PLoS ONE: Funktionel opregulering af Nav1.8 natriumkanaler på membranen af ​​dorsalrodsganglier Neuroner bidrager til udviklingen af ​​kræft-induceret Bone Pain

Abstrakt

Vi har tidligere rapporteret, at øget ophidselse af dorsalrodsganglier (DRG) neuroner bidrager til udvikling af knogle cancersmerte, som alvorligt nedsætter livskvaliteten for kræftpatienter. Nav1.8, en tetrodotoxin-resistente (TTX-R) natriumkanal, bidrager de fleste af natriumstrømmen underliggende aktionspotentialet opadgående slag og tegner sig for det meste af strømmen i senere pigge i et tog. Vi spekulere, at Nav1.8 natriumkanalen er en potentiel kandidat ansvarlig for den forøgede ophidselse af DRG-neuroner i rotter med smerter knoglekræft. Her, ved hjælp elektrofysiologi, Western blot og opførsel assays dokumenteret vi, at strømtætheden af ​​TTX-R natriumkanaler, især Nav1.8 kanal, steget betydeligt i DRG-neuroner i rotter med cancer-induceret knoglesmerte. Denne stigning kan skyldes en forøget ekspression af Nav1.8 på membranen af ​​DRG-neuroner. I henhold hertil, blokade af Nav1.8 natriumkanaler ved sin selektive blokker A-803.467 betydeligt lettet kræft-induceret mekanisk allodyni og termisk hyperalgesi hos rotter. Tilsammen disse resultater tyder på, at funktionel opregulering af Nav1.8 kanaler på membranen af ​​DRG-neuroner bidrager til udvikling af kræft-induceret knoglesmerter

Henvisning:. Liu XD, Yang JJ, Fang D, Cai J , Wan Y, Xing GG (2014) Funktionel opregulering af Nav1.8 natriumkanaler på membranen af ​​dorsalrodsganglier Neuroner bidrager til udviklingen af ​​kræft-induceret knoglesmerter. PLoS ONE 9 (12): e114623. doi: 10,1371 /journal.pone.0114623

Redaktør: Joseph Charles Glorioso, University of Pittsburgh School of Medicine, USA

Modtaget: August 7, 2014 Accepteret: 11. november 2014 Udgivet: 11. december 2014

Copyright: © 2014 Liu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Den nuværende arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (81371237, 31171063,81072951), Beijing Natural Science Foundation (7112079), den særlige fundament for offentlig velfærd erhverv videnskabelig forskning program fra Sundhedsministeriet i Folkerepublikken Kina (201.302.013-01) og “973” program for Ministeriet for Videnskab og Teknologi i Kina (2013CB531905). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Bone cancer smerter som følge af primære tumorer eller tumorer, der metastaserer til knoglerne, er en af ​​de mest alvorlige og vanskelige typer af cancersmerter, som nedsætter livskvaliteten for patienter [1]. De mekanismer, der ligger til grund for udviklingen af ​​knoglesmerter kræft stort set ukendt.

For nylig, vi og andre har fundet, at termisk hyperalgesi og mekanisk hypersensitivitet i murine modeller af smerte knoglekræft er forbundet med øget ophidselse af primære nociceptive DRG neuroner [ ,,,0],2], [3]. Svarene fra nociceptorer til skadelige stimuli er kodet af aktionspotentialer, hvis tilblivelse og formering er afhængige af spændingsafhængige natriumkanaler. Således har afvigende ekspressionsmønstre for disse kanaler og nedarvede natrium- kanalopatier blevet forbundet med neuropatisk og inflammatorisk smerte [4]. Voksen DRG neuroner kan udtrykke både tetrodotoxin-følsomme (TTX-S) og tetrodotoxin-resistente (TTX-R) natriumkanaler. Blandt de sidstnævnte er TTX-R natrium kanal Nav1.8 specifikt udtrykt på sensoriske neuroner [5], [6]. Derfor Nav1.8 er en af ​​de mest attraktive mål for udviklingen af ​​nye farmaceutiske midler til behandling af smerter.

Nav1.8 frembringer en langsom-inaktiverende, hurtig-genpræpareringsundersøgelse TTX-R natriumstrøm med depolariserede aktivering og inaktivering spænding-afhængighed [6], [7]. Nav1.8 bidrager mest af natriumstrømmen underliggende aktionspotentialet opadgående slag i neuroner, der udtrykker kanalen [8], [9]. De biofysiske egenskaber Nav1.8, sin kritiske rolle i gentagne fyring, og dens tilstedeværelse i frie nerveender, hvor smerte signalering initieres, tyder på, at Nav1.8 væsentligt kan påvirke nociceptorer uro og dermed bidrage til smerte. Rolle Nav1.8 i neuropatisk og inflammatorisk smerte er godt gennemgået af Dib-Hajj et al. [4]. Men om Nav1.8 bidrager til udviklingen af ​​cancer-induceret knoglesmerte er stort set ukendt. For nylig Qiu og kolleger [10] har observeret en øget ekspression af Nav1.8 inden DRG i en rottemodel af Walker 256 tumorsmerter celle-induceret knoglekræft, hvilket antyder den mulige involvering af Nav1.8 i udviklingen af ​​cancer-induceret knogle smerte. I denne undersøgelse, hjælp elektrofysiologi, Western blot og farmakologiske adfærd metoder, giver vi beviser for, at funktionel opregulering af Nav1.8 kanaler på membranen af ​​DRG-neuroner bidrager til udvikling af kræft-induceret knoglesmerter.

Materialer og metoder

Dyr

Voksen Sprague-Dawley hanrotter, der vejede 180-220 g ved begyndelsen af ​​forsøgene blev leveret af Institut for Eksperimentel Animal Sciences, Peking University Health Science center. Rotterne blev huset i separate bure med fri adgang til foder og vand. Rumtemperaturen blev holdt ved 24 ± 1 ° C under naturlige lys /mørke-cyklus. Alle eksperimentelle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne i IASP [11] og blev godkendt af Animal Care og brug Udvalg for Peking University.

Podning af tumorceller

MRMT-1 rotte brystkirtlen carcinomaceller blev dyrket i medium indeholdende RPMI 1640 (Hyclone, USA) og 10% føtalt bovint serum. Celler blev frigjort fra plasten ved kort eksponering til 0,25% (vægt /volumen) trypsin (Gibco, USA), og derefter fremstillet til injektion som følger: cellerne blev først opsamlet ved centrifugering af 10 ml medium i 3 min ved 1000 rpm . Den resulterende pellet blev derefter resuspenderet i 1 ml phosphatbufret saltvand (PBS), og celler blev talt under anvendelse af et hæmocytometer. Derefter blev cellerne fortyndet til opnåelse af den endelige koncentration til injektion og opbevares på is indtil injiceret i dyr. En rottemodel af smerte knoglekræft blev etableret af intratibial injektion af syngene MRMT-1 celler som tidligere beskrevet [12]. Kort fortalt, efter bedøvet med chloralhydrat (0,3 g /kg, i.p.) blev rotten venstre skinneben omhyggeligt eksponeret, og en 23-gauge nål blev indsat i den intramedullære kanal i knoglen. Den blev derefter fjernet og erstattet med en lang tynd stump nål fastgjort til en 10-pi Hamilton-sprøjte indeholdende mediet, der skal injiceres. Et volumen på 4 pi MRMT-1 rotte mælkekirtlen carcinomceller (4 × 10

4) eller vehikel (PBS) blev injiceret i den tibiale knogle hulrum. Efter injektion sitet blev forseglet med knoglevoks, og såret blev endeligt lukket. Ingen af ​​dyrene viste tegn på motorisk funktionsforstyrrelse efter implantation af tumorceller.

helcelle-patch clamp optagelse

Neuroner blev isoleret fra L4 og L5 DRG fra voksne rotter under anvendelse af fremgangsmåder som beskrevet i vor tidligere undersøgelser [3], [13]. Kort fortalt blev frisk dissekerede ganglier hakket og vasket i koldt, oxygeneret Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM, Sigma), og blev derefter udsat for collagenase (3 mg /ml, type IA, Sigma) behandling i 45 minutter, efterfulgt af trypsin (2 mg /ml, type II-S, Sigma) i 15 minutter ved 37 ° C. Den enzymatiske reaktion blev stoppet ved vask af cellerne med DMEM indeholdende 10% føtalt bovint serum, og den resterende ganglier blev forsigtigt findelt ved anvendelse af en brand-poleret glas Pasteur-pipette og ført gennem en 40-um cellefilter. Suspensionen blev derefter centrifugeret ved 800 rpm i 3 minutter, og cellepelleten blev resuspenderet i frisk DMEM suppleret med 10% føtalt bovint serum. De dissocierede celler blev anbragt på poly-D-lysin (0,1 mg /ml, Sigma) -behandlede dækglas indeholdt inden for 4 brønde sterile vævskulturplader og holdes i 5% CO

2 inkubator ved 37 ° C i 2 til 3 timer før optagelse.

helcelle-patch clamp optagelser fra akut dissocierede DRG-neuroner blev udført ved anvendelse af en EPC-10 forstærker og Patchmaster software (HEKA, Freiburg, Tyskland). Patch pipetter blev trukket af borsilikatglas kapillærer med en spids modstand på 5 til 8 MOhm når den er fyldt med intern opløsning indeholdende følgende (i mM): 135 CsF, 10 NaCl, 10 HEPES, 5 EGTA og 2 Na

2ATP. PH blev justeret til 7,3 ved anvendelse af CsOH. Den eksterne opløsning indeholdt følgende (i mM): 30 NaCI, 20 TEA-Cl, 90 cholin-CI, 3 KCI, 1 CaClz

2, 1 MgCl

2, 10 HEPES, 10 glucose og 0,1 CDC

2. PH blev justeret til 7,3 under anvendelse af Tris-base. Membran strømme blev målt med pipette og membran kapacitans annullering, filtreres ved 2 kHz og digitaliseret ved 10 kHz.

Under spænding-clamp optagelsestilstand blev cellerne fastspændt ved -70 mV, og serie modstand blev kompenseret til 70 % -90%. Membranen kapacitans blev erhvervet fra forstærkeren ved Patchmaster software til udmåling af celler og beregne den aktuelle tæthed. Alle optagelser blev udført på små og mellemstore diameter (20-35 um) DRG-neuroner, som er kendt for at udtrykke både TTX-S og TTX-R natrium strømme [14], [15]. TTX-R strømme blev fremkaldt fra en bedrift potentiale -120 mV til testimpulserne spænder fra -80 til +45 mV i trin på 5 mV ved en frekvens på 0,2 Hz i tilstedeværelse af TTX (300 nM) til at blokere alle TTX -S kanaler. En Nav1.8-medieret natrium strøm blev fremkaldt med en spænding-clamp protokol, der bruges af Rush og Waxman [16] og Berta et al. [17] i nærværelse af 300 nM TTX. Testpulser spænder fra -80 til +40 mV i spring på 5 mV ved en frekvens på 0,2 Hz, blev forudgået af en 500 ms pre-impuls trin ved -40 mV, for at inaktivere TTX-R Nav1.9 medieret strøm. Den maksimale spidsstrøm ved forskellige spændinger blev anvendt til strømtæthed analyse. De normaliserede aktiveringskurver (I /I

0) blev tilpasset ved anvendelse af følgende Boltzmann fordeling ligning: I /I

0 = 1-1 /{1 + exp [(V

1/2-V

m) /k]}, hvor i

0 er den maksimale peak strøm ved forskellige prøvespændinger, V

m er den test potentiale, V

1/2 er membranpotentialet på halv-maksimal i, og k er hældningen faktor. Den spændingsafhængige steady-state inaktivering blev estimeret ved at måle peak strømamplitude frembringes af en 100-ms test impuls til -10 mV efter en 500-ms præ-puls til potentialet over området -80 til +10 mV med en 20-s inter-impulsperiode. De normaliserede inaktiveringsprocesser kurver (I /I

0) blev tilpasset ved anvendelse af følgende Boltzmann fordeling ligning: I /I

0 = 1 /{1 + exp [(V

1/2-V

m) /k]}, hvor i

0 er toppens natrium strøm ved afprøvet puls målt fra den mest negative konditionering puls potentiale, V

m er konditionering puls potentiale, V

1/2 er membranpotentiale ved halvmaksimal i, og k er hældningen faktor. Dataanalyse og montering blev udført ved anvendelse Origin software 8.5 (OriginLab Corporation, Northampton, MA).

Western blot-

Rotter blev dybt anæstetiseret med 10% chloralhydrat (0,3 g /kg, ip) og derefter L4 og L5 DRG blev fjernet og straks homogeniseret ifølge protokollen beskrevet i for total protein ekstraktion og assay vores tidligere rapport [18]. For cytosol eller membranprotein ekstraktion og separation, blev DRG væv dissekeret og lyseret ved homogenisering med Nucl-Cyto-Mem forberedelse kit (Applygen, Kina) ifølge producentens instruktioner, og derefter analyseres under anvendelse af fremgangsmåder beskrevet af Black et al. [19]. Ti mikrogram af total protein blev blandet med 4 × loading buffer og derefter underkastet SDS-PAGE. Efter blokering med 5% fedtfri mælk i Tris-bufret saltvand og Tween (TBST, 20 mM Tris-HCI (pH 7,5), 150 mM NaCI og 0,05% Tween-20) i 60 minutter ved stuetemperatur blev PVDF-membraner inkuberet med de følgende primære antistoffer ved 4 ° C natten over: kanin anti-rotte Nav1.8 antistof (1:1000, Alomone Labs), muse-anti-β-actin (1:3000, Santa Cruz Biotechnology), eller muse-anti-rotte-transferrin receptor (TfR) antistof (1:2000, Invitrogen). Blottene blev vasket i TBST og inkuberes derefter i peberrodsperoxidasekonjugeret gede-anti-kanin /muse-IgG sekundært antistof (1:2000, Santa Cruz Biotechnology). Proteinbånd blev visualiseret ved anvendelse af et forøget kemiluminescens detektion kit (Pierce) efterfulgt af autoradiografi under anvendelse af Hyperfilm MP (Santa Cruz Biotechnology). Blots blev scannet med en kanon scanner (Cannon, Inc., Japan), og bandet densiteter blev detekteret med Mængde én software (Bio-Rad, USA). Data fra fem rotter blev anvendt til statistisk analyse.

Implantation af intratekal kateter og injektion af lægemidler

For farmakologisk blokade af Nav1.8 kanaler, katetre blev implanteret samtidig med MRMT- 1 tumorceller eller PBS inokulering. Under chloralhydrat (0,3 g /kg, i.p.) anæstesi, blev implantation af intratekal kanyle udført som beskrevet i vores tidligere undersøgelse [20]. Kort fortalt blev en PE-10 polyethylenkateter implanteret mellem L5 og L6 ryghvirvler at nå tømmer udvidelsen af ​​rygmarven. Den ydre del af katetret blev tilsluttet og fastgjort på huden på lukning af såret. Alle kirurgiske procedurer blev udført under sterile betingelser. Rotter med neurologiske underskud efter kateteret implantation blev udelukket.

For at undersøge effekten af ​​farmakologisk blokade af Nav1.8 med en selektiv antagonist A-803.467 (Tocris, UK) på rotter knoglekræft, A-803.467 (50, 100 og 150 nmol) eller dets vehikel (1% DMSO) blev intratekalt leveret til MRMT-1-rotter på dag 14 efter podning af tumorceller, når smerte overfølsomhed vises. Som en kontrol, høj dosis af A-803.467 (150 nmol) eller dets vehikel (1% DMSO) blev også intratekalt administreret til PBS podede skin dyr på dag 14 efter PBS inokulering. Lægemiddel eller køretøjet blev intratekalt injiceret via den implanterede kateter i en 10 pi rumfang af opløsning efterfulgt af 10 pi normalt saltvand (NS) til skylning. Hver injektion varede mindst 5 min. Efter en injektion, nålen forblev in situ i 2 minutter, inden de blev trukket tilbage. Både smerte adfærd og lokomotorisk funktion af dyr blev vurderet ved 15, 30, 60, 90 og 120 min efter lægemiddeltilførsel.

Vurdering af mekanisk allodyni

mekanisk allodyni, som en adfærdsmæssig tegn på knogle cancersmerte, blev vurderet ved at måle 50% tærskel potetilbagetrækning (PWT) som beskrevet i vores tidligere rapporter [3], [21]. De 50% PWT som reaktion på en række von Frey filamenter (Stoelting, Wood Dale, IL, USA) blev bestemt af Op og Ned metoden [22]. Rotter blev anbragt på en metal mesh gulv dækket med en omvendt klar plast bur (18 × 8 × 8 cm) og tilladt en 20 min periode for tilvænning. Otte von Frey filamenter med omtrent lige logaritmiske trinvise (0,224) bøjningskræfter blev valgt (0,41, 0,70, 1,20, 2,00, 3,63, 5,50, 8,50, og 15,10 g). Hvert forsøg startede med en von Frey kraft 2,00 g leveret vinkelret på den plantare overflade af den venstre bagpote i ca 2-3 sekunder. En pludselig tilbagetrækning af foden under stimulation eller umiddelbart efter fjernelsen af ​​hår blev registreret som en positiv reaktion. Hver gang der var en positiv eller negativ respons, den næste svagere eller stærkere filament blev anvendt henholdsvis. Denne procedure blev udført indtil seks stimuli efter den første ændring i reaktion var blevet observeret. Den PWT 50% blev beregnet ved hjælp af følgende formel: 50% PWT = 10

(X

f

+ kδ), hvor X

f er værdien af ​​den endelige von Frey filament anvendes (i log enheder), k er en værdi målt fra mønstret af positive /negative reaktioner, og δ = 0,224, som er det gennemsnitlige interval (i log-enheder) mellem von Frey-filamenter [23]. Hvis et dyr reagerede på den laveste von Frey filament, blev en værdi på 0,25 g tildelt. Hvis et dyr ikke reagerede på det højeste von Frey filament, blev værdien registreres som 15,0 g. Afprøvning sessioner blev udført ved 0, 15, 30, 60, 90 og 120 min efter lægemiddelinjektion.

Vurdering af termisk hyperalgesi

Termisk hyperalgesi af bagpoten blev testet som beskrevet af vores tidligere rapport [20]. Rotter fik lov til at akklimatisere i minimum 30 minutter inden akryl indhegninger på en klar glasplade holdt ved 30 ° C. En strålevarme kilde blev fokuseret på den plantare overflade af den bagpote. Målinger af pote tilbagetrækning latency (PWL) blev taget af en timer, der blev startet af aktivering af varmekilden og stoppes, når tilbagetrækning af poten blev opdaget med en fotodetektor. En maksimal cut-off på 30 s blev brugt til at forhindre unødvendige vævsskader. Tre målinger af PWL blev taget for hver bagpote og blev midlet som et resultat af hver test session. Den bagpote blev testet skiftevis med mere end 5 min intervaller mellem på hinanden følgende prøver.

Vurdering af bevægeapparatet funktion

blev udført Skrå-plade test til vurdering af bevægeapparatet funktion til rotter modtog A-803.467 (150 nmol). Rotten blev anbragt på tværs af den lange akse af en skrå plade. Den indledende vinkel skråpladen var 50 °. Vinklen blev derefter indstillet i trin 5-graders. Den maksimale vinkel af pladen, på hvilken rotten fastholdt sin kropsstilling i 5 s uden at falde blev bestemt ifølge fremgangsmåden rapporteret tidligere [24].

Statistisk analyse

Statistiske analyser blev udført med GraphPad Prism 5.0 pakke (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA). Alle data blev udtrykt som middelværdien ± SEM. Envejs variansanalyse (ANOVA) efterfulgt af Dunnetts multiple sammenligningstest eller to-vejs ANOVA efterfulgt af Bonferroni post-hoc test blev anvendt til multiple sammenligninger. Forskelle med P. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Stigning i TTX-R natrium strøm i DRG neuroner i rotter med smerte knoglekræft

For at undersøge, om TTX- R natriumkanaler bidrager til udviklingen af ​​cancer-induceret knoglesmerter, vi først målte TTX-R natriumstrømme er optaget på akut isoleret DRG-neuroner i en rottemodel af smerte knoglekræft, ved tilsætning af TTX (300 nM) til badopløsningen at blokere alle TTX-sensitive kanaler [25]. Spændingsprotokollen vi anvendes, er vist i fig. 1A. Vi fandt, at tætheden af ​​TTX-R natriumstrøm steg gradvist efter inokulation af tumorceller i en tidsafhængig måde. På dag 7 efter inokulation, blev ingen signifikant forskel observeret på tætheden af ​​TTX-R natriumstrøm mellem neuroner fra rotter behandlet med MRMT-1 tumorceller (96,67 ± 8,2 pA /pF, n = 14), og dem fra rotter behandlet med PBS (97,08 ± 5,8 pA /pF, n = 15) (P 0,05, to-vejs ANOVA, fig 1C, D og G.), hvilket er i overensstemmelse med vores tidligere adfærdsmæssige fund viser at der ikke var nogen mekanisk eller termisk smerte overfølsomhed ved at tid [3]. Imidlertid på dag 14 efter inokulering, tætheden af ​​TTX-R natriumstrøm steg betydeligt i MRMT-1-behandlede rotter (181,34 ± 17,2 pA /pF, n = 19) sammenlignet med PBS-behandlede rotter (100,83 ± 14,7 pA /pF , n = 15) (P 0,001, to-vejs ANOVA, fig 1E til G).. Repræsentative spor af TTX-R natriumstrøm i naive, PBS-behandlede og MRMT-1-behandlede rotter, der konstateres på DRG-neuroner ved 7 og 14 dage efter inokulation af tumorceller eller PBS er vist i fig. 1B til F.

(A): Spænding protokol bruges til optagelse TTX-R natriumstrøm med 300 nM TTX i badopløsningen. (B til F): Repræsentative spor af TTX-R natriumstrøm i naive (B), PBS-behandlede (C og E) og MRMT-1-behandlede (D og F) rotter, der er optaget på DRG-neuroner ved 7 (C og D) og 14 (E og F) dage efter podning af tumorceller eller PBS. (G): Statistisk analyse af toppen strømtæthed. Bemærk, at tætheden af ​​TTX-R natriumstrøm forøges væsentligt i de DRG neuroner i rotter knoglekræft.

***

P

. 0,001, sammenlignet med PBS gruppe, to-vejs ANOVA, n = 19 (MRMT-1) og 15 (PBS)

Stigning i Nav1.8 natrium strøm i DRG neuroner i rotter med smerte knoglekræft

for at isolere Nav1.8 natrium strøm fra total TTX-R natrium strøm, brugte vi en anden spænding protokol med en 500-ms præ-puls ved -40 mV at inaktivere Nav1.9 kanal som beskrevet i tidligere rapport [17] (fig. 2G). Resultaterne viste, at tætheden af ​​Nav1.8-medieret natrium nuværende 14 dage efter inokulering steget betydeligt i MRMT-1-behandlede rotter (136,11 ± 10,4 pA /pF, n = 17) sammenlignet med PBS-behandlede rotter (74.09 ± 10,0 pA /pF, n = 16) (P 0,001, to-vejs ANOVA, fig 2D til F).. Svarende til densiteten af ​​den TTX-R natriumstrøm, den Nav1.8-medierede strømtæthed forblev uændret på dag 7 efter podning af tumorceller (P 0,05 vs. PBS, to-vejs ANOVA, n = 11 MRMT- 1 og 12 PBS, fig. 2B, C og F). For at undersøge om de iboende egenskaber i Nav1.8 natriumkanalen blev ændret efter inokuleringen af ​​tumorceller, undersøgte vi både aktiverings- og inaktivering kurver Nav1.8-medierede natriumstrømme i naive, PBS-behandlede og MRMT-1-behandlede rotter . Som vist i fig. 2H og jeg, ingen signifikant ændring blev observeret på enten aktivering (fig. 2H) eller inaktiveringen (fig. 2i) kurver mellem de tre grupper, hvilket indikerer, at de iboende egenskaber i Nav1.8 natriumkanalen forblev uændret efter podning af tumor celler. Repræsentative spor af Nav1.8-medieret natriumstrøm i naive, PBS og MRMT-1-behandlede rotter, der konstateres på DRG-neuroner ved 7 og 14 dage efter inokulation af tumorceller eller PBS er vist i fig. 2A til E.

(A til E): Repræsentative spor af Nav1.8-medieret natriumstrøm i naive (A), PBS (B og D) og MRMT-1-behandlede (C og E) rotter, der er optaget på DRG-neuroner ved 7 (B og C) og 14 (D og E) dage efter podning med tumorceller eller PBS. (F): Statistisk analyse af toppen strømtæthed. Bemærk, at tætheden af ​​Nav1.8-medieret natriumstrøm forøges væsentligt i de DRG neuroner i rotter knoglekræft.

***

P

0,001, sammenlignet med PBS gruppe, to-vejs ANOVA, n = 17 (MRMT-1) og 16 (PBS). (G): Spænding protokol, der bruges til optagelse Nav1.8-medieret natriumstrømme med 300 nM TTX i badopløsningen. En 500-ms pre-impuls ved -40 mV blev anvendt til at inaktivere Nav1.9 natriumkanaler. (H og I): Aktivering og inaktivering kurver Nav1.8-medieret natriumstrøm i naive, PBS-behandlede og MRMT-1-behandlede rotter ved 14 dage efter podning af tumorceller eller PBS. Bemærk, at ingen signifikant ændring observeres enten på aktiveringen (H) eller på inaktivering (I) kurver mellem de tre grupper. Aktiveringskurver blev tilpasset ved anvendelse af den samme protokol, der anvendes til registrering af Nav1.8 natriumstrømmen. Bemærk, at kurverne i naiv og PBS-grupper overlapper næsten fuldstændigt. Inaktivering kurver blev monteret under anvendelse af protokollen beskrevet i metoder.

Stigning i membran udtryk for Nav1.8 protein i DRG af rotter med smerte knoglekræft

Desuden har vi undersøgt ekspression af Nav1.8 protein i DRG af rotter med cancer-induceret knoglesmerter, navnlig kanalerne på cellemembranen, som repræsenterer funktionelle kanaler. Anvendelse af Western blot-assay, fandt vi, at ekspressionen af ​​Nav1.8 totalt protein i ipsilaterale L4 og L5 DRG uændret fra dag 7 til dag 14 i MRMT-1-behandlede rotter sammenlignet med PBS-behandlede rotter (P 0,05, to- vejs ANOVA, n = 4 /gruppe, fig. 3A). Dette var uventet, da elektrofysiologi eksperimenter afslørede en øget strømtæthed af Nav1.8 i MRMT-1-behandlede rotter (se fig. 2). Vi spekulere, at en sådan forøgelse af Nav1.8 natriumstrøm skyldes sandsynligvis forøget ekspression af Nav1.8 på cellemembranen fordi iboende egenskaber Nav1.8 natriumkanalen forblev uændret efter podning af tumorceller (se fig. 2H og JEG). At afklare denne hypotese yderligere detekteret vi membranen ekspression af Nav1.8 anvendelse af en højhastigheds-centrifugering metode til isolering membranfraktionen fra DRG-celler som beskrevet i tidligere undersøgelse [19]. Som forventet, 14 dage efter podning med tumorceller, bandet tætheden af ​​Nav1.8 protein udtrykt på cellemembranen forøges markant i MRMT-1-behandlede rotter (1,45 ± 0,06, n = 6) sammenlignet med PBS-behandlede rotter ( 0,87 ± 0,07, n = 6) (P 0,001, to-vejs ANOVA, fig 3B).. I mellemtiden bandet tætheden af ​​Nav1.8 protein placeret i cytosolen faldt markant i MRMT-1-behandlede rotter (0,57 ± 0,04, n = 3) sammenlignet med PBS-behandlede rotter (1,09 ± 0,02, n = 3) (P . 0.001, to-vejs ANOVA, fig 3C)

(A):. Total Nav1.8 protein. Øvre: repræsentant for Western blot bands; Lavere: statistisk analyse af Nav1.8 total protein udtryk. Ingen væsentlig forskel er observeret på ekspressionen af ​​Nav1.8 totalt protein mellem de tre grupper.

P

0,05, to-vejs ANOVA, n = 4 /gruppe. (B): Nav1.8 membranprotein. Øvre: repræsentant for Western blot bands. Transferrin receptor (TFR), der anvendes som intern kontrol. Lavere: statistisk analyse af Nav1.8 membranprotein udtryk. Bemærk, at ekspressionen af ​​Nav1.8 på cellemembranen forøges væsentligt i de DRG-neuroner i MRMT-1-behandlede rotter sammenlignet med PBS-behandlede rotter.

***

P

0,001, to-vejs ANOVA, n = 6 /gruppe. (C): Nav1.8 protein i cytosolen. Bemærk, at ekspressionen af ​​Nav1.8 i cytosolen er signifikant reduceret i DRG-neuroner i MRMT-1-behandlede rotter sammenlignet med PBS-behandlede rotter.

***

P

. 0,001, to-vejs ANOVA, n = 3 /gruppe

A-803.467 lindrer den mekaniske allodyni og termisk hyperalgesi knoglekræft rotter

Endelig har vi undersøgt, om a-803.467, en selektiv blokker af Nav1.8 [26] kunne afhjælpe kræft-induceret knoglesmerter hos rotter. Vi testede PWT og PWL på dag 14 efter podning af tumorceller eller PBS som basislinjen. Derefter blev A-803.467 eller køretøj DMSO intrathekalt leveret til MRMT-1 inokulerede smerte rotter kræft samt PBS podede sham-rotter, og både PWT og PWL blev målt ved 15, 30, 60, 90 og 120 min efter lægemiddeltilførsel. Doseringen og injektion roden af ​​A-803.467 blev ifølge en tidligere rapport, der viser, at intratekal administration af A-803.467 (50-150 nmol) reducerer både fremkaldt og spontane udledninger af stort dynamikområde (WDR) neuroner i rygmarven dorsale horn [27 ]. Som vist i fig. 4, kunne intratekal indgift af A-803.467 (på både 100 og 150 nmol) fremtrædende gendanne knoglekræft-inducerede fald i både PWT (P ,05-,001, vs. køretøj /kræft rotter gruppe, to-vejs ANOVA, n = 7-8 /gruppe, fig 4A) og PWL (P . 0,05-,001, vs. køretøj /kræft rotter gruppe, to-vejs ANOVA, n = 6-9 /gruppe, fig 4B) af rotter kræft.. Derimod selv en høj dosis af A-803.467 (150 nmol) havde ingen signifikant virkning på PWL og PWT PBS inokuleret skin rotter (P 0,05, vs. køretøj /skin-rotter gruppe, to-vejs ANOVA, n = 6 /gruppe, fig. 4A og B). For at udelukke enhver mulig motorisk dysfunktion induceret af A-803.467, vi undersøgte også effekten af ​​A-803.467 (ved en maksimal dosis på 150 nmol) på bevægeapparatet funktion rotter ved hjælp af skrå-plade test. Som vores forventning, blev ingen signifikant motorisk funktionsforstyrrelse observeret ved noget tidspunkt efter lægemiddeladministration injektion (p 0,05, envejs ANOVA, n = 7 /gruppe, Fig 4C.). Disse data antyder, at inhiberingen af ​​Nav1.8 af A-803.467 kan redde tumorinduceret mekanisk allodyni og termisk hyperalgesi hos rotter knoglekræft

(A, B):. Virkninger af A-803.467 (ved 50 , 100 og 150 nmol) på mekanisk (A) og termiske (B) smertestillende adfærd i rotter vurderet på dag 14 efter inokulering af MRMT-1 tumorceller eller PBS. Bemærk, at A-803.467 bemærkelsesværdigt genopretter tumorceller-induceret reduktion af PWT og PWL i kræft model rotter, men har ingen væsentlig effekt på PWL og PWT i PBS podede sham rotter.

* /#

P

0,05,

** /##

P

0,01,

***

P

0,05, en-vejs ANOVA, n = 7 /gruppe

Diskussion

Funktionel opregulering af Nav1.8 natriumkanaler i DRG neuroner i. rotter med smerte knoglekræft

i overensstemmelse med tidligere resultater, at ekspressionen af ​​Nav1.8 mRNA og protein er steget inden for lumbal 4-5 DRG i en dyremodel af knoglekræft smerte [10], vores nuværende undersøgelse giver yderligere direkte dokumentation en funktionel opregulering af spænding-gated natriumkanal undertype Nav1.8 på membranen af ​​DRG-neuroner i en cancer rotte smerte model, som har vist sig at være behov for udvikling af kræft-induceret knoglesmerter.

Biofysiske og farmakologiske studier har identificeret, at fire perifere-specifikke natriumkanaler herunder TTX-S kanaler Nav-1.3 og Nav-1.7 og TTX-R-kanaler NaV1.8 og NaV1.9 fortrinsvis udtrykkes på primære sensoriske DRG neuroner og leg vigtige roller i patofysiologien af ​​forskellige smertesyndromer [18], [28], [29]. Blandt dem har Nav1.8 natriumkanalen vist sig at være nødvendigt for mange typer af kronisk inflammatorisk og neuropatisk smerte [26], [30], [31]. Imidlertid er stadig ukendt rolle Nav1.8 natriumkanalen i patogenesen af ​​smerte knoglekræft. Selvom Qiu et al. [10] har observeret en forøget ekspression af Nav1.8 inden DRG i en rottemodel af smerte knoglekræft, har de ikke definitivt drage en konklusion om, hvorvidt den øgede Nav1.8 natriumkanalen bidrager til cancer-induceret knoglesmerte. I en anden undersøgelse Miao og kolleger [32] har rapporteret en signifikant nedregulering af Nav1.8 ekspression i DRG i en cancer rotte smerte model. Ikke desto mindre, ved hjælp af antisense-oligodeoxynukleotider (ODN’er) mod Nav1.8, fandt de, at knock-down af Nav1.8 udtryk i DRG-neuroner kunne afhjælpe etableret kræft smerte adfærd i tumor-bærende rotter, hvilket indebærer en mulig rolle Nav1.8 i udviklingen og vedligeholdelse af smerte knoglekræft. Inkonsekvent, har en nylig undersøgelse med betinget knock-out mus vist, at hverken Nav-1.7 eller Nav1.8 er nødvendig for kræft-induceret knoglesmerter [33]. I vores aktuelle undersøgelse præsenterer vi elektrofysiologiske og biokemiske beviser for, at tætheden af ​​Nav1.8-medieret natrium strøm øges væsentligt i de DRG neuroner i rotter med smerte knoglekræft, og at denne stigning er sandsynligvis på grund af en øget ekspression af funktionel NAV1 .8 natriumkanaler på cellemembranen i stedet for ændringer i iboende egenskaber eller totalt protein ekspression af kanalerne, fordi der sammen med den forøgede tæthed af både TTX-R- og Nav1.8-medierede natriumstrømme, ekspressionen af ​​membranprotein