PLoS ONE: Regulering af Mcl-1 ved SRSF1 og SRSF5 i Cancer Cells

Abstrakt

Up-regulering af apoptose-regulerende gen

Mcl-1 Hotel (myeloid celle leukæmi-1) optræder i forskellige typer kræft og er knyttet med resistens til behandlinger mod kræft. Det er velkendt, at Mcl-1 præ-mRNA gennemgår alternativ splejsning events at producere to funktionelt forskellige proteiner, Mcl-1

S (pro apoptotisk) og Mcl-l

L (anti-apoptotisk); sidstnævnte isoform er fremherskende i forskellige cancere, herunder bryst- og ovariecancerceller. I den foreliggende undersøgelse rapporterer vi, at RNA-bindende protein (RBP) og proto-onkogen SRSF1 (serin og arginin-rige splejsning faktor 1) påvirker splejsning af Mcl-1 i både MCF-7- og MDA-MB-231 brystcancerceller og JAR choriocarcinoma celler; viser vi også for første gang, at en anden RBP SRSF5 påvirker splejsning af Mcl-1 i MCF-7-celler. Desuden rapporterer vi, at SRSF1 er involveret i andre aspekter af Mcl-1 regulering med knockdown af SRSF1 ved RNAi, hvilket resulterede i et signifikant fald i Mcl-1 proteinniveauer i MCF-7-celler, men en stigning i JAR-celler, henholdsvis ved potentielt påvirker protein stabilitet og oversættelse af Mcl-l. De vigtigste resultater fra denne undersøgelse understreger vigtigheden af ​​den cellulære kontekst forskellige kræftceller for funktionen af ​​multifunktionelle RBP’er som SRSF1 og få konsekvenser for terapeutiske tilgange ansat til at målrette Mcl-1

Henvisning:. Gautrey HL, Tyson -Capper AJ (2012) Regulering af Mcl-1 ved SRSF1 og SRSF5 i kræftceller. PLoS ONE 7 (12): e51497. doi: 10,1371 /journal.pone.0051497

Redaktør: Justin L. Mott, University of Nebraska Medical Center, USA

Modtaget 4. juli, 2012; Accepteret: November 1, 2012; Udgivet: 17. december, 2012 |

Copyright: © 2012 Gautrey, Tyson-Capper. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af et tilskud fra JGW Patterson Foundation og supplerende finansiering fra Newcastle Healthcare Charity (RVI /NGH) og Newcastle upon Tyne Hospitaler NHS Charity (FH). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Apoptose eller programmeret celledød er en vigtig proces involveret i normal udvikling og vævshomeostase, og dets deregulering kan resultere i cancer. Et betydeligt antal af apoptose faktorer er blevet vist at være reguleret ved alternativ splejsning; dette omfatter Bcl-2-protein-familien, som styrer den intrinsiske (mitokondrie) celledød pathway [1], [2], figur 1A. Bcl-2-familien indeholder både pro-apoptotiske og anti-apoptotiske proteiner, og det er balancen mellem de to, som bestemmer, om vejen er aktiveret [3], [4]. Bcl-2-familien kan opdeles i tre grupper baseret på deres struktur og funktion. De anti-apoptotiske Bcl-2-proteiner indeholde flere Bcl-2-homologi (BH) domæner og så er strukturelt til Bcl-2, som også er et medlem af denne gruppe. De pro-apoptotiske Bcl-2-proteiner er opdelt i to undergrupper, den første gruppe er også strukturelt til Bcl-2 med flere BH domæner, og indbefatter proteinerne Bak og Bax. Den anden gruppe af pro-apoptotiske proteiner indeholder kun BH3-domænet. Apoptose udløses, når de pro-apoptotiske proteiner Bak og Bax forårsage mitokondriel ydre membran permeabilisering. De anti-apoptotiske Bcl-2-familiemedlemmer forhindre dette ved binding til de pro-apoptotiske proteiner Bax og Bak. BH3-only proteiner kan aktivere apoptose gennem to ruter først gennem direkte aktivering af Bak og Bax, og for det andet ved binding til anti-apoptotiske proteiner, hvilket tillader frigivelsen af ​​Bak og Bax.

Mcl-1 er en medlem af Bcl-2-familien af ​​apoptose regulatorer. Overekspression af Mcl-1 er blevet fundet i et bredt udvalg af cancervæv [5], [6], [7], samt cancercellelinier [8]. Desuden forøget ekspression af Mcl-1 er blevet associeret med dårlig prognose ved brystcancer [9]. MCL-1 synes også at være en vigtig faktor involveret i resistens mod kræftbehandlinger, og dets nedregulering har vist sig effektiv til at inducere apoptose [7], [10], [11], [12].

Mcl-1

genet indeholder tre exons og koder to proteiner, anti-apoptotiske Mcl-1

L og den pro-apoptotiske Mcl-1

S [13], [14]. Den fulde længde transkript indeholdende alle tre exoner koder Mcl-1

L, som indeholder BH1, 2, og 3 samt en TM-domæne. Dette resulterer i en anti-apoptotisk Bcl-2-protein, der produceres. MCL-1

S har det andet exon splejset ud, hvilket resulterer i en nedstrøms skift i læserammen så kun BH3-domænet resterende (figur 1B). MCL-1

S synes at udøve sin pro-apoptotisk virkning på lignende måde til andre BH3-only proteiner ved binding til anti-apoptotiske Bcl-2-proteiner, og mere specifikt MCL-1

S kun binder til MCL -1

L [13], [15].

en kontakt i alternativ splejsning af Mcl-1 har hidtil vist sig at forekomme i bryst- og ovariecancer, idet der er en stigning i anti-apoptotisk Mcl-1

L isoform i cancervæv [16]. På trods af dette, er meget lidt kendt om den mekanisme, der regulerer kontakten i splejsning eller splejsning faktor proteiner involveret i optagelse eller udelukkelse af den anden exon. Hidtil har kun to medlemmer af SR protein familien, SRSF1 og 3, er blevet identificeret som påvirker alternativ splejsning af Mcl-1 [17]. Med relevans for denne undersøgelse en række forskellige splejsningsfaktorer er blevet vist at have ændret ekspression i cancervæv [18]; disse omfatter SRSF1 [19] og SRSF3 [20], som opreguleres i en lang række af cancere og er blevet identificeret som proto-onkogener, og SRSF5 som overudtrykkes i bryst- cancer [21].

Formålet af det nuværende arbejde var at undersøge, hvordan Mcl-1 reguleres i kræftceller og identificere celle specifikke RNA bindende proteiner (RBP’er) involveret i at fremme inddragelsen af ​​den anden exon af

Mcl-1

gen. Dette blev opnået ved hjælp af gen-specifikke knockdown af en række forskellige RBP’er efterfulgt af måling af indholdet af de splejsede-specifikke isoformer.

Materialer og metoder

Cell Culture

To forskellige cancercellelinier blev oprindeligt udvalgt til denne undersøgelse (figur 2), brystcancer adenocarcinom MCF-7-celler (beskrevet som havende en lav invasion fænotype

in vitro

) og choriocarcinom JAR celler; anden brystcancer celle MDA-MB-231-celler (beskrevet som havende en invasiv fænotype

in vitro

) blev tilsat til undersøgelse til sammenligning (ATCC, LCG). MCF-7 og MDA-MB-231-celler blev holdt i DMEM (Sigma-Aldrich) indeholdende 10% føtalt kalveserum, L-glutamin og penicillin streptomycin. JAR-celler blev holdt i RPMI-1640 (ATCC, LCG) indeholdende 10% føtalt kalveserum og penicillin streptomycin. Cellerne blev inkuberet ved 37 ° C med 5% CO

2. Celler blev behandlet med 20 nM af rapamycin, 35 ug /ml cycloheximid eller 1 ug /ml proteaseinhibitor (Sigma-Aldrich) hvor det er angivet.

(A) Den iboende (mitochondrial) celledød pathway styres af Bcl-2-protein-familien, herunder BH3-only proteiner, anti-apoptotiske Bcl-2-proteiner, Bax, Bak og Bid. (B)

Mcl-1

gen består af tre exoner; den anti-apoptotiske Mcl-1

L og den pro-apoptotiske Mcl-1

S proteinisoformer skyldes inklusion og skipping af exon 2 (åben kasse), hhv.

Top panel viser MCL splejsningsisoformer i kommercielt tilgængeligt JAR cellelysat, MCF-7-celler og JAR-celler. Detektion ved western blotting af Mcl-1 splice varianter, SRSF1-6 og lastning kontrol GAPDH i 40 ug total cellelysat fra MCF-7 og JAR celler.

Gene knockdown af RNAi

Alle celler blev omvendt transficeret med Silencer® Select siRNA (Ambion, tabel 1),

Lyddæmper

® Negativ kontrol siRNA (Ambion),

Silencer

® Vælg GAPDH Positiv kontrol siRNA (Ambion ) og siPORT ™

NeoFX

™ Transfektion Agent (Ambion) ved følgende protokol optimeres i overensstemmelse med producentens instruktioner. 5.9 × 10

4 MCF-7-celler og 4 × 10

4 JAR-celler blev udpladet i hver brønd i en plade med 24. JAR-celler blev transficeret med 4 ul /ml og MCF-7 og MDA-MB-231 celler med 2 ul /ml siPORT ™

NeoFX

™ transfektion agent; alle celler blev transficeret med 6 nM siRNA. Celler og siRNA blev inkuberet sammen ved 37 ° C i en atmosfære af 5% CO

2. RNA blev opsamlet 48 og 72 timer efter transfektion og protein opsamlet 72 timer efter transfektion. I alle eksperimenter niveauer af knockdown af RNAi blev vurderet på RNA og protein niveau ved PCR og immunoblotting som beskrevet.

Western Immunoblotting

Celler blev vasket i iskold PBS og derefter opsamlet i RIPA-buffer (25 mM Tris-HCI, pH 7,6, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% natriumdeoxycholat og 0,1% SDS) for protein kvantificering efterfulgt af tilsætning af prøve-buffer og derefter varmedenatureret ved 95 ° C i 5 minutter. Proteinlysater blev separeret anvendelse af 12% SDS-polyacrylamidgelelektroforese (PAGE) geler og overført elektroforetisk på en nitrocellulosemembraner. Membraner blev blokeret i 1 time med PBS indeholdende 10% tørret mælkepulver, og probet med enten muse-anti-Mcl-1 (1:500, Santa Cruz), kanin-anti-GAPDH (1:1000, Santa Cruz), muse anti- SF2 /ASF (1:1000, SRSF1, Zymed), kanin anti-SC35 (1:100, SRSF2, Abgent), muse-anti-SRp20 (1:1000, SRSF3, Zymed), kanin anti-SRp75 (1:500, SRSF4, Abcam), gede anti-SRp40 (1:500, SRSF5, Zymed), kanin anti-SRp55 (1:2000, SRSF6, Aviva Systembiologi) natten over ved 4 ° C. Efter vask i PBS blev tilsat passende HRP-konjugerede sekundære antistoffer fortyndet i PBS. ECL eller Super Signal Femto ECL (Pierce) blev anvendt til proteinpåvisning. Hvor det er angivet, blev densitometrisk analyse udført under anvendelse af et UVP geldokumentation systemet og kvantificering udført ved anvendelse af ImageJ software. Dataene blev efterfølgende analyseret ved hjælp af en en-vejs ANOVA med Tukeys ‘multiple sammenligningstest.

RNA Isolation og Semi-kvantitativ RT-PCR

Total RNA blev ekstraheret med RNeasy spin-søjler (Qiagen) og behandlet med DNase I (Qiagen) følgende producentens anvisninger. Et pg af totalt RNA blev revers transskriberede anvendelse af oligo (dT) primere og Superscript II revers transkriptase (RT) (Invitrogen, Life Technologies). PCR’er blev udført med cDNA, specifikke primere (tabel 2) og PCR Master Mix (Promega). Primere til Mcl-1 blev designet til at være begge sider af exon 2, så de kunne detektere både Mcl-1

S og Mcl-1

L og skelne de to isoformer efter størrelse. (Figur 3A). Negative kontroller, som manglede RT under udarbejdelsen af ​​cDNA blev inkluderet for at overvåge genomisk forurening. CDNA blev separeret ved elektroforese på 1,5% (w /v) agarosegeler, visualiseret under UV efter ethidiumbromidfarvning.

MCF-7-celler blev transficeret med SRSF1-6, Tra2β, SREK1, GAPDH (G ) og en negativ kontrol (NC) siRNA’er, eller behandlet med vehikel (lipid) kun (V), eller forblev ubehandlede (UT). (A) Semi-kvantitativ RT-PCR viser både Mcl-1 splejsede varianter. (B) Delvis kvantitativ RT-PCR viser knockdown af RNA-bindende proteiner 48 timer efter transfektion med siRNA’er. (C) Semi-kvantitativ RT-PCR, der viser niveauer af MCL-1 splice isoformer (MCL-1

L og Mcl-1

S) og ladningskontrol GAPDH 72 timer efter transfektion med siRNA’er. (D) Mcl-1

L niveauer målt ved real-time PCR på den samme prøve vist i (B). (E) Mcl-1

S-niveauer målt ved real-time PCR på den samme prøve vist i (B). (F Mcl-1

S niveauer i prøven replikater målt ved real-time PCR (middelværdi (n = 3) ± SEM) ** P≤0.01;.. * P≤0.01

Real-Time PCR

Real-time PCR blev udført på cDNA under anvendelse fortegnelserne TaqMan® assays (Applied Biosystems) og TaqMan® Universal Master Mix II (Applied Biosystems). Taqman assays blev udvalgt som var specifikke for hver af splejsningsvarianter af Mcl-1 som prober blev designet til at spænde over exongrænser specifikke for hver splejsningsvariant (MCL-1

S – exon grænse 1-3, Mcl-1

L – exon grænse 1- 2), og Taqman GAPDH assay blev valgt som en endogen kontrol. assayet blev udført i quadruplet og PCR-amplifikation blev udført under anvendelse af OneStepPlus real-time PCR-system (Applied Biosystems). Alle forsøg blev udført i tre eksemplarer med mindst tre uafhængige forsøg.

miRNA Isolering og Real-time PCR

Totalt RNA blev ekstraheret med TRIzol®, udfældet med 100% ethanol og derefter oprenset på RNeasy spin-søjler (Qiagen) under anvendelse af kun buffer RPE. Totalt RNA blev elueret fra søjlerne med RNase-frit vand. Revers transkription blev udført på 10 ng af total RNA, ved anvendelse TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems), og sekvensen specifikke RT-primere fra TaqMan® Small RNA assays (Applied Biosystems) ifølge producentens instruktioner. Separate revers transkription-reaktioner blev udført for hver TaqMan® små RNA-analysen på hver RNA-prøve. Real-time PCR blev udført på cDNA under anvendelse fortegnelserne TaqMan® Small RNA assays og TaqMan® Universal Master Mix II (Applied Biosystems). Assayet blev udført tre gange, og PCR-amplifikation blev udført under anvendelse af OneStepPlus real-time PCR-system (Applied Biosystems).

Apoptose Assay

MCF-7 celler blev revers transficeret med siRNA i 96 brønd plader, og derefter inkuberet i 48 timer. MCF-7-celler blev derefter behandlet med topoisomeraseinhibitor Etoposid, som tidligere beskrevet [22]. Kort fortalt blev celler inkuberet med serum sult medier (1% FCS) i 18 timer efterfulgt af behandling med 200 uM Etoposid (Sigma Aldrich) i 6 timer [22]. Caspase-niveauer blev derefter målt under anvendelse af Caspase-Glo 3/7 assay (Promega) ifølge producentens instruktioner. Kort fortalt lige volumener af Caspase-Glo 3/7 reagens blev tilsat til brøndene og inkuberet ved stuetemperatur i 1 time og derefter luminescens blev målt på et luminometer (BMG).

Resultater Salg

Mcl -1 splejsningsisoformer og SR Proteiner i cellelinier

RBP’er involveret i kontrollen af ​​alternativ splejsning begivenhed i Mcl-1 blev undersøgt i både JAR og MCF-7-celler. Begrundelsen for at bruge disse to cellelinjer var baseret på den forudsætning, at de har forskellige udtryk profiler til Mcl-1

L og Mcl-1

S. JAR-celler producerer både Mcl-1

L og Mcl-1

S, hvorimod MCF-7-celler kun producere høje niveauer af Mcl-1

L (figur 2, øverste panel). Cellelysater fra de samme cellelinjer (figur 2), blev også vurderet for ekspression af et udvalg af RBP’er (SR proteiner, SRSF1-6), er kendt for at være involveret i splejsning valg af lokalitet og forventes at have formodede RNA-bindende steder inden exon 2 af

Mcl-1

gen (https://rulai.cshl.edu/cgi-bin/tools/ESE3/esefinder). Sammenligninger af ekspressionsniveauerne for disse SR proteiner i MCF-7 og JAR cellelinier viste kun små stigninger i SRSF2, 3 og 6 i MCF-7-celler. Selv om der er tilsvarende niveauer af udtryk, kan disse SR proteiner stadig være involveret i den alternative splejsning af Mcl-1, som aktiviteten af ​​SR proteiner styres af deres samlede nukleare koncentration og aktivering stater ud over deres samlede protein niveauer.

mRNA niveauer af MCL-1 splejsningsisoformer efter Knockdown af RNA-bindende proteiner

for at identificere RBP’er involveret i optagelse af den anden exon af Mcl-1, siRNA blev brugt til at knockdown kandidat proteiner i MCF -7 celler. Den RBP’er SRSF1, 2, 5, 6 og SR regulatorisk protein SREK1 (SFRS12) havde to forskellige siRNA, som målrettet deres sekvens mens SRSF3, 4 og Tra2β havde én siRNA. En vigtig overvejelse var at først kontrollere, at knockdown af individuelle SRSFs af RNAi påvirkede ikke udtryk for andre familiemedlemmer (Figur S1). Figur 3B viser knockdown af RBP’er i MCF7-celler 48 timer efter transfektion, og viser, at niveauer af mRNA for hver RBP blev reduceret med mindst én siRNA. En indledende screening af virkningen af ​​siRNA-medieret knockdown af både semi-kvantitativ PCR (figur 3C) og real-time PCR (figur 3D og 3E) viste, at efter 72 timer efter transfektion niveauer af Mcl-1

S øges, når celler blev udtømt for SRSF1 (1 og 2) og SRSF5 (1); en svag stigning i Mcl-1

S blev også observeret, når Tra2β niveauet blev nedsat med siRNA. Selv om den anden siRNA, der målrettet SRSF5 (2) ikke producere en tilsvarende stigning i Mcl-1

S, knockdown af SRSF5 var ikke så effektiv som med SRSF5 (1) siRNA. Niveauer af Mcl-1

L-RNA blev også målt (figur 3C og 3D), men som ekspressionsniveauerne af Mcl-1

L mRNA var så højt de små ændringer produceret af kontakten i splejsning blev ikke observeret i den samlede mRNA-ekspression. Efter den indledende skærm siRNA’er de knockdowns blev gentaget med SRSF1 (1 og 2) og SRSF5 (1) siRNA’er (n = 3), og figur 2F viser signifikant opregulering af Mcl-1

S mRNA 72 timer efter transfektion af disse siRNA’er ind i MCF-7-cellelinje.

for at vurdere hvilke RBP’er er involveret i denne alternativ splejsning begivenhed i JAR-celler, blev det samme panel af siRNAs anvendes til knockdown de RBP’er i disse celler. Figur 4A viser knockdown opnået med disse siRNAs i JAR-celler 48 timer efter transfektion. Kontakten i splejsning blev vurderet ved at måle mRNA niveauer af Mcl-1 ved semi-kvantitativ PCR (figur 4B) og real-time PCR (figur 4C og 4D) efter 72 timer. Resultaterne viser en stor stigning i niveauet af Mcl-1

S efter SRSF1 var blevet slået ned ved enten SRSF1 (1) eller SRSF1 (2). MCL-1

L niveauer blev også målt på skærmen, men ligesom MCF-7 celler ingen ændring blev observeret på grund af de høje niveauer af MCL-1

L mRNA til stede. For at validere resultaterne af den første skærm de knockdowns med SRSF1 (1 og 2) blev gentaget (n = 3) og viste en signifikant stigning i niveauerne af Mcl-1

S mRNA efter knockdown af SRSF1 (figur 4E).

JAR celler blev transficeret med SRSF1-6, Tra2β, SREK1, GAPDH (G) og Negativ kontrol (NC) siRNAs, eller behandlet med vehikel (lipid) kun (V), eller blev efterladt ubehandlet (UT) . (A) Semi-kvantitativ RT-PCR viser knockdown af RNA-bindende proteiner 48 timer efter transfektion med siRNA’er. (B) Delvis kvantitative RT-PCR viser niveauer af MCL-1 splice isoformer (MCL-1

L og Mcl-1

S) og ladningskontrol GAPDH 72 timer efter transfektion med siRNA’er. (C) Mcl-1

L niveauer målt ved real-time PCR på den samme prøve vist i (B). (D) Mcl-1

S-niveauer målt ved real-time PCR på den samme prøve vist i (B). (E) Mcl-1

S niveauer i prøven replikater målt ved real-time PCR (betyder (n = 3) ± SEM). * P≤0.01.

Protein Niveauer af MCL-1 splejsningsisoformer efter Knockdown af RNA-bindende proteiner

For at afgøre, om kontakten i splejsning observeret i mRNA blev oversat til proteiner, immunoblotting blev anvendt til at definere ekspressionsmønsteret for Mcl-1

L og Mcl-1

S i MCF-7 og JAR-celler. Det er værd at bemærke, at niveauet af Mcl-1

S og Mcl-1

L proteiner kan ikke visualiseres, for kvantificering formål, på samme eksponeringstid (figur S4) på ​​grund af de lave niveauer af endogen Mcl- 1

S. Knockdown af SRSF1 og SRSF5 i MCF-7 celler er vist i figur 5A, sammen med den resulterende produktion af små mængder af Mcl-1

S, replikerende bemærkningerne af Mcl-1

S-mRNA-niveauer (figur 3B og 3D). Protein niveauer af Mcl-1

L vises også efter knockdown. Niveauerne af Mcl-1

L efter behandling med SRSF5 siRNA ændrer ikke væsentligt fra den kontrol, hvilket er i overensstemmelse med mRNA niveauerne af Mcl-1

L efter SRSF5 knockdown (figur 3B og 3C). Interessant, blev niveauerne af Mcl-1

L væsentligt reduceret efter SRSF1 blev slået ned sammenlignet med kontrollerne i MCF-7 celler. Denne reduktion observeret i protein niveauer blev ikke observeret i Mcl-1

L mRNA (figur 3B og 3C), derfor reduktionen i SRSF1 kan påvirke oversættelsen eller stabilitet Mcl-1 samt den alternative splejsning begivenheden. Foreløbige data fra immunopræcipitationseksperimenter antyder SRSF1 kan binde til Mcl-1-mRNA i MCF-7 celler (Figur S3 og Methods S1); Denne observation er i overensstemmelse med tidligere dokumentation for, at SRSF1 protein: eksisterer Mcl-1 RNA-komplekser [17]

(A) MCF-7-celler blev transficeret med SRSF1 (1 og 2), SRSF5 (1 og 2. ), GAPDH (G) og en negativ kontrol (NC) siRNA’er, eller behandlet med vehikel (lipid) kun (V), eller var ubehandlede (UT). SRSF1, 5, blev Mcl-1 og GAPDH proteinniveauer bestemt ved immunoblotting 72 timer efter transfektion med siRNA’er, ved hjælp 30 ug total cellelysat. Histogrammer viser densitometrisk analyse af Mcl-1

L og Mcl-1

S proteinekspression. Data er vist som middelværdi ± SEM. ** Angiver P≤0.01; * Viser P 0,05. (B) JAR-celler blev transficeret med SRSF1 (1 og 2), GAPDH (G) og en negativ kontrol (NC) siRNA’er, eller behandlet med vehikel (lipid) kun (V), eller var ubehandlede (UT). SRSF1, Mcl-1 og GAPDH proteinniveauer blev bestemt ved immunblotting 72 timer efter transfektion med siRNA’er, ved anvendelse af 30 ug totalt cellelysat. (C) Efter transfektion med SRSF1 (1) og NC siRNA MCF-7 celler blev behandlet med 200 pM etoposid eller DMSO-kontrol i 6 timer. Induktion af apoptose blev vurderet ved at måle caspase3 /7-aktivitet * viser P .. 0,05

Figur 5B viser virkningen på proteinniveauer af Mcl-1 efter behandling med SRSF1 siRNA i JAR-celler. I overensstemmelse med mRNA resultater, reduktioner i SRSF1 niveauer resulterede i en stigning i proteinniveauet af Mcl-1

S. I modsætning hertil Mcl-1

L protein niveauer steg efter behandling med SRSF1 siRNA, mens de tilsvarende mRNA resultater ikke viser nogen ændring i niveauer efter knockdown (figur 4B og 4C). Følgelig, i modsætning til MCF-7-cellelinje, Mcl-1

L proteinniveauer øges som reaktion på SRSF1 siRNA snarere end at reducere, denne stigning ikke var statistisk signifikant (figur 4B). Disse resultater viser, at SRSF1 kan være involveret i andre aspekter af Mcl-1 regulering såsom translationel kontrol eller protein stabilitet i JAR celler. Protein niveauer af Mcl-1

L og Mcl-1

S blev også undersøgt efter knockdown med de andre RBP’er anvendt i RNA-skærmen i både MCF-7 og JAR celler, men ingen ændringer blev observeret (data ikke vist).

Vi næste undersøgt, om knockdown af SRSF1, hvilket resulterede i sådan en dramatisk ændring i Mcl-1

L og Mcl-1

s protein nøgletal i MCF-7 celler, kunne påvirke induktionen af ​​apoptose. Vi uropført en MTT assay for at udelukke muligheden for, at celledeling og cellernes levedygtighed kan påvirkes af knockdown af SRSF1 i MCF-7 celler (Figur S2 og metoder S2). Apoptose blev induceret i både den negative kontrol og SRSF1 (1) siRNA behandlede celler ved behandling med etoposid (200 uM), og måles ved at vurdere den resulterende caspase 3/7 aktivitet (figur 5C). Den procentvise stigning i caspase 3/7 aktivitet var lidt højere efter knockdown af SRSF1 viser en større induktion af apoptose.

Effekt af SRSF1 Knockdown om stabilitet og Oversættelse af Mcl-1

L

Mcl-1 indeholder flere rester i den N-terminale region, der kan undergå posttranslationel modifikation, såsom ubiquitinering og phosphorylering [23]. Disse ændringer kan påvirke stabiliteten af ​​MCL-1-proteinet. Derfor gik vi videre med en vurdering af stabiliteten af ​​Mcl-1 protein efter knockdown af SRSF1 i de to cellelinier. Cycloheximid behandling blev anvendt til at blokere proteintranslation og Mcl-1

L proteinniveauer blev vurderet i løbet af de følgende 7 timer. Figur 6A viser en meget lignende sats for tab af Mcl-1

L i MCF-7 celler efter behandling med SRSF1 siRNA sammenlignet med negativ kontrol siRNA. Dette tyder på, at der ikke er nogen ændring i stabiliteten af ​​Mcl-1

L efter knockdown af SRSF1 i MCF-7 celler. I modsætning hertil behandling af krukken celler med cycloheximid (figur 6B) i lidt langsommere tab af Mcl-1

l efter knockdown af SRSF1, hvilket indikerer, at der kan være en lille stigning i Mcl-1

L proteinstabilitet.

(A) MCF-7 og (B) JAR-celler blev transficeret med SRSF1 (1 og 2) og en negativ kontrol (NC) siRNA. Tre dage efter transfektion blev celler behandlet med 35 ug /ml cycloheximid og proteinprøver blev opsamlet efter 0, 0,5, 1, 1,5, 2, 3, 5 og 7 timer til vurdering af proteinstabilitet. MCL-1

L proteinniveauer blev derefter målt ved immunoblotting. (C) MCF-7-celler blev transficeret med SRSF1 (1 og 2), GAPDH (G) og negativ kontrol (NC) siRNA, eller behandlet med vehikel (lipid) kun (V), eller var ubehandlede (UT). 48 timer efter transfektion blev celler behandlet med 20 nM rapamycin i yderligere 24 timer. Western blotting blev derefter anvendt til at vurdere proteinniveauer af SRSF1, Mcl-1

L og GAPDH. (D) mir-29b-niveauer målt ved real-time PCR i krukken og MCF-7 cellelinier (middelværdi (n = 3) ± SEM), ** P≤0.01. Knockdown af SRSF1 i MCF-7-celler (E) og JAR-celler (F) blev bedømt ved semikvantitativ RT-PCR i SRSF1 (1) og negativ kontrol (NC) siRNA (øverste paneler). Niveauer af mir-29b blev målt ved real-time PCR i SRSF1 (1) og negativ kontrol (NC) siRNA behandlede MCF-7-celler fra (E) og JAR celler fra (F) langs med GAPDH (G) siRNA, køretøj ( lipid) kun (V), og ubehandlede (UT) celler (nederste paneler) (betyder (n = 3) ± SEM).

Da faldet i niveauerne af Mcl-1

L i MCF-7-celler efter SRSF1 knockdown synes ikke at være påvirker stabiliteten af ​​proteinet, kan det være en translationel effekt. SRSF1 er allerede blevet påvist at være involveret i mTOR translationsinitiering, hvor dens tilstedeværelse på RNA resulterer i øget rekruttering af mTOR kompleks til mRNA [24], [25], [26], [27], [28]. Derudover har Mcl-1 også vist sig at være translatorisk kontrolleret af mTOR og mTOR signalvejen [24], [25], [26], [27], [28]. For yderligere at undersøge dette, blev MCF-7-celler behandlet med mTOR inhibitor rapamycin. Figur 6C bekræfter reduktionen i Mcl-1

l efter behandling med rapamycin og viser denne reduktion i Mcl-1

L til at være af samme størrelsesorden som efter SRSF1 knockdown. Desuden har tilføjelsen af ​​rapamycin til SRSF1 Knockdown celler ikke medføre yderligere fald i niveauerne af Mcl-1

L.

En nylig rapport har også foreslået en anden mekanisme, som SRSF1 kan styre translation gennem behandling af miRNA [29]. En af miRNA identificeret som værende opreguleret efter overekspression af SRSF1 var mir-29b. Denne miRNA er allerede blevet vist at være involveret i den translationelle inhibering af Mcl-1 [30]. I lyset af denne hypotese vi stigningen observeret i Mcl-1

L protein niveauer i krukken celler kan til dels skyldes nedsatte niveauer af mir-29b. Da knockdown af SRSF1 i MCF-7 celler viste ikke en tilsvarende stigning i niveauerne af Mcl-1

L protein, men i virkeligheden et fald, ville vi ikke forvente, mir-29b at være involveret i reguleringen af ​​Mcl -1

L i MCF-7-celler. Som et resultat kan forventes de indledende niveauer af mir-29b at være højere i JAR-celler sammenlignet med MCF-7-celler. For at undersøge dette mir-29b blev målt i ubehandlet JAR og MCF-7-celler ved real-time PCR (figur 6D). Dette viste, mod forventning, at niveauerne af mir-29b var signifikant højere i MCF-7 celler i forhold til JAR celler. At vurdere, om knockdown af SRSF1 påvirket niveauerne af mir-29b, som over-ekspression er tidligere blevet vist at gøre dette [29], siRNA blev anvendt til knockdown SRSF1 i MCF-7 celler (figur 6E) og JAR-celler (figur 6F). Knockdown blev indledningsvis udføres i MCF-7 celler, idet de viste de højeste indledende niveauer i mir-29b (fig 6D). Selvom behandling med transfektionsreagens alene syntes at resultere i en reduktion i mir-29b i MCF-7 celler, knockdown af SRSF1 havde lille indvirkning på niveauerne af mir-29b i begge celletyper ved sammenligning med den negative kontrol siRNA transficerede celler ( Figur 6E og 6F).

Regulering af Mcl-1 ved SRSF1 og 5 blev også undersøgt i en anden brystcancercellelinje hjælp MDA-MB-231-celler, som er beskrevet som havende en invasiv fænotype

in vitro

. Endogene Mcl-1 proteinniveauer blev vurderet ved Western blotting (figur 7A), hvilket viser, at MDA-MB-231 celler udtrykker hovedsagelig MCL-1

L-protein isoform, men ved meget lavere niveauer end MCF-7-celler. For at bestemme, om de samme RBP’er er involveret i splejsning af Mcl-1 i MDA-MB-231-celler siRNA mod SRSF1 og 5 blev anvendt til at depletere celler af disse to proteiner. Figur 7B viser en reduktion i RNA-niveauer af SRSF1 og 5 efter 48 timer, og en efterfølgende stigning i niveauerne af Mcl-1

S mRNA efter 72 timer. Real time PCR-analyse af gentagne transfektioner også viste en signifikant opregulering af Mcl-1

S-mRNA 72 timer efter transfektion med både SRSF1 og 5 siRNAs. Proteinniveauer blev også målt ved immunoblotting efter knockdown af SRSF1 og 5. Figur 7C viser banke ned af SRSF1 og 5-proteiner 72 timer efter transfektion. På grund af de lave niveauer af Mcl-1

L og Mcl-1

S i MDA-MB-231-cellelinje Super Signal Femto ECL blev anvendt til at påvise de to isoformer, men dette kunne ikke vise nogen signifikant ændring i de to isoformer efter knockdown af SRSF1 eller 5, selv om der var et lille fald i Mcl-1 protein efter knockdown af både SR proteiner (Figur 7C). Da mTOR pathway ser ud til at være vigtige i reguleringen af ​​Mcl-1 i MCF-7-celler dette blev også undersøgt i MDA-MB-231-celler. Rapamycin blev anvendt til at inhibere mTOR pathway i denne cellelinie, men den dramatiske reduktion, der blev observeret i MCF-7 celler med rapamycin behandling og SRSF1 knockdown var ikke mindre indlysende med MDA-MB-231-celler.

(A) Detektion af Mcl-1 splejsningsvarianter og GADPH proteiner i MCF-7 og MDA-MB-231 under anvendelse af 40 ug af total cellelysat fra begge celletyper. Histogrammer viser densitometrisk analyse af Mcl-1

L og Mcl-1

S proteinekspression. Data er vist som middelværdi ± SEM. (B) Delvis kvantitativ RT-PCR viser knockdown af RNA-bindende proteiner 48 timer efter transfektion med siRNA’er. MDA-MB-231 celler blev transficeret med SRSF1, GAPDH (G) og negativ kontrol (NC) siRNAs, eller behandlet med vehikel (lipid) kun (V), eller blev efterladt ubehandlet (UT). Semikvantitativ RT-PCR, der viser niveauer af MCL-1 splice isoformer (MCL-1

L og Mcl-1

S) og ladningskontrol GAPDH 72 timer efter transfektion med siRNA’er. MCL-1

S niveauer i prøven replikater målt ved real-time PCR (betyder (n = 3) ± SEM).