning af GSH-niveau og inhibering af SOD, katalase og GPX ved capsaicin forstyrrer det cellulære redox homeostase resulterer i øget oxidativ stress.
(A) Effekt af capsaicin på niveauerne af oxideret glutathion (GSSG). BxPC-3 celler blev behandlet med DMSO eller 150 uM capsaicin til 2, 4 og 24 timer og GSSG og (
B
) GSH-niveauer blev bestemt ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt kit. Disse forsøg blev gentaget to gange med lignende resultater opnået hver gang. (
C
) SOD, (
D
) Katalase, (
F
) GPX aktiviteter blev bestemt som beskrevet i afsnit metoden. BxPC-3-celler blev behandlet med DMSO eller 150 uM capsaicin i 2, 4 og 24 timer. Resultater er udtrykt som middelværdi ± SD (n = 3) af tre uafhængige forsøg. * Statistisk anderledes sammenlignet med kontrol (
P 0,05
), som analyseres af envejs ANOVA efterfulgt af Bonferroni post-hoc test.
(E) og (G)
Ekspression af katalase og GPx1 blev bestemt ved immunblotting af BxPC-3-celler behandlet med DMSO eller 150 uM capsaicin for angivne tidsrum. Hver Blottet blev strippet og probet igen med anti-actin-antistof for at sikre lige protein loading. Disse forsøg blev udført tre gange uafhængigt og lignende resultater blev opnået.
Ektopisk ekspression af katalase beskytte cellerne fra capsaicin medieret ROS-generering og apoptose
Da vi observeret, at capsaicin medieret ROS-generering , skade på mitokondrier og apoptose blev svækket af katalase eller EUK-134, vi næste ønskede at se, om ektopisk udtryk for katalase kan beskytte cellerne fra capsaicin medieret skade. Vi transient transficeret cellerne med katalase udtrykkende plasmid og var i stand til at opnå omkring 1,6 gange overekspression af katalase sammenlignet med vektorkontrol (fig. 9A). Faldet i katalase-ekspression ved capsaicin behandling blev blokeret i cellerne transficeret med katalase (fig. 9A). Endvidere katalase overudtrykker BxPC-3-celler blokerede fuldstændigt samlede ROS-generering af capsaicin og beskyttede cellerne fra apoptose sammenlignet med capsaicin behandlet vektor transficerede celler (fig. 9B-C). Frigivelse af cytochrom c og spaltning af caspase-3 blev også fuldstændigt blokeret i cellerne overudtrykker katalase (fig. 9A). I fig.
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.