PLoS ONE: Cytosoliske PhospholipaseA2 Hæmning med PLA-695 radiosensibiliserer tumorer i lungekræft Animal Modeller

Abstrakt

Lungekræft er stadig den hyppigste årsag til kræftdødsfald i USA og resten af ​​verden. Fremkomsten af ​​molekylært rettet terapier lover for forbedringer i terapeutisk effektivitet. Cytosolisk phospholipase A2 (CPLA ​​

2) er forbundet med tumorprogression og radioresistance i musetumormodeller. Udnytte den CPLA

2 specifik hæmmer PLA-695, bestemte vi, hvis cPLA2 hæmning radiosensibiliserer ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) celler og tumorer. Behandling med PLA-695 svækket strålingsinduceret stigninger i phospho-ERK og phospho-Akt i endotelceller. NSCLC celler (LLC og A549) co-dyrket med endotelceller (bEND3 og HUVEC) og forbehandlet med PLA-695 viste radiosensibilisering. PLA-695 i kombination med bestråling (IR) signifikant reduceret migration og proliferation i endotelceller (HUVEC bEND3) og induceret celledød og svækket invasion ved tumorceller (LLC A549). I en heterotopisk tumormodel, kombinationen af ​​PLA-695 og stråling forsinket vækst i både LLC og A549 tumorer. LLC og A549 tumorer behandlet med en kombination af PLA-695 og stråling de viste reduceret tumorvaskulatur. I en dorsal hudfold model af LLC tumorer, inhibering af CPLA

2 i kombination med strålebehandling førte til forøget destruktion af tumor blodkarrene. De anti-angiogene virkninger af PLA-695 og dens forøgelse af effekten af ​​strålebehandling i musemodeller af NSCLC antyder, at kliniske forsøg for sin evne til at forbedre strålebehandling resultater er berettiget

Henvisning:. Thotala D, Craft JM, Ferraro DJ, Kotipatruni RP, Bhave SR, Jaboin JJ, et al. (2013) Cytosoliske PhospholipaseA2 Hæmning med PLA-695 radiosensibiliserer tumorer i lungekræft dyremodeller. PLoS ONE 8 (7): e69688. doi: 10,1371 /journal.pone.0069688

Redaktør: Eric Deutsch, Institut Gustave Roussy, Frankrig

Modtaget 31. oktober, 2012; Accepteret: 14 Juni 2013; Publiceret: 19 jul 2013

Copyright: © 2013 Thotala et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. NIH tilskud R01-CA12575706 og R01-CA14022002, Startup midler til Thotala fra Institut for Strålebeskyttelse Oncology, Siteman Cancer Research Fund fra Washington University i St. Louis og Grant fra Pfizer Inc. finansieringskilderne havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. PLA-695 blev opnået fra Pfizer Inc. under Pfizer-Washington University biomedicinsk aftale. Som pr Pfizer-Washington University biomedicinsk aftale manuskriptet blev forelagt Pfizer Inc. og ryddet til offentliggørelse. Hverken forfatterne eller nogen af ​​deres familiemedlemmer har nogen økonomiske eller ikke-finansielle konkurrerende interesser med PLA-695 eller Pfizer Inc. Forfatterne også bekræfte, at dette ikke ændrer og klæber til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Lungekræft er en førende årsag til kræft død i USA. The American Cancer Society skøn i 2012 viser, at der var over 225.000 nye tilfælde og over 160.000 dødsfald som følge af lungekræft i USA [1]. Strålebehandling (RT) er fortsat en integreret del af lungekræft forvaltning [2]. I det seneste årti har der været væsentlige forbedringer i stråling behandlingsresultater tilskrives fremskridt i klinisk, fysik og biologi forskning [3]. Trods disse forbedringer i behandlingsregimer, lokalt recidiv af lungecancer er stadig et vedvarende problem [4]. De fleste patienter med inoperabel ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) har en dårlig prognose med median overlevelse på ca. 18 måneder, på trods af aggressiv terapi [5], [6]. Således er der et presserende behov for at udvikle mere effektive metoder til behandling af NSCLC.

Ioniserende stråling (IR) ikke kun skader nukleare DNA, men aktiverer også en række signalering kaskader i cellen [7], [8]. Phospholipase A2 (PLA

2, katalyserer hydrolysen af ​​membranphospholipider i sn-2-positionen for at frigøre lipid second messengers [9]. Ioniserende stråling aktiverer cytosolisk phospholipase A2 (CPLA ​​

2) i endotelceller [10]. efter aktivering CPLA

2 spalter palmitinsyre til dannelse phosphatidylcholin (PC) [11], [12], [13], [14], som derefter fører til produktion af lysophosphatidylcholin (LPC), lysophosphatidsyre (LPA), prostaglandin E

2 (PGE2) og arachidonsyre [15], [16], [17], [18]. arachidonsyre og LPA spiller vigtig rolle i invasionen og signaler i løbet af kræft progression [14], [19], [ ,,,0],20], [21]. aktiveringen af ​​CPLA

2 stimulerer proliferation af endotelceller og fremmer dannelsen af ​​vaskulære net [16], [17]. LPC udløser nedstrøms aktivering af phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) /Akt og mitogenaktiveret proteinkinase (MAP) /ekstracellulært signal reguleret kinase (ERK), som. resulterer i forøget cellelevedygtighed af endotelet i tumormikromiljøet [16], [17], [22]. Aktivering af CPLA

2 i tumormikromiljøet fører til øget vaskulatur og forbedret tumorogenesis fører til radioresistance af tumoren og aftagende effektiviteten af ​​strålebehandling [23], [24]. Kombination af bestråling med hæmning af CPLA

2 i prækliniske lungekræft tumormodeller har vist sig at undertrykte tumorvækst og reduceret angiogenese [25], [26].

Tidligere undersøgelser har brugt CPLA

2 hæmmere uegnede til oversættelse til klinikken på grund af deres giftighed [17]. Vi undersøgte virkningerne af PLA-695, en CPLA

2-inhibitor, der allerede er afprøvet i kliniske forsøg. Fase I studiet (NCT00366262) evaluere sikkerheden af ​​PLA-695 sammenlignet med placebo og naproxen er afsluttet (klinisk trials.gov). Senere, det kliniske fase II studie (NCT00396955) sammenlignet 4 dosisregimer PLA-695, naproxen, og placebo hos forsøgspersoner med slidgigt i knæet (klinisk trials.gov). Den foreliggende undersøgelse bestemmes effektiviteten af ​​PLA-695 i kombination med bestråling til behandling af musemodeller for lungekræft.

Vi fandt, at PLA-695 inhiberer strålingsinduceret phosphorylering af ERK og Akt i dyrkede endotelceller. PLA-695 i kombination med bestråling forhindret endothelcellemigration. PLA-695 forbedret stråling celledød og svækket invasion af lunge kræftceller. PLA-695 hæmmede dannelsen af ​​nye blodkar og angiogenese [26]. Desuden PLA-695 forstærkede virkningen af ​​stråling i to musemodeller for lungekræft.

Metoder Salg

Celledyrkning og behandling

primær kultur af humane navlestrengsveneendotelceller (HUVEC’er) puljet fra flere donorer blev opnået fra Cambrex (East Rutherford, NJ, USA) og opretholdt i komplet EBM-2 medium (Cambrex). Celler fra passager 2-5 blev anvendt i denne undersøgelse. HUVEC’er blev udsultet i 1 time før behandling i additiv-fri EBM-2 medium. 3B11 mikrovaskulære celler blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA) og opretholdt i DMEM med 5% føtalt bovint serum (FBS). Celler fra passager 3-6 blev anvendt i denne undersøgelse. 3B11s blev sultet i DMEM + 1% FBS i 3 timer før alle undersøgelser. PLA-695 blev opnået fra Pfizer Inc. under Pfizer-WU biomedicinsk aftale. Til bestråling af celler, Therapax X-ray maskine 250 (Pantak Inc., East Haven, CT, USA) leverer 2,04 Gy /min ved 250 kVp blev brugt. På grund af høj følsomhed HUVEC’er til temperatur og pH blev celler holdt i en inkubator ved siden af ​​strålerøret før og efter behandling. I forsøg med PLA-695, blev celler behandlet i 45 minutter før IR (3 Gy) med enten dimethylsulfoxid (DMSO, vehikelkontrol) eller varierende koncentration af lægemiddel i DMSO (10-600 nM).

Co -kultur Klonogen Survival Assay

HUVEC (1,0 x 10

6) og bEnd.3 celler (1,0 x 10

6) blev udpladet i 100 mm plader, og efter 24 timer, A549 (2 × 10

6) og LLC (2 × 10

6) celler blev udpladet på transwell inserts (Corning Inc., Corning, NY). Efter co-dyrkning i 24 timer blev celler behandlet med 300 nM af PLA-695 eller vehikelkontrol DMSO i 45 minutter før IR med 0, 2, 4, 6 eller 8 Gy. Efter behandlingerne som co-kultur med enten PLA-695 eller DMSO beregnede antal LLC og A549 celler blev udstrøget at aktivere normalisering for plating effektivitetsgevinster. Klonogene assays blev ligeledes udført med LLC og AF549 alene. Faste numre af celler blev udpladet for at muliggøre normalisering for plating effektiviteter. Celler lodes binde i 5 timer og derefter behandlet med 300 nM af PLA-695 eller vehikelkontrol DMSO i 45 minutter før IR med 0, 2, 4, 6 eller 8 Gy. Efter 7-10 dages inkubation pladerne blev fikseret med 70% EtOH og farvet med 1% methylenblåt. Kolonier bestående af 50 celler blev talt ved at se pladerne under et mikroskop. De overlevelse fraktioner blev beregnet som (antal kolonier /antal celler belagt) /(antal kolonier til tilsvarende kontrol /antal celler belagte).

Kolorimetrisk celleproliferationsassay

Cell spredning var bestemt under anvendelse af celle titer 96 Vandig Ikke-radioaktivt celleproliferationsassay reagens (Promega). Analysen blev udført ved at følge producentens protokol. Kort fortalt blev cellerne behandlet med enten DMSO kontrol eller 300 nM PLA-695 i 45 minutter og bestrålet med 3 Gy. Mediet blev skiftet efter 1 time, og pladerne blev inkuberet i 96 timer. Cellelevedygtighed blev målt kolorimetrisk efter 96 timer ved måling af absorbans ved 490 nm. Eksperimenter blev udført tre gange og standardfejl blev beregnet.

Morfologisk Analyse af celler farvet med DAPI

LLC og A549-celler blev dyrket i kammerskiver og behandlet med enten DMSO eller 300 nM PLA-695 i 45 minutter og derefter bestrålet med 3 Gy. Ved 96 timer efter bestråling blev cellerne fikseret i 4 paraformaldehyd og derefter farvet med 2,5 μgml 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) i phosphatbufret saltvand. Der blev taget mikrofotografier anvendelse af et Olympus BX60 fluorescensmikroskop udstyret med digitalkamera. Flerkernede celler og celler indeholdende giant kerner blev talt i flere tilfældigt valgte felter. Den gennemsnitlige procentdel af sådanne celler i forhold til samtlige celle nummer blev beregnet ud fra tre eksperimenter.

Tumor Transwell Invasion Assay

Tumoren Transwell Matrigel Invasion Assay blev brugt til at overvåge tumor-endotel interaktioner og celle migration. Dette assay anvender et forenklet Boyden kammer-lignende design, som består af to kamre adskilt af et filter overtrukket med Matrigel. A549 (1,0 x 10

6 celler /brønd) eller LLC (0,6 × 10

6 celler /brønd) blev suspenderet i serumfrit medium og tilsat til toppen af ​​plader med 24 brønde med 8 um basalmembran Matrix- overtrukket polycarbonatmembran indsatser (Bedford, MA, USA). 500 ul frisk medium blev tilsat til den nederste kammer som kemo-tiltrækningsstof. For strålingssensibilisering undersøgelser blev begge kamre derefter behandlet med vehikel DMSO eller 300 nM PLA-695 i 45 minutter før IR med 4 Gy. Celler migrerede fra toppen kammer gennem de overtrukne filterporer til bunden af ​​filteret. Efter 24 timer blev tilbageværende celler i det øverste kammer af membranen inserter fjernes med en våd vatpind. De celler, der klæbede på den ydre overflade af transwell insert membran, som havde invaderet gennem Matrigel blev fikseret med 100% methanol og farvet. Celler, som havde invaderet i 7-10 højstyrkefelt (HPF) fra hver prøve blev talt under anvendelse Billede J Software (NIH, Bethesda, MD), og det gennemsnitlige antal af celler, som invaderede gennem membranen pr HPF blev beregnet. Mean og standardafvigelse for hver behandlingsgruppe blev beregnet for hver gruppe.

signaltransduktionsbanen Analyse

Efter behandling blev HUVEC’er celler høstet på de angivne tidspunkter. Totalt protein ekstraktion blev udført med M-PER-reagens (Pierce, Rockford, IL, USA) indeholdende proteaseinhibitorer og phosphataseinhibitorer II og III (Sigma, MO). Proteinkoncentration blev kvantificeret under anvendelse af BCA-reagens (Pierce). Proteinekstrakter (40 ug) blev underkastet western immunoblotanalyse under anvendelse af antistoffer til påvisning af phospho-Akt (Thr308 /Ser473), phospho-ERK1 /2, (Thr202 /Tyr204), total Akt, og total ERK1 /2 (alle fra cellesignalering Technologies.

Danvers, MA, USA). Antistof til actin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) blev anvendt til at evaluere proteinbelastning i hver bane. Immunoblots blev udviklet ved anvendelse af Western Lightning Kemiluminescens Plus detektionssystem (PerkinElmer, Wellesley, MA, USA) ifølge producentens protokol

Cell Migration

HUVEC og bEND3 celler blev dyrket til 70%. – 80% konfluens i 60 mm plader. Tre parallelle sår blev skabt på hver plade ved at ridse cellemonolaget med en 200-pi pipettespids, og grænserne for sårene blev markeret. Cellerne blev behandlet i 1 time med vehikel (DMSO) eller 300 nM PLA-695, efterfulgt af 3 Gy IR. Efter 24 timer blev cellerne fotograferet, og celler fundet i og uden for de viklede grænser blev talt fra seks HPFS per prøve. Celler, der strakte grænserne blev klassificeret som ikke-migrerede celler. Celletæthed i såret er præsenteret som en procentdel af den samlede celletæthed i pladen. Resultaterne er fra tredobbelte prøver i tre uafhængige scratch analyser.

tumorvækstforsinkelse

Den institutionelle Animal Care og brug Udvalg for Washington University i St. Louis specifikt godkendt denne undersøgelse. LLC (10

6) eller A549 (10

6) celler blev implanteret i den højre trædepude C57 /BL6-mus. Når alle tumorer blev måles ved plethysomography, som bestemt af mængden af ​​tumor-bærende trædepuden minus volumen af ​​kontralaterale trædepude, musene var Serpentine sorterede i grupper på seks til syv dyr, der repræsenterer tilsvarende fordelinger af tumor størrelser (område = 40-70 mm

3). Tumorbærende mus blev injiceret intraperitonealt med vehikel (DMSO) eller PLA-695 ved 7,5 mg pr kg legemsvægt en gang dagligt i fem på hinanden følgende dage. Tredive minutter efter indsprøjtningssystemer mus blev bedøvet med isofluran og placeret i Pantak strålerøret og bestrålet med 2 Gy dagligt i fem på hinanden følgende dage til i alt 10 Gy. Bly blokke (10 mm tyk) blev anvendt til at beskytte hovedet, thorax og abdomen. Tumorstørrelse blev overvåget på langs med plethysmografi. Mus blev aflivet af CO

2 kvælning gang tumorer nået et volumen på ca. 700 mm

3 eller når sårdannelse blev klart på trædepuden pr Animal Care retningslinjer.

In vivo angiogenese Assay Dorsal Skin-fold Chamber model

implantationsteknik af den dorsale hud-fold kammer model er blevet beskrevet tidligere [27]. Kort fortalt diffusionskamre indeholder LLC celler (1 x 10

6 celler pr kammer) blev indsat i den dorsale luften sac lavet ved at lave en overfladisk snit vandret langs kanten af ​​dorsale luft sac. Huden blev omhyggeligt syet efter at placere kamrene under mus huden. Musene behandlinger blev udført 5 til 7 dage efter kirurgisk indsættelse af diffusionskamrene. Huden fold dækker kamrene blev forsigtigt fjernet efter aflivning af musene og fotograferet under synligt lys. Antallet af tumor induceret blodkar blev talt i ti forskellige områder inden i kammeret på området luftsækken fascia.

Histologisk analyse af tumorvaskulatur

tumorbærende mus blev aflivet 24 timer efter den endelige behandling, og tumorerne resektion, fikseret i formalin, indlejret i paraffin og sektioneret. Sektioner (5 um tykke) blev behandlet med 20 ug /ml proteinase K i 30 minutter ved stuetemperatur og blev derefter inkuberet natten over med et polyklonalt antistof mod human von Willebrand faktor (vWF) (1:100 fortynding Dako, Carpinteria, CA ). Vævssnit blev efterfølgende inkuberet med Alexa Fluor 488-konjugeret gede anti-kanin IgG (1:500 fortynding Invitrogen Molecular Probes) i 1 time ved stuetemperatur. Alexa Fluor 488-farvede skibe blev talt i tre tilfældigt udvalgte HPFS på hver af tre sektioner pr tumor. Vaskularisering blev bestemt som det gennemsnitlige antal farvede fartøjer pr HPF. Tumorvaskulære tværsnitsareal blev bestemt på lignende måde, under anvendelse af NIH Image J software, ved hvilken et område afgrænset af fartøjer blev divideret med det samlede areal af HPF at bestemme procent vaskulære område.

Statistical Analysis

middelværdien og standardfejlen af ​​middelværdien (SEM) for hver behandlingsgruppe blev beregnet for alle forsøg. Antallet af prøver er angivet i beskrivelsen af ​​hvert eksperiment. Studerende T-test var brug for at sammenligne to behandlingsgrupper. Variansanalyse (ANOVA) blev anvendt til at sammenligne behandling effektivitet i tumorvækstforsinkelse undersøgelser. En

p-

værdi. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Effekt af PLA-695 om Pro-overlevelse Signalering efter Stråling

aktivering af ERK og Akt sker hurtigt efter strålebehandling i HUVEC-celler (fig. 1). Behandling med PLA-695 dæmper IR inducerede ERK phosphorylering på en dosis-afhængig måde (Fig. 1 A). ERK-aktivering er reduceret til baseline (sham-behandlede celler) ved 300 nM af PLA-695. Ved højere koncentrationer, (600 NM), niveauerne af ERK fosforylering falder under baseline niveauer. IR inducerede Akt-phosphorylering blev også ophæves, når HUVEC-celler blev behandlet med 300 nM af PLA-695 (fig. 1 B). Vi fandt lignende resultater i 3B11 celler behandlet med 300 nM PLA-695 (fig. 1 C og D).

HUVEC-celler (A) blev behandlet med forskellige koncentrationer af PLA-695 som angivet i 45 min før behandling med 3 Gy blev celler lyseret 5 min efter IR. HUVEC (B) og 3B11 (C 0,001, 6 Gy P 0,001, 8 Gy P = 0,012) og A549-celler (2 Gy P = 0,163, 4 Gy P 0.001, 6 Gy P 0.001, 8 Gy P = 0,031) sammenlignet med celler behandlet med stråling alene (figur 2B).. Dosisforstærkning faktorer blev beregnet til 10% celleoverlevelse ved at dividere dosis af stråling fra den strålingshærdelige kun overlevelse kurve med den tilsvarende dosis fra PLA-695 plus stråling kurve. De dosisforstærkning faktorer var 1,17 for LLC-celler, 1,28 for A549-celler (fig. 2B).

LLC og A549-celler blev dyrket uafhængigt (A) eller som co-kulturer (B) med bEND3 og HUVEC-celler og blev behandlet med DMSO eller 300 nM PLA-695 i serumfrit medium i 45 minutter forud for IR. Cellerne blev derefter bestrålet med 0, 2, 4, 6 og 8 Gy og udpladet for klonogene overlevelse assay. Efter 7-10 dage blev celler farvet med 1% methylenblåt og kolonier, der består af 50 celler blev talt ved mikroskopi. Overlevende kolonier var normaliseret for udpladningseffektivitet. Vist er gennemsnitlige overlevelse fraktioner og SEM.

PLA-695 Reducerer spredning i Endotheliale og Lung Cancer Cells efter bestråling

For at belyse den rolle CPLA

2 i både endotel celler og lunge kræftceller, vi undersøgt, hvordan PLA-695 påvirker spredning i LLC, A549, bEND3 og HUVEC-celler (fig. 3A). Lige mange LLC, A549, bEND3 og HUVEC-celler blev udpladet i en plade med 96 brønde. Den følgende dag blev celler behandlet med 300 nM af PLA-695 i 45 minutter forud for IR. Pladerne blev aflæst ved 24, 48, 72, eller 96 h under anvendelse af det kolorimetriske celleproliferationsassay ved måling af absorbansen ved 490 nm. bEND3 celler behandlet med PLA-695 alene viste en signifikant reduktion i celleproliferation sammenlignet med DMSO ved 24 timer (P 0,001), 48 h (P = 0,002) og 96 h (P 0,001) og efter 72 timer (P = 0,047). bEND3 celler behandlet med kombinationsbehandling af PLA-695 med IR viste en signifikant reduktion i celleproliferation sammenlignet med IR alene efter 72 timer (P = 0,001) og 96 h (P = 0,002) og reduceret proliferation ved 24 timer (P = 1,0) og 48 h (P = 0,023). HUVEC-celler behandlet med PLA-695 alene viste en signifikant reduktion i celleproliferation sammenlignet med DMSO ved 24 timer (P = 0,003), 48 h (P = 0,016), 72 timer (P = 0,013) og 96 h (P 0,001). HUVEC-celler behandlet med kombinationsbehandling af PLA-695 med IR viste en signifikant reduktion i celleproliferation sammenlignet med IR alene ved 24 h (P = 0,004) 72 h (P = 0,002) og 96 h (P 0,001). LLC-celler behandlet med PLA-695 alene viste reduktion i celleproliferation sammenlignet med DMSO ved 24 timer (P = 0,076), 48 h (P = 0,017), 72 h (P = 0,028) og 96 h (P = 0,175). LLC-celler behandlet med kombinationsbehandling af PLA-695 med IR viste en signifikant reduktion i celleproliferation sammenlignet med IR alene ved 24 h (P = 0,001), 48 h (P = 0,010), 72 timer (P 0,001) og 96 h (P 0,001). A549-celler behandlet med PLA-695 alene viste en reduktion i celleproliferation sammenlignet med DMSO ved 24 timer (P = 0,017), 48 h (P = 0,008), 72 h (P = 0,070) og 96 h (P = 0,079). A549-celler behandlet med en kombinationsbehandling af PLA-695 med IR viste signifikant reduktion i celleproliferation sammenlignet med IR alene efter 72 timer (P = 0,003) og 96 h (P = 0,003).

Lige antal bEND3 , HUVEC, LLC og A549-celler blev udpladet i plader med 96 brønde og behandlet med 300 nM PLA-695 i 45 minutter før behandling med 3 Gy. Celleproliferation blev bestemt ved anvendelse af en kolorimetrisk celleproliferationsassay ved 24, 48, 72 og 96 timer efter behandling. Vist er absorbansen ved 490 nm. B. PLA-695 forbedrer celledød i bestrålede lunge kræftceller. LLC og A549-celler blev behandlet med 300 nM PLA-695 eller DMSO i 45 minutter før behandling med 3 Gy. Celler blev farvet med Annexin V-APC og propidiumiodid og analyseret ved flowcytometri ved 24, 48, 72 eller 96 timer efter bestråling. Vist er den linje grafer indikerer dobling af celledød i løbet af kontrol for hver behandling med SEM fra tre eksperimenter.

PLA-695 Forbedrer celledød i bestrålede Lung Cancer Cells

CPLA

2 er blevet vist at aktivere signalering gennem Ras /Raf /ERK pathway [10], [28]. Aktivering af phospholipase A2 er også blevet indikeret at være årsag til forsinket celledød induceret af H

2O

2 [29]. Vi studerede celledød i LLC og A549 ved farvning for Annexin V og PI ved anvendelse af flowcytometri ved 24, 48, 72 og 96 timer efter IR (fig. 3B). PLA-695 behandling af LLC-celler ikke inducerede nogen signifikant celledød på alle de testede tidspunkter. A549 celler behandlet med PLA-695 viste en svag stigning i celledød med tiden. IR alene inducerede et niveau af celledød i både LLC og A549-celler, der var ens ved alle de testede tidspunkter (24, 48, 72 og 96 h). Kombineret behandling med PLA-695 og IR inducerede ikke forøget celledød i forhold til IR alene på 24 timer i begge LLC celler (P = 0,831) og A549 celler (P = 0,192). Efter 48 timer viste den kombinerede behandling beskedne celledød i LLC-celler (P = 0,100) og betydelig celledød i A549-celler (P 0,001). På 72 timer og 96 timer, viste den kombinerede behandling betydelig celledød i begge LLC celler (P 0,001) og A549-celler (P 0,001).

Vi næste evaluerede nukleare morfologi af bestrålede celler ved hjælp DAPI-farvning (fig. 4); resultaterne var svarende til den vurdering udført af Annexin V /propidiumiodid-farvning. Ved 96 timer efter bestråling, den kombinerede behandling med PLA-695 og IR resulterede i betydeligt mere multinucleate celler og celler med forstørrede kerner (karakteristiske for mitotisk katastrofe) i begge LLC-celler og A549-celler (P 0,006), i sammenligning med IR alene ( LLC, P = 0,001; A549, P = 0,006) og PLA695 alene (LLC, P = 0,001;. A549, P = 0,002)

LLC og A549-celler blev dyrket i kammerskiver blev behandlet med 300 nM PLA -695 eller DMSO i 45 minutter før bestråling med 3 Gy. Celler blev fikseret 96 timer senere og farvet med 4 ‘, 6-diamidino-2-phenyllindole (DAPI). Vist er de mikrografier af DAPI farvede celler, pile angiver multinucleate celler og kæmpeceller. Flerkernede og kæmpeceller blev talt i fem tilfældigt valgte felter. En søjlediagram, som viser den gennemsnitlige procent af multinucleate /kæmpeceller for hver behandling er vist.

PLA-695 Reducerer endotelcellemigration efter Radiation

Vi udførte flænge lukning assays med HUVEC og bEND3 celler for at bestemme virkningen af ​​PLA-695 (fig. 5). I dette assay blev et sår skabt i cellekultur (grundlinje) og celler blev behandlet med vehikel (DMSO), køretøjet og 3 Gy (DMSO + IR), PLA-695 (300 nM), eller en kombination af PLA-695 og 3 Gy (PLA-695 + IR). Cellemigrering beregnet ved at tælle antallet af celler, der flytter ind i såret (fig. 5). Vi fandt, at 24 timer efter behandling, den flænge blev næsten fuldstændig dækket i HUVEC og bEND3 kulturer behandlet med DMSO. Bestråling alene førte til en reduktion i migration i HUVEC (82%) og bEND3 (77%) celler. Tilsvarende reduktion blev observeret i celler behandlet med PLA-695 alene i både HUVEC (74%) og bEND3 (62%). Kombinationen af ​​PLA-695 og IR førte til en signifikant reduktion i migrationen af ​​HUVEC (61%, P = 0,003) og bEND3 (48%, P = 0,012) celler i sammenligning med IR alene (figur 5).

HUVEC og bEND3 celler blev udpladet på 60 mm plader og fik lov at vokse til 80% konfluens. Den semi-konfluent cellelag blev skrabet ved anvendelse af en 200 pi steril pipettespids for at skabe en ridse /sår blottet for celler. De resterende celler blev behandlet med vehikelkontrol eller 300 nM PLA-695 i 45 minutter forud for IR med 3 Gy. Migration blev vurderet ved 24 timer efter behandling. Antallet af celler migreret i bunden /sår blev talt og normaliseret til omgivende celletæthed pr HPF. Vist er repræsentative mikrofotografier og søjlediagrammer, der repræsenterer de gennemsnitlige procentdele af migrerende celler i forhold til tilsvarende kontrol med SEM fra tre eksperimenter.

PLA-695 Reducerer Tumor Cell Invasion efter Radiation

CPLA

2 er blevet impliceret i celle migration, tubulusdannelse [26] og invasion [30]. Vi undersøgte virkningen af ​​PLA-695 på tumorcelleinvasion i LLC og A549 cellelinjer under anvendelse Transwell-invasion assays. I LLC, observerede vi et fald i celleinvasion 24%, når cellerne blev bestrålet med 4 Gy; imidlertid forbehandling med 300 nM PLA-695 før IR resulterede i en 56% yderligere reduktion i celleinvasion (P = 0,003, Fig. 6). Behandling af LLC celler med PLA-695 alene viste en reduktion 63% i invasionen i forhold til kontrol. Ligeledes i A549-celler, stråling alene forårsagede en reduktion i invasionen 30%, mens forbehandling med 300 nM PLA-695 før IR reduceret invasion yderligere med 37% (P 0,001;. Figur 6) .Treatment af A549-celler med PLA-695 alene gav en reduktion i invasionen 58% sammenlignet med kontrol.

LLC og A549-celler blev tilsat til 8 mikron skær og blev behandlet med 300 nM PLA-695 eller DMSO i 45 minutter før 3 Gy bestråling. Cellerne fik lov at invadere /migrere fra toppen kammer gennem de overtrukne filterporer til det komplette medium i bunden af ​​indsatserne i 48 time. Celler blev derefter fikseret, farvet og celler, der invaderede gennem membranen blev beregnet ved at tælle antallet af celler pr HPF. Vist er repræsentative mikrofotografier og et søjlediagram, der repræsenterer antallet af invasive celler med SEM; * P . 0,05

PLA-695 radiosensibiliserer tumorer i dyremodeller af NSCLC

For at fastlægge effekten af ​​PLA-695 som en radiosesitizer i NSCLC, vi brugte heterotopisk LLC og A549 tumormodeller dyrket i C57 og nøgne mus hhv. Når LLC og A549-tumorer var palpable (område = 40-70 mm

3), blev musene behandlet i fem på hinanden følgende dage med DMSO (vehikel), bestråling (IR) alene (10 Gy total, 5 fraktioner på 2 Gy ), PLA-695 alene (7,5 mg /kg /dag, intraperitoneal), eller en kombination af PLA-695 og IR. Efterfølgende tumorvækst blev monitoreret under anvendelse af et plethysmometer. Vi analyserede tumorvækstforsinkelse i disse eksperimenter på to måder. Først til tidspunktet for tumorvolumen når en størrelse på 0,25 cm

3 blev bestemt. For det andet, vi analyserede tumor volumen på dag 7 til LLC tumorer og dag 15 til A549 tumorer (Fig. 7). LLC-tumorer vokser meget hurtigere end A549 tumorer. Ubehandlede tumorer og IR behandlede tumorer tog 7 dage at nå en tumor volumen på 0,25 cm

3, mens PLA-695 behandlede tumorer tog 7,5 dage. Tumorer behandlet med en kombination af PLA-695 og IR tog 9,5 dage at nå et volumen på 0,25 cm

3. På dag 7 tumorerne behandlet med en kombination af PLA-695 og IR var mindre (0,13 cm

3) sammenlignet med ubehandlet (0,27 cm

3; P = 0,019), IR alene (0,24 cm

3 ; P = 0,038) og PLA-695 alene (0,22 cm

3; P = 0,100)

LLC eller A549-celler blev implanteret i den højre trædepude af C57 /BL6-mus.. Tumorer blev bestrålet med 2 Gy 5 dage i træk for i alt 10 Gy. Mus blev behandlet med 7,5 mg /kg legemsvægt eller vehikelkontrol i 30 minutter forud for IR på dag 1, 3, 5, 7 og 9. Vist er middelværdi tumorvolumener for LLC og A549 med SEM fra hver behandlingsgruppe af mus. Tumorvækstforsinkelse for LLC og A549-tumorer blev beregnet som antallet af dage for tumorer når 0. 25 cm

3 (B). Vist er et søjlediagram, der repræsenterer den gennemsnitlige tumorvækst forsinkelse med SEM fra hver behandlingsgruppe af 7 mus; * P 0,05. Tumorvolumener blev analyseret på dag 7 for LLC tumorer og dag 15 for A549-tumorer. Vist er et søjlediagram, der repræsenterer tumorvækst på dag 7 for LLC tumorer og dag 15 for A549 tumorer med SEM fra hver behandlingsgruppe af 6 mus;