PLoS ONE: Menneskelig Intestinal Lumen og slimhinder-associerede mikrobiota i patienter med kolorektal Cancer

Abstrakt

De seneste rapporter har foreslået inddragelse af tarmens mikrobiota i udviklingen af ​​kolorektal cancer (CRC). Vi udnyttede pyrosekventering baseret analyse af 16S rRNA-generne til at bestemme den samlede struktur af mikrobiota i patienter med colorectal cancer og raske kontroller; undersøgte vi mikrobiota af tarmlumen, cancervævet og matches noncancerous normalt væv. Desuden undersøgte vi slimhinden klæbende mikrobiel sammensætning under anvendelse af prøver rektale podninger fordi strukturen af ​​vævet-klæbende bakterielle samfund er potentielt ændret efter tarm udrensning. Vores resultater viste, at den mikrobielle struktur tarmlumen og cancervævet afveg betydeligt. Phylotypes der forbedrer energi høst fra kost eller udføre metabolisk udveksling med værten var mere rigelige i lumen. Der var mere rigelige Firmicutes og mindre rigelige Bacteroidetes og Proteobacteria i lumen. De overordnede mikrobielle strukturer af cancervæv og noncancerous væv lignede hinanden; howerer tumor mikrobiota udviste lavere mangfoldighed. Strukturerne af tarmlumen mikrobiota og slimhinde-adhærerende mikrobioter var forskellige i CRC patienter sammenlignet med matchede mikrobiota hos raske personer. Lactobacillales blev beriget med kræft væv, mens

Faecalibacterium

blev reduceret. I slimhinden klæbende mikrobiota,

Bifidobacterium, Faecalibacterium

, og

Blautia

blev reduceret i CRC patienter, mens

Fusobacterium

,

Porphyromonas

,

Peptostreptococcus

, og

Mogibacterium

blev beriget. I lumen, blev fremherskende phylotypes relateret til metaboliske forstyrrelser eller metabolisk udveksling med værten, Erysipelotrichaceae, Prevotellaceae, og Coriobacteriaceae øget hos cancerpatienter. Koblet med tidligere rapporter, tyder disse resultater, at den intestinale mikroflora er forbundet med CRC risiko, og at tarmlumen mikroflora potentielt påvirke CRC risiko via cometabolisme eller metabolisk udveksling med værten. Men slimhinde-associeret mikrobiota potentielt påvirker CRC risiko primært gennem direkte interaktion med værten

Henvisning:. Chen W, Liu F, Ling Z, Tong X, Xiang C (2012) Menneskelig Intestinal Lumen og slimhinder-associerede mikrobiota i patienter med kolorektal cancer. PLoS ONE 7 (6): e39743. doi: 10,1371 /journal.pone.0039743

Redaktør: Antonio Moschetta, University of Bari Consorzio Mario Negri Sud, Italien

Modtaget: Januar 12, 2012; Accepteret: 25. maj 2012; Udgivet: 28 juni 2012

Copyright: © 2012 Chen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Project 2007CB513001 af kinesiske nationale programmer for Fundamental forskning og udvikling (973 program, https://www.973.gov.cn/AreaAppl.aspx). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kolorektal cancer (CRC) er en af ​​de mest almindelige ondartede tumor type i verden. En af de vigtige faktorer i forbindelse med CRC er den intestinale mikroflora [1]. Den fordøjelsessystemet huser cirka 1000 arter af bakterier i alt 10

14 celler, hvilket er mere end 10 gange antallet af eukaryote humane celler [2]. Ud over at påvirke vært ernæring via metabolisme, den intestinale mikroflora påvirker det menneskelige legeme ved at kontrollere epitel- proliferation og differentiering, påvirke udviklingen af ​​immunsystemet og beskyttelse mod patogener [3].

akkumulerende beviser tyder på, at tarmen mikrobiota er tæt korreleret med udviklingen af ​​colorectal cancer [1], [4]. Wei

et al

. fundet en stigning på

Ruminococcus obeum

og

Allobaculum

-lignende bakterier i fæces af rotter udvikler forstadier slimhindelæsioner [5]. En stigning på

Prevotella

blev rapporteret i CRC patienter [6]. Wang

et al

. fundet en reduktion i butyrat-producerende bakterier i fæces fra CRC patienter [7], der angiver fordelen ved bakterielle metabolitter.

Men slimhinden-associerede microbiome i tarmvæv afviger fra lumen [8], og disse mikrober også potentielt spiller en vigtig rolle. Marchesi og medarbejdere analyserede de bakterielle 16S rDNA-sekvenser af seks CRC patienter og konstateret, at probiotiske bakterier, såsom

Coriobacteria

blev beriget i tumorvæv ved at analysere de bakterielle 16S rDNA-sekvenser af seks CRC patienter [9], hvilket antyder, at probiotika potentielt spille en særlig rolle i CRC progression.

Fusobacterium nucleatum Hej, fundet i tyktarmskræft væv blev rapporteret at være tæt forbundet med CRC [10]. den nøjagtige sammensætning af tarm mikrobiota og dens funktion i CRC progression, er dog stadig ukendt, fordi den overordnede struktur af mikrobiota i CRC patienter ikke er blevet fuldstændig klarlagt.

Bakterier eller komponenter af bakterier funktion ved direkte interaktion med værten eller indirekte co-metabolisme eller metabolisk udveksling med værten. Van der Waaij

et al

. fandt, at kommensale bakterier lever i tarmlumen suspensionen og har ingen direkte kontakt med epitelceller [11]. Vi antager, at slimhinden-associerede mikrobiota primært funktion ved direkte at interagere med værten og at tarmlumen (dvs. fæces) mikrobiota hovedsagelig handle gennem cometabolisme eller metabolisk udveksling. I denne undersøgelse har vi udført pyrosekventering af 16S rRNA-generne for at analysere den overordnede struktur af mikrobiota hos patienter med CRC og i raske kontroller. Vi studerede mikrobiota af tarmlumen, cancervæv, og matches noncancerous normalt væv. Derudover undersøgte vi mucosa-klæbende mikrobiel sammensætning ved anvendelse af prøver rektale podninger fordi strukturen af ​​vævet-klæbende bakterielle samfund er potentielt ændres ved at følge tarm udrensning [12]. Desuden har vi forsøgt at identificere centrale bakterielle phylotypes eller potentielle biomarkører, som potentielt spiller vigtige roller i CRC udvikling.

Materialer og metoder

kontrolgrupper

Patienter og

I alt 46 patienter med CRC 37-88 år blev udvalgt fra First Affiliated Sygehus, College of Medicine, Zhejiang University, Kina. Vi samlede de følgende prøver fra disse patienter: [21 afføring (STP) prøver, 32 gut podninger (SWP) prøver og 27 af hver af kræft væv (cat), matchet paracancerous væv 2-5 cm fra cancervævet (pa2t), og matches paracancerous væv 10-20 cm fra cancervævet (pa10t)]. Taburetten, rektal podninger, og vævsprøver blev ikke indsamlet fra alle CRC patienter af følgende grunde: vandig afføring, afføring for tynd til at indsamle; prøver opbevaret for længe ved stuetemperatur; eller patienten følte sig utilpas under indsamlingen af ​​prøver rektal podning. Derudover 56 raske frivillige, der opfyldte kravene for at have matchet køn og lignende alder med prøver af CRC patienter, og som udviste ingen colon adenomer blev udvalgt som kontrol; 22 afføringsprøver (STC) og 34 podninger (SWC) blev opsamlet fra disse frivillige (tabel 1). Vi definerede mikrobiota af væv, fæces, og vatpind som væv mikrobiota, lumen mikrobiota, og mucosa-klæbende mikrobiota hhv. Vi definerede både væv mikrobiota og slimhinde-adhærerende mikroflora som mucosa-associeret mikroflora. Ingen forsøgspersoner havde diabetes, infektionssygdomme, eller særlige kostvaner. Og BMI alle patienter mellem 20 og 24. Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité for First Affiliated Sygehus, College of Medicine, Zhejiang University, Kina; dokumenteret informeret samtykke blev opnået fra alle undersøgelsens deltagere.

prøvetagning og DNA Extraction

Ingen af ​​de emner blev tager medicin på tidspunktet for prøvetagningen, heller havde de anvendte antibiotika inden mindst en måned af prøvetagning. Podning og fækale prøver blev indsamlet fra hver emne forud for tarm udrensning. Under operationen blev der intestinale prøver indsamlet fra cancervævet og paracancerous væv (dvs. 2-5 cm og 10-20 cm fra cancervævet, henholdsvis). Alle prøver blev nedfrosset og opbevaret ved -80 ° C indtil yderligere anvendelse.

Genomisk DNA blev ekstraheret fra væv og podning prøver ved hjælp af QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) ifølge producentens instruktioner med mindre ændringer. Bakterielle celler i podninger blev løsnet ved kraftig agitation i 1 ml PBS. Cellerne blev pelleteret ved centrifugering ved 17.000 g i 10 minutter. Pellets blev resuspenderet i 80 pi enzymopløsning (22,5 mg lysozym pulver [katalog no.L6876, Sigma] og 40 enheder mutanolysine [katalog nr. M9901, Sigma] opløst i 80 pi TE per prøve) [13], og 100 mg zirconium perler (0,1 mm) blev tilsat. Blandingerne blev rystet i en mini-perle beater (FastPrep, Thermo Electron Corporation, USA) tre gange for 40 s hver gang, og derefter inkuberet ved 37 ° C i 40 min [14]. Efterfølgende trin blev udført ifølge producentens anbefalinger. Intestinale væv blev skyllet grundigt med sterilt vand, homogeniseret i 80 pi enzymopløsning med en elektrisk homogenisator (PRO Scientific, Oxford, Connecticut, USA), inkuberet ved 37 ° C i 40 min, og derefter fuldstændigt lyseret i 1-3 timer ved 56 ° C i ATL puffer og proteinase K. 70 ° C inkubationstrin blev udvidet fra 10 minutter til 30 minutter [8]. Skammel bakterielt genomisk DNA blev ekstraheret under anvendelse QIAamp DNA Stool Mini Kit med de samme modifikationer som anført ovenfor.

Pyrosequencing

PCR-amplifikation af V1-V3-regionen af ​​bakteriel 16 S rDNA blev udført ved anvendelse universel primere (27F 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ‘, 533R 5′-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3’), som indeholder de FLX Titanium adaptere og en prøve stregkode sekvens. De cykliseringsparametre var som følger: 5 min indledende denaturering ved 95 ° C; 25 cykler med denaturering ved 95 ° C (30 s), annealing ved 55 ° C (30 s), forlængelse ved 72 ° C (30 s); og endelig forlængelse ved 72 ° C i 5 min. Tre separate PCR-reaktioner af hver prøve blev samlet for pyrosekventering. PCR-produkterne blev separeret ved 1% agarosegelelektroforese og oprenset ved anvendelse af QIAquick Gel Extraction kit (Qiagen). Lige koncentrationer af ampliconer blev samlet fra hver prøve. Emulsion PCR og sekventering blev udført ifølge producentens anbefalinger [15].

All pyrosekventering læser blev filtreret ifølge stregkode og primersekvenser. De resulterende sekvenser blev yderligere screenet og filtreret for kvalitet og længde. Sekvenser, der var mindre end 150 nt, indeholdt tvetydige tegn, indeholdt over to fejlparringer til primerne, eller indeholdt mononukleotid gentagelser af over seks nt blev fjernet [16]. I alt 808,008 høj kvalitet sekvenser blev produceret, der tegner sig for 80,8% af gyldige sekvenser efter barcode- og primer-sekvens filtrering.

Bioinformatik Analyse

Den høje kvalitet sekvenser blev tildelt prøver efter stregkoder. Sekvenser blev rettet ind efter SILVA tilpasning [17], [18] og grupperet i operationelle taksonomiske enheder (Otus). Otus der nåede 97% lighed niveau blev anvendt til mangfoldighed (Shannon), rigdom (Chao), god dækning, og fortynding kurve analyse ved hjælp Mothur (version 1.5.0) https://schloss.micro.umass.edu/[19 ]. Taksonomiske tildelinger af Otus udviser 97% lighed blev udført ved hjælp af Mothur efter SILVA 106 ved 80% konfidensniveau.

Heatmap blev bygget ved hjælp af Heatmap 2 funktion af R gplots pakke og slægten information af syv grupper [20]. Uvægtede UniFrac distance målinger blev udført ved hjælp af Otus for hver prøve [21], [22], og principal komponent analyse (PCA) blev udført i overensstemmelse med den matrix af afstanden. For at vælge Otus der udstillet betydning i den strukturelle adskillelse mellem grupperne, blev en parametrisk Delvis mindste kvadraters Discriminant Analysis (PLS-DA) model genereres ved hjælp af Simca-P + 12,0 (https://www.umetrics.com/). PLS-DA udnyttes i metabolomics, metagenomics og microarray analyse, og Otus med variabel betydning i projektion (VIP) 1 blev anset for at være vigtige bidragydere til modellen [5], [23], [24], [25] .

Statistisk analyse

Mann-Whitney test,

t

-test, og en-vejs ANOVA-test blev udført ved hjælp af SPSS-version 19,0 til Windows.

data adgang

de sekvensdata 16 s genereret i denne undersøgelse blev forelagt GenBank Sequence Læs Arkiv tiltrædelse nummer SRP009633.

Resultater

Karakteristik af pyrosekventering Resultater

i alt 808,008 høj kvalitet sekvenser blev fremstillet i denne undersøgelse, med et gennemsnit på 4253 sekvenser per prøve. Kortfattede oplysninger er vist i tabel 2, og detaljerede karakteristika for hver prøve findes i tabel S1.

De estimatorer samfundstjeneste rigdom (Chao) og mangfoldighed (Shannon) er vist i tabel 2. Der var statistisk signifikante forskelle i Shannon indekser mellem grupper kat og pa10t (3,77 ± 0,67 vs. 4,13 ± 0,40,

P

= 0,012), hvilket viser den betydeligt højere diversitet findes i noncancerous normale væv (dvs. dem, 10-20 cm fra cancervæv) sammenlignet med cancervæv. Detaljerede karakteristika for hver prøve er anført i tabel S1. Fortyndingscyklussen analyse af syv grupper er vist i figur S1 viser, at sandsynligvis ville blive opdaget flere phylotypes efter at udforske større antal sekvenser. The Good dækning af hver gruppe var over 97%, hvilket indikerer, at de 16 S rDNA sekvenser identificeret i disse grupper udgør størstedelen af ​​bakterier til stede i prøverne af denne undersøgelse.

Microbial Strukturer af tarmlumen og kræft væv afveg Markant

Vi studerede afføring, rektal podning og væv mikrobiota af patienter med CRC og afføring og rektal podning bakterielle samfund af raske personer. Den overordnede mikrobiota struktur for hver gruppe på phylum niveau er vist i figur 1. Den dominerende phyla af alle grupper var Firmicutes, Bacteroidetes, og Proteobacteria. Der var 17 phyla og 13 phyla i vævs- og podninger prøver henholdsvis og kun 9 phyla i afføringsprøver. Phylum-specifikke relative overflod af mikrobiota sekvenser afslørede, at vatpind mikrobiota udviste en tættere lighed med væv. Den Heatmap ifølge bakteriel slægt niveau viste også det samme fænomen (figur S2).

“andet” repræsenterer de uklassificerede bakterier, Chloroflexi, Deferribacteres, Chlorobi, Deinococcus-Thermus, Acidobacteria, Planctomycetes, Lentisphaerae, spirokæt, Synergistetes , Tenericutes, Verrucomicrobia og Cyanobakterier. Den første otte phyla var ikke synlige i afføringsprøver, og de første fire phyla var ikke synlige i prøver podninger.

For at sammenligne den overordnede mikrobiota struktur hos patienter med CRC den uvægtede Unifrac distance matrix blev beregnet baseret på Otus af hver prøve [26]. Resultaterne af PCA baseret på afstand udviste en signifikant forskel i bakteriel struktur i tarmlumen (dvs. fæces). Endvidere cancervæv, og mucosa-vedhæftende mikrobiota (dvs. vatpind) overlappede med nogle lumen og væv mikrobiota, hvilket fremgår af de to første hovedkomponent scores, der tegnede sig for 30,57% og 9,12% af de samlede variationer (figur 2A).

Hvert symbol repræsenterer en prøve. (A) gruppe kat, stp og SWP; (B) gruppe kat, pa2t og pa10t; (C) gruppe SWP og SWC; (D) gruppe stp og STC.

Der var betydelige variationer i sammensætningen af ​​tarmlumen og kræft væv på forskellige bakterielle niveauer. En kladogram repræsentation af strukturen af ​​væv og lumen mikrobiota og deres fremherskende bakterier blev udført ved Lefse er vist i figur 3 [27]; de største forskelle i taxa mellem de to samfund vises. Pyrosekventering data viste, at et større antal phyla var til stede i væv sammenlignet med lumen. De tre dominerende phyla-Firmicutes (50,82% mod 77,59%,

P

0,001), Bacteroidetes (26,37% mod 13,68%,

P

= 0,002), og Proteobacteria (14,51 % vs. 5,57%,

P

= 0,004) -alle udstillet statistisk signifikante forskelle mellem kræft væv og tarmlumen. Fusobacteria (4,97% vs. 0,47%,

P

0,001) og Synergistetes (0,14% vs. 0%,

P

= 0,002) også afveg mellem grupperne. Der var 26 statistisk signifikante forskelle mellem cancervæv og tarmlumen i familien. Den relative overflod af Bacteroidaceae (16,9% vs. 8,3%,

P

0,001), Streptococcaceae (10,2% vs. 2,8%,

P

= 0,0029), Fusobacteriaceae (4,57% vs. . 0,47%,

P

0,001), Peptostreptococcaceae (4,07% vs. 0,89%,

P

0,001), Veillonellaceae (2,87% vs. 0,68%,

P

= 0,004), og Pasteurellaceae (2,25% versus 0,007%,

P

0,001) var signifikant højere i cancervæv sammenlignet med det intestinale lumen. Der var en signifikant lavere niveau af Lachnospiraceae (17,1% vs. 46,7%,

P

0,001), Ruminococcaceae (4,24% vs. 13,3%,

P

0,001), og Lactobacillaceae (0,02% vs. 2,88%,

P

0,001). i kræft væv i forhold til tarmlumen (tabel S2)

(A) Taksonomisk repræsentation af statistisk og biologisk konsistente forskelle mellem cancervæv og tarmlumen. Skellene består farven på den mest udbredte klasse (Rød indikerer cancervæv, gul ikke-signifikante og grønne tarmlumen). Diameteren af ​​hver cirkel diameter er proportional med taxon overflod. (B) Histogram af LDA scores for differentielt rigelige slægter. Kladogram blev beregnet ved Lefse, en metagenomet analyse tilgang, som udfører den lineære diskriminant analyse efter Wilcoxon Mann-Whitney test for at vurdere virkningen størrelse af hver differentielt rigelige taxon eller OTU; den kladogram vises i henhold til effekt størrelse.

Den mikrobielle sammensætning var også signifikant forskellige på slægten niveau, med 43 signifikant forskellige slægter mellem kræft væv og tarmlumen.

Bacteroides

,

Streptococcus

,

Prevotella

,

Fusobacterium

,

Peptostreptococcus

,

Haemophilus

,

Gemella

,

Veillonella

,

Granulicatella

,

Morganella

, og

Porphyromonas

, som udgør over 1% af det samlede antal bakterier i kræft væv, udviste en relativt højere overflod i kræftvæv.

Pseudobutyrivibrio

,

Blautia

,

Lactobacillus

,

Roseburia

,

DOREA

Coprococcus

, konstituerende som udgør over 1% af de totale bakterier i fæces, var relativt mere rigelige i tarmlumen sammenlignet med i kræftvæv. Yderligere oplysninger om forskellene mellem lumen mikrobiota og kræft væv mikrobiota kan findes i tabel S2.

Bakteriel Fællesskabet i kræftvæv og Matchet noncancerous Normal Tissue

Selv om der blev observeret lavere mangfoldighed (Shannon) i mikrobiota af kræft væv (tabel 2), de mikrobielle samfund af tumor og matches noncancerous normale væv var ens (figur 1, figur S2). Ifølge uvægtede Unifrac PCA-analyse, de mikrobielle samfund af kræft væv og noncancerous væv ligner ifølge PC1 og PC2 (51,37% og 4,35% forklarede varians henholdsvis) (figur 2B), hvilket indikerer, at der ikke er markante forskelle i den mikrobielle sammensætning tumor og noncancerous væv.

En taksonomi-baseret sammenligning blev udført for at bestemme forskellene mellem mikrobiota af tumor og noncancerous væv. Der var 12, 17 og 14 phyla og 169, 198, og 198 slægter i microbiotas af kat, pa2t, og pa10t hhv. Dette blev bekræftet af Shannon (mangfoldighed) analyse. Ingen statistisk signifikante forskelle blev observeret mellem de mikrobielle samfund af kræft og noncancerous væv på phylum niveau. Alphaproteobacteria, som udgør mindre end 1% af de samlede bakterier i både pa2t og pa10t, var mest udbredt i kat. Færre

Ochrobactrum

slægt medlemmer var til stede i pa2tcompared til kat. Den Bacilli klassen var stærkt beriget med kat i forhold til pa10t. Men slægten

Bacillus

, som Bacillus tilhører, var mindre udbredt i kat. Den Ruminococcaceae familien var signifikant lavere i kat i forhold til pa10t. Genus

Faecalibacterium

, tilknyttet Ruminococcaceae, blev også stærkt beriget i pa10t forhold til kat. Genera

Paraprevotella

,

Parabacteroides, Phascolarctobacterium

,

Acidocella

, og

Methylobacterium

udstillet lav tæthed; imidlertid blev de alle statistisk beriget med pa10t sammenlignet med kat. Desuden den relative forekomst af bakterier i prøverne øget eller nedsat gradvist i sammenhæng med afstanden fra cancervævet (tabel 3).

metagenomet analyse tilgang lefse blev anvendt til at identificere de centrale phylotypes ansvarlige for forskellen mellem kat og pa10t. Baciller (hovedkomponent Lactobacillales), som blev beriget med kat, og

Phascolarctobacterium

, Ruminococcaceae (hovedkomponent

Faecalibacterium

), som blev beriget i pa10t var de dominerende phylotypes der bidrager til forskellen mellem mikrobiota af kræft væv og noncancerous væv.

mucosa-klæbende mikrobiota i CRC Patienter og raske personer

Fordi den mikrobielle sammensætning kan ændres af tarm udrensning før operation, mucosa-klæbende bakterier var undersøgt i prøver indsamlet på rektal podninger. Som forventet, den mikrobielle struktur var noget anderledes sammenlignet med væv (figur 1, figur 2A) og svarede til tarmlumen (nogle prøver overlappet på PCA plots) på grund af de uundgåelige feces på Svaberprøverne.

Uvægtet Unifrac PCA baseret på den relative forekomst af Otus for hver prøve viste en adskillelse mellem CRC patienter og raske individer under anvendelse PC1 og PC2 (10,64% og 6,58% af forklaret varians, henholdsvis) (figur 2C). Familierne Porphyromonadaceae (3,86% vs. 1,41%,

P

= 0,045), Fusobacteriaceae (3,72% vs. 0,18%,

P

= 0,045), og Peptostreptococcaceae (2,13% vs. 0,66 %,

P

= 0,03) blev beriget i CRC patienter, men Bifidobacteriaceae (0,03% vs. 0,32%,

P

0,001) og Alcaligenaceae (0,39% vs. 0,63%,

P

= 0,03) blev reduceret i CRC patienter. Genera

Fusobacterium

(Fusobacteriaceae),

Porphyromonas

(Porphyromonadaceae),

Peptostreptococcus

(Peptostreptococcaceae),

Gemella

,

Mogibacterium,

og

Klebsiella

blev beriget i CRC patienter.

Filifactor

,

Catonella

og

Selenomonas

var fraværende fra raske individer.

Faecalibacterium

,

Blautia

,

Lachnospira

,

Bifidobacterium

(Bifidobacteriaceae) og

Anaerostipes

blev reduceret i CRC patienter, og

Catenibacterium

og

Gardnerella

(Bifidobacteriaceae) var fraværende fra CRC patientprøver (Figur 4).

(A) Genera forskellig mellem SWP og SWC. (B) Genera forskellig mellem stp og STC. Mann-Whitney-test blev anvendt til at evaluere betydningen af ​​sammenligninger mellem angivne grupper. * P 0,05, ** P. 0,01

Porphyromonas Hotel (tilknyttet Porphyromonadaceae),

Fusobacterium

,

Peptostreptococcus,

Mogibacterium

blev beriget i CRC patienter, mens

Faecalibacterium

,

Blautia

, og

Bifidobacterium

blev udtømt i disse patienter. Ifølge lefse analyse, disse er de vigtigste phylotypes, der bidrager til den strukturelle adskillelse af slimhinde-klæbende mikrobiota i CRC-patienter og raske personer.

Mikrobiel sammensætning Intestinal Lumen i CRC patienter og raske Personer

Den intestinale lumen mikrobiota af CRC patienterne kunne skelnes fra raske individer efter uvægtede Unifrac PCA analyse (figur 2D). Familierne Erysipelotrichaceae (6,09% vs. 2,42%,

P

= 0,035), Prevotellaceae (1,46% vs. 1,14%,

P

= 0,035), Coriobacteriaceae (1,19% vs. 0,74% ,

P

= 0,035), og Peptostreptococcaceae (0,89% vs. 0,45%,

P

= 0,035) var signifikant beriget i CRC patienter. Peptostreptococcaceae blev også beriget i prøver af CRC patienter podninger, mens den relative forekomst var højere i forhold til kræft væv. Genera

Peptostreptococcus

(Peptostreptococcaceae),

Porphyromonas

,

Mogibacterium

,

Anaerococcus

,

Slackia

,

Anaerotruncus

,

Collinsella

(Coriobacteriaceae),

Desulfovibrio

,

Eubacterium

Paraprevotella

var også mere udbredt hos patienter i forhold til kontrolgruppen (figur 4B).

Erysipelotrichaceae, Prevotellaceae, Coriobacteriaceae (

Collinsella

),

Peptostreptococcus

, og

Anaerotruncus

(Clostridiales), som blev beriget med patienterne blev klassificeret som centrale phylotypes, der bidrager til adskillelsen af ​​tarm lumen mikrobiota struktur i CRC-patienter og raske personer.

Identifikation af Key Otus Ansvarlig for Strukturel adskillelse af slimhinden-associerede mikrobiota af kræft og kontrolprøver

Sears og Pardoll foreslog en Alpha-Bug hypotese i en nylig rapport-vis microbiome medlemmer, der besidder unikke virulente træk, såsom enterotoksigent

Bacteroides fragilis

, er ikke kun direkte pro-onkogen, men er i stand til remodeling microbiome som helhed og dermed fremme mucosale immunresponser og colon epitel celleforandringer og resulterer i coloncancer [28]. Vi antager, at denne Alpha-Bug potentielt hører til slimhinden-associerede bakterier samfund. Først Lefse, en streng værktøj, blev anvendt til at identificere dominerende Otus. Vi fandt seks dominerende Otus, som alle blev reduceret i kræft væv og disse centrale bidragydere tilhører

Faecalibacterium

,

DOREA

,

ukultiveret Ruminococcus

sp.,

Ruminococcus gnavus

, Lachnospiracea, og Peptostreptococcaceae. Vi genererede en PLS-DA-modellen blev genereret for at finde mere Otus der potentielt bidrage til adskillelsen. Otus der blev differentielt fordelt blev udvalgt efter deres variable betydning i fremspringet (VIP). I alt 27 Otus med VIP 2 blev identificeret som værende relativt vigtige bidragsydere (fire af disse blev beriget med kat, de andre blev reduceret). Disse var medlemmer af Lachnospiracea (14), Bacteroidaceae (6), Ruminococcaceae (6), og Peptostreptococcaceae (1); alle udstillede betydelige forskelle mellem kat og pa10t (

P

0,05, Mann-Whitney-test). To ekstra Otus tæt knyttet til

Ruminococcus gnavus

og 4 otus tilhører slægten

Faecalibacterium

viste sig også at blive reduceret i kræft væv.

Desuden blev denne analyse foretages anvendelse af mucosa-klæbende bakterielle prøver. To dominerende Otus for hver af de

Peptostreptococcus

sp. og

Parvimonas

sp. blev beriget over 100 gange i CRC patienter. Én OTU relateret til

Bacteroides caccae

og én relateret til

Clostridium

sp. Der blev også beriget. To otus tilhører

Faecalibacterium

Blautia

blev reduceret betydeligt i patienter. Vi valgte 69 Otus med VIP 2, der var vigtige bidragsydere ifølge PLS-DA, og 64 af dem var signifikant forskellig mellem CRC patienter og kontroller. Blandt dem, seks otus tilhører slægten

Faecalibacterium

og seks otus tilhører slægten

Blautia

blev reduceret hos patienter med CRC. Derudover to Otus relateret til

Fusobacterium varium

, én OTU relateret til

Bacteroides xylanisolvens

, og én OTU relateret til

Dialister pneumosintes

var stærkt beriget hos patienter med CRC. To ekstra Otus relateret til

Peptostreptococcus sp.

Og

Parvimonas sp.

Blev beriget i patienter med CRC.

Diskussion

Vi spekuleret på, at mucosa- associeret mikrobiota virker primært gennem direkte interaktion med værten, og at tarm lumen mikrobiota virker primært gennem cometabolisme eller metabolisk udveksling med værten. Vi udnyttede barcoded multipleksede-454 pyrosekventering at sammenligne den bakterielle sammensætning cancervævet og tarmlumen af ​​patienter med CRC som hos raske kontroller. Vi undersøgte også slimhinden-klæbende mikrobielle sammensætning ved hjælp af prøver rektal podninger, fordi den bakterielle samfund er potentielt ændres ved at følge tarm udrensning. Vi fandt, at strukturen af ​​mikrobiota i cancervævet adskiller sig væsentligt adskiller sig fra tarmlumen. Den relative overflod af dominerende phyla Firmicutes, Bacteroidetes, og Proteobacteria og dominerende slægter

Bacteroides

,

Streptococcus

, og

Pseudobutyrivibrio

var alle forskellige. Firmicutes, som har vist sig at øge energi høst fra kosten, var stærkt beriget i tarmlumen [29], [30], [31]. Endvidere er de fremherskende slægt

Pseudobutyrivibrio

udviste butyrat som et hovedmetabolits, samt mælkesyre og myresyre [32]. I modsætning hertil Bacteroidetes, som er stærkt beriget i slimhinden, kan være primært involveret i interaktioner med tarmen [33]. De stærkt berigede store Gram-negative bakterier Proteobacteria i slimhinde, med en ydre membran sammensat af lipopolysaccharider, potentielt udviser direkte interaktion med intestinale celler gennem bakterielle sekretionssystemer såsom T2SS eller T3SS [34], [35]. Derudover beriget Fusobacteria og Synergistetes i slimhinder også inficerer tarmvæv [36], [37], [38]. Som forventet, vores resultater viste, at strukturen af ​​slimhinde-klæbende mikrobioter var mere ligner væv mikrobiota. Slimhinde-adhærerende mikrobielle strukturer også udviste lighed med lumen mikrobiota; dette er til dels på grund af den uundgåelige afføring crossover på podninger. Vi postuleret, at vatpinden mikroflora repræsenterer en kombination af fækal mikroflora og en slimhinde befolkning mindre tæt knyttet, mens vævet mikrobiota repræsenterer tæt koloniserede bakterier. Uvægtede Unifrac PCA analyse bekræftede dette resultat. Samlet mikrobielle strukturer var ens mellem kræft væv og noncancerous væv.