PLoS ONE: Ets-1 Regulerer Energy Metabolism i cancerceller

abstrakt

Kræftceller overvejende udnytte glycolyse til ATP-produktion, selv i nærvær af rigelige oxygen, et miljø, der normalt ville føre til energiproduktion gennem oxidativ phosphorylering. Selv om den molekylære mekanisme for denne metaboliske skift til aerob glykolyse ikke er fuldt belyst, er det sandsynligt, at mitokondriel beskadigelse elektrontransportkæden, og den resulterende forøget produktion af reaktive oxygenarter er betydelige drivkræfter. I denne undersøgelse har vi undersøgt den rolle af transkriptionsfaktoren Ets-1 ved regulering af mitochondrial funktion og metabolisme. Ets-1 blev overudtrykt under anvendelse af et stabilt inkorporeret tetracyklin-inducerbar ekspressionsvektor i æggestokkene cancercellelinie 2008, som ikke udtrykker påviselige basale niveauer af Ets-1-protein. Microarray analyse af virkningerne af Ets-1 overekspression i disse æggestokkene cancerceller viser, at Ets-1 opregulerer vigtige enzymer involveret i glykolysen og associerede feeder veje, fedtsyre stofskiftet og antioxidant forsvar. I modsætning hertil Ets-1 nedregulerer gener involveret i citronsyrecyklen, elektrontransportkæden, og mitokondrielle proteiner. På det funktionelle plan, har vi fundet, at Ets-1-ekspression er direkte korreleret med cellulære iltforbrug hvorved øget udtryk årsager faldt iltforbrug. Ets-1 overekspression forårsagede også forøget følsomhed over for glycolytiske inhibitorer, samt vækstinhibering i en glucose-udtømte kultur miljø. Kollektivt vores resultater viser, at Ets-1 er involveret i reguleringen af ​​cellulære metabolisme og reaktion på oxidativt stress i æggestokkene cancerceller

Henvisning:. Verschoor ML, Wilson LA, Verschoor CP, Singh G (2010) Ets- 1 Regulerer Energy Metabolism i kræftceller. PLoS ONE 5 (10): e13565. doi: 10,1371 /journal.pone.0013565

Redaktør: Jen-Tsan Ashley Chi, Duke University, USA

Modtaget: Juni 4, 2010; Accepteret: September 24, 2010; Udgivet: 22 oktober 2010

Copyright: © 2010 Verschoor et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra den canadiske Institutes of Health Research (CIHR). De finansieringskilder havde ingen rolle i undersøgelsen design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

over 50 år siden, Otto Warburg først foreslået at mitokondrie skade, der fører til deprimeret elektron transportkæden funktion og respiratoriske defekter er et vigtigt skridt i udviklingen og progressionen af ​​carcinogenese [1], [2]. I de seneste to årtier har mange undersøgelser vist, at tumorer fortrinsvis bruger glykolysen til energiproduktion i oxidativ fosforylering, en egenskab, der er blevet kendetegnende for tumor patofysiologi [3] – [5]. Kendt som Warburg virkning, cancerceller overvejende udnytte glycolyse til ATP-produktion, selv i nærvær af rigelige oxygen, et miljø, der normalt ville føre til energiproduktion gennem oxidativ phosphorylering [2], [6]. Ændringer i mitokondrie-DNA svarer til øget produktion af ROS og forringet oxidativ fosforylering, hvilket resulterer i nedsat ATP produktion og øget glykolytisk afhængighed [5], [7]. Den øgede produktion af reaktive oxygenarter, især H

2O

2, ved cancerceller er sandsynligvis et resultat af mitokondriel dysfunktion, som mitokondrier anses for at være den fremherskende cellulære kilde af reaktive oxygenarter [8]. Fire til fem procent af O

2 forbruges af oxidativ phosphorylering i mitochondrierne normalt omdannes til reaktive oxygenarter; derfor mangler til elektrontransportkæden systemet i cancerceller ville resultere i reaktiv formation overdreven ilt arter [8] – [10]. Udpræget produceret, H

2O

2 kan fungere som et signalmolekyle ved at oxidere cysteinmolekyler på proteiner, aktiverer flere signalveje herunder MAPK, samt flere transkriptionsfaktorer, herunder AP-1, p53, NF-KB, og Ets-1 [11] – [15]

Ets-1, et medlem af Ets protein familie af transkriptionsfaktorer, regulerer ekspressionen af ​​et bredt sæt af proteiner gennem sin interaktion med specifikke konsensus sekvenser opstrøms af. målgener [16]. Over-ekspression af Ets-1 er blevet associeret med en lang række forskellige cancere, specielt med hensyn til tumorudvikling og invasion [16] – [19]. Derudover overekspression af Ets-1 er også blevet forbundet med dårlig prognose i bryst [20], i æggestokkene [21], og cervikale karcinomer [22]. Traditionelt er Ets-1 menes at fungere som en transkriptionel aktivator og den høje ekspression i endotelceller og stromaceller korrelerer med tumorcelleinvasivitet og ugunstige udfald i æggestokkene og brystcancer [23] – [25]. Vores laboratorium og andres har understreget vigtigheden af ​​Ets-1 i reguleringen af ​​forskellige aspekter af kræft celle adfærd, herunder ekstracellulære matrix remodeling, invasion, angiogenese [26], og resistens [27]. Forbindelsen mellem Ets-1 og kræft invasiv kan potentielt forklares med listen over kendte målgener reguleret af denne transskription faktor. Adskillige MMP’er og integrin gener samt urokinase plasminogen aktivator (uPA), som alle er kendte mediatorer af ekstracellulære matrix-nedbrydning og cellemigration, er kendte mål for Ets-1 [28] – [31]. Mange gener afgørende for angiogenese og ekstracellulær matrix remodellering, såsom matrixmetalloproteinaser (MMP-1, MMP-3, MMP-9), uPA og Integrinβ3, er under direkte regulering af Ets-1 [26]. Denne transskription faktor anses derfor for at være en vigtig mediator af kræftcellen udvikling og tumor progression.

I denne undersøgelse har vi påvist, at Ets-1 spiller en rolle i reguleringen af ​​energiomsætningen i æggestokkene cancerceller. Brug high throughput genomisk analyse har vi fundet, at Ets-1 regulerer, hverken direkte eller indirekte, flere vigtige gener involveret i mitokondrie metaboliske og antioxidant forsvar veje i vores Ets-1 overekspression æggestokkræft celle model. Funktionelt, har vi vist, at glycolyse, oxidativ phosphorylering, og cellulære respiratoriske systemer ændres som reaktion på ændringer i Ets-1-ekspression. Tilsammen vores resultater viser, at Ets-1 er en central transskription faktor involveret i reguleringen metaboliske og oxidativt stress i kræftceller.

Resultater

Kræft celle model af Ets-1 genekspression

Ets-1 var over-udtrykt i 2008 ovariecancerceller ved hjælp af en tetracyklin-inducerbare system genererer 2008-Ets1 celler. Ets-1-protein-ekspression i tetracyclin-behandlet 2008 og 2008-Ets1 blev undersøgt via Western blotting (figur 1). Ets-1 protein-ekspression var ikke påviselig i 2008 helcellelysater, men blev let påvises i den inducerede 2008-Ets1 lysat. Øget Ets-1-ekspression viste sig at være en specifik virkning som protein niveauer af to lignende Ets familiemedlemmer, Ets-2 og PEA3 blev ikke ændret i denne model af Ets-1 overekspression (figur 2).

2008 ovariecancerceller blev stabilt transficeret til overudtrykke Ets-1 i et tetracyclin inducerbare system. Protein udtryk for 2008 og 2008-Ets1 celler blev målt via Western blot efter induktion med tetracyclin (n = 3).

Protein udtryk for ETS familie transkriptionsfaktorer (A) Ets-2 og (B ) PEA3 blev sammenlignet i 2008 og 2008-Ets1 ovariecancerceller at bestemme specificiteten af ​​vores Ets-1-ekspression model. Western blot analyse viste, at ingen af ​​disse transkriptionsfaktorer var påvirket af Ets-1-ekspression i 2008 celler.

Ets-1 regulerer stofskiftet genekspression

Microarray analyse af 2008 og 2008- Ets1 celler afslørede, at 3,131 gener af de 28,869 gener probet blev opreguleret eller nedreguleret som respons på Ets-1 overekspression af mindst 1,45 gange (p≤0.001) (GEO database accession # GSE21129). Til denne undersøgelse har vi valgt at rapportere og undersøge ændringer i udvalgte mRNA, hvis funktioner er relevante for mitokondrie-aktivitet, cellulær metabolisme, og oxidativ stress. Real time QRT-PCR validering blev udført ved hjælp af 10 målgener repræsenterer forskellige fold ændre værdier, og resultater blev normaliseret til 4 separate husholdning gener. Selvom både PPARG og SDHB genekspression i 2008-Ets1 celler var ikke signifikant forskellige fra 2008 celler, blev fold ændringer bestemt ud fra tidstro QRT-PCR forbundet med microarray fold ændringer ved en korrelationskoefficient på 0,99 (tabel 1). Derfor fold ændringer større end 1,45 blev anset for at være gyldige resultater og blev inkluderet i denne undersøgelse.

udtryk for G6PD, PDHA, HK, og CYC blev undersøgt ved Western blotting at bestemme, om genet ekspressionsforskelle observerede var også til stede på proteinniveauet. Vi fandt ikke nogen signifikante forskelle i proteinekspression mellem 2008 og 2008-Ets1 celler for nogen af ​​de undersøgte enzymer (data ikke vist).

Den glycolytiske evne af kræftceller reguleres af Ets-1

microarray analyse af 2008-Ets1 ovariecancer celler afslørede, at Ets-1 er involveret i reguleringen af ​​mitokondrie stress og dysfunktion som metaboliske gener, herunder dem, der er involveret i glykolyse, glycolytiske feeder veje, TCA-cyklus, og lipid metabolisme (tabel 2), og gener involveret i antioxidantforsvar (tabel 3) blev ændret i Ets-1 over-udtrykkende celler. For at vurdere, om celler med stabil overekspression af Ets-1 favor glykolyse i oxidativ fosforylering til energi, som forudsagt af vores microarray analyse blev celler dyrket i glucose-frie medier suppleret med den glycolytiske inhibitor 2-DG, en analog af glukose. Celler blev dyrket i nærvær af varierende mængder af 2-DG, og repræsentative vækstkurver blev genereret for hver cellelinje. Væksten af ​​celler i medium indeholdende 2-DG blev inhiberet i højere grad i celler med en højere Ets-1-ekspression end i parentale celler (figur 3A). Det 2-DG IC

50 doser, eller doser, hvor 50% af cellerne havde stoppet prolifererende, blev beregnet ud fra 4 uafhængige eksperimenter. Vores resultater viste, at 2008-Ets1 celler induceret med tetracyclin var de mest følsomme over for 2-DG, med en IC

50 0,75 mM, hvilket var betydeligt lavere end de parentale 2008 celler, IC

50 af 4,29 mM ( p≤0.01). C13 * celler, en cisplatin-resistente variant af 2008 celler, havde en IC

50 på 2,04 mM, hvilket også var signifikant lavere end parentale 2008-celler (p ≤ 0,05). For at se bort fra en behandlingseffekt blev parentale 2008 celler behandlet med tetracyclin, og viste ingen signifikant væksthæmning ved 2-DG med en IC

50 af 3,67 mM (data ikke vist). Vækst af celler i normal eller glucose-frie medier (suppleret med natriumpyruvat) sammenlignet mere end 96 timer, hvorefter den blev observeret, at spredning af celler med forøget ekspression af Ets-1 især langsommere blev sammenlignet med parentale 2008 celler (figur 3B ). Behandling med glucose-frie medier resulterede i et fald proliferationshastighed for alle testede sammenlignet celler normalt suppleret medie (data ikke vist).

(A) 2008 C13 *, og 2008-Ets1 celler blev behandlet med den glycolytiske inhibitor 2-DG, og cellulær vækst blev målt efter 96 timers inkubation. 2008-Ets1 og C13 * celler, som udtrykker Ets-1 udviste signifikant nedsat vækst efter glycolytiske inhibering i 2008-Ets1 sammenlignet med parentale 2008-celler (n = 4). (B) for 2008 og 2008-Ets1 celler blev dyrket i fravær af glucose, og proliferationsassays blev udført med 24 timers intervaller. 2008-Ets1 ovariecancer celler, der udtrykker høje niveauer af Ets-1 viste en nedsat evne til vækst i glucose-dyrkningsmedium, hvilket tyder på en øget afhængighed af glykolysen til energi (n = 3).

Ets-1 regulerer cellulær iltforbrug i kræftceller

Vores microarray-analyser tyder på, at Ets-1 overekspression resulterede i en samlet nedregulering af gener, der koder elektron transport kæden komponenter, hvilket tyder på, at disse cellelinier ville sandsynligvis display faldt O

2 forbrug (tabel 4). Denne antagelse blev vurderet ved anvendelse høj opløsning respirometri, hvor basal iltforbrug blev målt efter tilsætning af celler til en oxygraph. Basal iltforbrug var signifikant lavere i inducerede 2008-Ets1 celler (26.23 pmol O

2/1 × 10

6 celler /sek, p ≤ 0,05) sammenlignet med 2008 celler (40.60 pmol O

2/1 × 10

6 celler /sek, p ≤ 0,05) (figur 4). Ingen signifikant tetracyclin behandling effekt på basal iltforbrug blev fundet efter induktion af 2008 celler, der bekræfter, at tetracyclin ikke påvirkede iltforbruget i vores model (data ikke vist).

Basal iltforbrug blev bestemt for 2008 og 2008- Ets1 ovariecancerceller. Ets-1-ekspression var forbundet med et signifikant fald i basal iltforbrug hvilket tyder på en mindre afhængighed af oxidativ fosforylering i 2008-Ets1 celler.