PLoS ONE: miR-375 medieret Erhvervet Chemo-Modstand i livmoderhalskræft ved Lettere EMT

Abstrakt

Erhvervet kemo-resistens er en af ​​de vigtigste årsagsfaktorer i kræft død. Nye beviser tyder på, at miRNA og epitelial-mesenkymale overgang spiller kritiske roller i kemo-resistens i kræft. Her viste vi sammenslutningen af ​​paclitaxel-modstand med miR-375 overekspression og epitelial-mesenkymale overgang tilskyndelse i livmoderhalskræft. Brug af forskellige livmoderhalskræft celle modeller, fandt vi, at paclitaxel forbigående induceret opregulering af miR-375 udtryk, spredning hæmning, overgang fra epitelial til mesenkymale fænotype, og dermed forringet paclitaxel følsomhed. Tvungen overekspression af miR-375 kan undertrykke Ecadherin udtryk ved en direkte målrettet vej, som førte til paclitaxel modstand. Modsat, re-ekspressionen af ​​Ecadherin delvis omvendt epitelial-mesenkymale overgang fænotype og miR-375 induceret paclitaxel-modstand. Vores resultater tyder på, at paclitaxel-induceret miR-375 overekspression letter epitel-mesenkymale overgangsproces via direkte rettet mod Ecadherin, spredning hæmning, og derfor resulterer i kemo-resistens i livmoderhalskræft celler. En tilbagevenden af ​​miR-375 eller Ecadherin udtryk kan være en ny behandlingsmetode for at overvinde kemo-resistens i livmoderhalskræft

Henvisning:. Shen Y, Zhou J, Li Y, Ye F, Wan X, Lu W, et al. (2014) miR-375 medieret Erhvervet Chemo-Modstand i livmoderhalskræft ved at lette EMT. PLoS ONE 9 (10): e109299. doi: 10,1371 /journal.pone.0109299

Redaktør: Zhi-Ming Zheng, National Institute of Health – National Cancer Institute, USA

Modtaget: 28 oktober, 2013; Accepteret: 10. september 2014 Udgivet: 16 Okt 2014

Copyright: © 2014 Shen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne vil gerne anerkende den fortsatte økonomiske støtte fra National Natural Science Foundation of China (tilskud nr 81.172.475 og 81.172.474), Natural Science Foundation of Zhejiang-provinsen i Kina (Grant nr Z2110056, LQ13H160005 og Y2110206). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Nye beviser har afsløret, at kemo-modstand er forbundet med epitelial mesenkymale overgang (EMT) i kræftceller, og købet af kemo-resistens i cancerceller er ledsaget af en overgang fra en epitelial til et mesenkymale fænotype [ ,,,0],1] – [3]. For eksempel forskellige resistente kræftformer, herunder oxaliplatin-resistente kolorektal cancer celler [4], paclitaxel-resistente ovariecancerceller [5], og gefitinib-resistente lunge cancerceller [6], præsentere overgangen fra epitel til mesenkymale fænotype sammen med et tab af epitel adhæsionsmolekyle Ecadherin og en gevinst på mesenchymale markører, såsom vimentin, Ncadherin, og fibronectin. Nyere undersøgelser har også vist, at kemoterapeutiske stoffer kan lette epitel til en mesenchymal fænotypisk transformation i resterende overlevende kræftceller, som kan være en af ​​de kritiske trin i erhvervet resistens lægemiddel i kræft [7], [8]. Således erhvervelse af EMT bliver en vigtig proces bidrager til de maligne fænotyper af kræftceller i resistens mod kemoterapi. Derfor har intervention EMT proces blevet foreslået som en terapeutisk tilgang mod erhvervet kemo-resistens.

MikroRNA’er (miRNA) fungere som vigtige gen regulatorer i menneskelige genomer og deres afvigende udtryk kan fremme ikke blot tumori-tilblivelse og tumor aggressivitet men også resistens mod kemoterapi [9]. Senere har de undersøgelser viste, at miRNA spiller en integrerende rolle i modulering EMT, såsom MIR-200S, der regulerer EMT gennem inhibering ZEB1 /2, en transskription repressor af Ecadherin [1], [10], [11]. Vi rapporterede for nylig, at ekspressionen af ​​miR-375 blev reduceret i livmoderhalskræft celler [12] og håndhæves overekspression af miR-375 signifikant hæmmede spredning og blokerede G1-S cellecyklus overgang [13]. I en anden undersøgelse vi desuden, at MIR-375 blev opreguleret i paclitaxel-behandlede cervikale celler og væv, og tvunget over-ekspression af MIR-375 faldt paclitaxel følsomhed i livmoderhalskræft [14]. er dog fortsat den præcise molekylære mekanisme slave miR-375 regulerede resistens at blive udforsket. Ved miRNA henvender gen forudsigelse, fandt vi et bindingssted mellem miR-375 og Ecadherin 3′-UTR, som viste, at Ecadherin var en potentiel direkte mål for miR-375. Derfor antager vi, at miR-375 kan deltage i EMT regulering og erhvervede paclitaxel-resistens i livmoderhalskræft celler.

I den foreliggende undersøgelse, fandt vi for første gang, at paclitaxel hæmmer spredning, inducerer EMT, og op -regulates miR-375-ekspression samtidigt i livmoderhalskræft celler. Og miR-375 overekspression hæmmede direkte Ecadherin udtryk og lettet paclitaxel-modstand. Således er der en klar positiv feedback mekanisme blandt paclitaxel, miR-375, og EMT, der fører til erhvervet kemo-modstand fænotyper i livmoderhalskræft celler. En sådan regulerende tilbagekobling loop resulterer i MIR-375 overekspression, epitel til en mesenchymal fænotypisk transformation, og følgelig erhvervelse af paclitaxel-resistens. Anyway, kunne det blive troet, at en pause på en sådan feedback-sløjfe ville, i det mindste delvis, overvinde kemo -resistance i livmoderhalskræft.

Materialer og metoder

Patienter og prøver

prøverne af kræft væv blev indsamlet fra 23 cervikale pladecellekræft patienter med FIGO (2009) fase IB

2 eller IIA

2, der gennemgik neo-adjuverende kemoterapi efterfulgt af type III radikal hysterektomi mellem november 1, 2008 og maj 30, 2010 i kvinders Hospital, School of Medicine, Zhejiang University. Samlingen af ​​alle prøver blev godkendt af Etisk Komité for Klinisk Forskning fra kvinders Hospital, School of Medicine, Zhejiang University og skriftlige informerede samtykke blev opnået.

Alle patienter gennemgik 2 cykler af intravenøs neo-adjuverende kemoterapi ( paclitaxel 135 mg /m

2 og cisplatin 75 mg /m

2, 3 ugers interval) før operationen. Effekten af ​​kemoterapi blev vurderet i henhold til respons evalueringskriterier i solide tumorer (RECIST) [15], som tidligere beskrevet

14. Af alle 23 patienter, gennemsnitsalder var 36,5 år (range 20 til 65 år), havde før og efter kemoterapi cervikal tumor prøver. Den angivne sammensætning af hver prøver blev bestemt af en erfaren patolog.

Cell kultur og EMT tilskyndelse

To humane livmoderhalskræft cellelinjer, SiHa og CaSki blev dyrket som tidligere beskrevet

14. Human rekombinant TGF-β1 og EGF-β blev opnået fra ProSpec-Tany Techno Gene Ltd (Israel), henholdsvis anvendt ved en slutkoncentration på 5 ng /ml og 2 ng /ml. De cancercellelinier blev podet 1 x 10

5 /brønd i 6-brønds plader og inkuberet i serumfrit medium natten over, og derefter behandlet med TGF-β1 eller EGF-β i 72 timer henholdsvis at inducere EMT.

RNA Extraction og Real-Time RT-PCR

Totale RNA’er indeholdende miRNA blev udvundet fra flydende nitrogen bevaret væv eller de høstede celler ved hjælp 1 ml TRIZOL reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ifølge producentens instruktioner. cDNA blev syntetiseret med PrimeScript RT reagens (Takara Otsu, Shiga, Japan). Kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR) for miRNA og mRNA blev udført som tidligere

14 beskrevet. Sekvenserne for alle primere er angivet i tabel 1.

celleproliferationsassay og MTS Assay

For at bestemme virkningen af ​​MIR-375 og paclitaxel på proliferation af cervikale cellelinjer, den celleproliferation blev bestemt med MTT-assay og CellTrace CFSE celleproliferationsassay ved 24, 48, 72, 96 timer og 5 dage hhv. For levedygtighed eksperimenter, livmoderhalskræft celler med eller uden 10 nM paclitaxel behandling 72 timer blev udpladet (SiHa, 3 × 10

3 /brønd i 96-brønds plade og 2 × 10

pladen 5 /brønd i 6-brønds ; CaSki, 2 × 10

3 /brønd i 96-brønds plade og 1 x 10

5 /brønd i 6-brønds plade) og dyrket natten over. I MTT-assay absorbansen af ​​prøverne blev målt med et spektrofotometer læser ved 490 nm. CellTrace CFSE celleproliferationsassay blev udført ved farvning aktiveret livmoderhalskræft med CellTrace CFSE celleproliferation farvestof (2,5 uM) (Invitrogen) og analysere ved anvendelse af flowcytometri med 488 nm excitations- og emissionsfiltre. En in vitro paclitaxel kemo-følsomhed cervicale cancerceller blev vurderet ved anvendelse MTS assay (Promega, Madison, WI) som beskrevet tidligere [12]. Fire replikatbrønde blev anvendt til hver analyse, og blev udført mindst tre uafhængige forsøg.

Western blot-analyse

I alt 50 mg protein blev separeret ved denaturering 8-15% SDS-polyacrylamid gelelektroforese. Western-analyse blev udført som tidligere beskrevet [12]. Filmene blev analyseret ved densitometri med en VersaDoc Imaging System; Model 3000 (BioRad) ved hjælp Mængde One-software. Variansanalyse med Bonferroni korrektion for multiple tests blev anvendt til bestemmelse betydning. De primære antistoffer blev anvendt, var anti-Ncadherin (1:5000), anti-Ecadherin (1:2000), anti-fibronectin (1:1000), anti-vimentin (1:1000) og anti-actin (1:2000) som en endogen kontrol, alle fra Epitomics Bioteknologi (Epitomics).

Immunhistokemi

Sektioner (6 um tyk) af tumorvæv blev skåret fra paraffinised 23 par af selv-parrede præ-og post-kemoterapi livmoderhalskræft prøver og immunhistokemi analyse og scoring blev beskrevet tidligere

12. De primære antistoffer anvendt til immunhistokemi-analyse var anti-Ecadherin antistof (1:1000) og anti-actin antistof som en endogen kontrol (1:2000), begge fra Epitomics Biotechnology (Epitomics).

lentivirus konstruktion og transfektion

For at generere miR-375 og Ecadherin overekspression stabile transfektanter blev livmoderhalskræft celler transficeret med lentiviral udtrykke vektorer. Plasmidet konstruktion og lentivirus pakke var komplet i GENECHEM Company. De præ-MIR-375 sekvenser blev amplificeret og klonet ind i pGCsil-GFP-vektoren ved anvendelse af følgende primere: (fremad) HSA-præ-MIR-375-Xhol-F, ACCGCTC GAGCCCCGCGACGAGCCCCTCGC; (Reverse) HSA-præ-mi-R-375-Mfel-R, ACCGCAATTGAAAAAGCCTCACGCGAGCCGAACG. HSA-CDH1 (CDS) genet blev amplificeret og klonet i en pGC-FU-GFP-vektoren ved anvendelse af følgende primere: (fremad) 5′-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGGCCCTTGGAGCCGCAG-3 ‘, (bagside) 5′-TCATCCTTGTAGTCGCTAGCGTCGTCCTCGCCGCCTCCGTACATG-3’. Vira emballager blev udført i HEK 293 T-celler efter cotransfektion af 20 mg pGCsil-GFP-præ-MIR-375 vektor eller pGC-GFP-CDH1 vektor med 15 mg af pakkende plasmid pHelper 1.0 Vector og 10 mg af kuverten plasmid pHelper 2.0 vektor ved anvendelse af Lipofectamine 2000. Virus blev høstet 48 timer efter transfektion, og virustitere blev bestemt. De titre af den virale anvendt i denne undersøgelse var i intervallet 5 × 10

8~2 × 10

9 TU /ml.

For at generere miR-375 og Ecadherin overekspression stabil transfektanter blev cervicale cancerceller transficeret med lentivirale udtrykkende vektorer som tidligere beskrevet [12]. En MOI = 5 blev anvendt til SiHa og MOI = 10 blev anvendt til CaSki. Efter 4~7 d af transfektion blev stabile kloner selekteret med GFP ved flowcytometri og høstet til yderligere eksperimenter. En tom pGC FU-GFP-NC-LV vektor blev anvendt som en negativ kontrol.

luciferaseaktiviteten Assay

For at undersøge om CDH1 ekspression blev reguleret af miR-375, en psicheck-2 dual -luciferase miRNA target ekspressionsvektor (psicheck-2 -UTR vektor) blev anvendt til at udføre luciferaseaktiviteten assay. Den vilde og mutanttype 3′-UTR af CDH1 indeholdende forudsagte MIR-375 bindingssted blev syntetiseret og indsat i 3′-UTR-regionen nedstrøms for ildflue-luciferase-genet af psicheck-2-vektoren (psicheck-2 -UTR) ved anvendelse af Xho I og NotI restriktionssites. Alle konstruktioner blev verificeret ved sekventering. Efter cotransficeret med MIR-375 efterligner (20 uM) og reporter vektorer (0,2 ug /ml), blev luciferaseaktiviteter målt efter 24 timer ved anvendelse af en dobbelt-Glo luciferase assaysystem (Promega). Relativ luciferaseaktivitet i alle tal refererer til ildflueluciferase aktiviteter normaliseret til Renilla luciferase. Værdier celler med tomme psicheck-2 vektor blev sat lige til 1.

Statistisk Analyse

Forsøgene blev gentaget mindst tre gange. Resultater udtrykkes som middelværdi ± S.E.M. En uafhængig t-test eller en ANOVA blev anvendt til at sammenligne kontinuerlige variabler. Pearsons korrelationskoefficient test blev anvendt til at vurdere sammenhængen imellem to kontinuerlige variabler. P. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Paclitaxel induceret EMT og hæmmede spredning samtidig i livmoderhalskræft celler

Når morfologi rutinemæssigt dyrkede livmoderhalskræft celler behandlet med eller uden paclitaxel blev undersøgt ved mikroskopi, observerede vi, at SiHa celle voksede så stramt pakket “brosten” -lignende epitelceller, mens celler behandlet med paclitaxel syntes en spindel-lignende form fladtrykt og mistede størstedelen af ​​deres celle-celle-kontakter. (Figur 1a) I mellemtiden er ekspressionen af ​​Ecadherin protein blev reduceret (10,5% ~66.6% og 43,75% ~67.6% under 5 nM til 20 nM paclitaxel behandling henholdsvis) og udtrykkene for Ncadherin og fibronectin-protein blev forøget på en dosis-responsiv måde. (Figur 1b) Lignende virkninger blev også observeret i CaSki celler. (Figur 1b, figur S1).

(a) Synlige morfologiske ændringer fra “brosten” -lignende til “fibroblast” -lignende celler blev observeret i SiHa efter 72 h paclitaxel behandling. De repræsentative celler med morfologiske ændringer blev mærket (b) Immunoblotting målte ekspressionen af ​​Ecadherin og andre EMT relaterede proteiner (vimentin, Ncadherin, og fibronectin) i cervicale cancerceller (SiHa og CaSki) under forskellige mængder (0, 5, 10, 20 nM) paclitaxel behandling. Ekspressionen af ​​Ecadherin protein blev nedsat, og udtrykkene for vimentin, Ncadherin, og fibronectin-protein blev forhøjet i celler behandlet med paclitaxel i 72 timer på en dosis-responsiv måde. Alle udtrykkene for proteinerne blev normaliseret til ß-actin og dataene i søjlediagrammer er præsenteret som gennemsnit af tredobbelte prøver fra tre uafhængige forsøg. Alle fejlsøjler angivet s.e.m. (** P≤0.01, * p ≤ 0,05). (C, d) Den transiente celleproliferation hæmning og morfologiske ændringer induceret af paclitaxel blev observeret. Proliferationen ændringer i SiHa og CaSki celler efter indgift af paclitaxel blev analyseret ved CellTrace CFSE celleproliferation (c) og MTT-assay (d) efter 24 timer, 72 timer, 96 timer, dag 5, dag 7, dag 14 og dag 21, henholdsvis. Spredningen på paclitaxel behandlet SiHa og CaSki celler var signifikant reduceret på dag 7 og restaureret på dag 21 efter paclitaxel administration. De overlevede CaSki celler blev restaureret i normal morfologi på dag 21 efter paclitaxel administration.

Desuden en forbigående celledeling hæmning fremkaldt af paclitaxel blev observeret ved flowcytometri og MTT. SiHa og CaSki-celler blev rutinemæssigt dyrket med 10 nM paclitaxel, efter 72 timer, paclitaxel blev fjernet, og cellerne blev dyrket med komplet medium kontinuerligt, dernæst de sprednings ændringer i SiHa og CaSki-celler før og efter indgift af paclitaxel afsløret ved 24 timer, 72 h, 96 h, dag 5, dag 7, dag 14 og dag 21, hhv. Som vist i figur 1c, 1d, spredning på paclitaxel behandlet SiHa og CaSki celler på dag 7 blev væsentligt reduceret (SiHa, p = 0,002 og p = 2,3 × 10

-5, CaSki, p = 3,1 × 10

-4 og p = 1,2 × 10

-5 henholdsvis), sammenlignet med blank kontrol, og gendannet til de niveauer før lægemiddelbehandling på dag 21. på samme tid, “brosten” -lignende morfologiske ændringer fremkaldt af paclitaxel i overlevede celler blev også restaureret til normal morfologi på dag 21. disse kendsgerninger viser, at paclitaxel forbigående hæmmer proliferation og inducerer EMT samtidig i livmoderhalskræft celler, men alle disse paclitaxel-inducerede ændringer vendt efter tilbagetrækning narkotika.

paclitaxel opregulerer miR-375 under fremkalde EMT og spredning hæmning

Vi havde udforsket miR-375 udtryk skiftende involveret i paclitaxel induceret EMT og spredning hæmning i livmoderhalskræft celler, og den klare dosisafhængig effekt af paclitaxel på miR-375 overekspression blev observeret

14. Desuden progressive opreguleret udtryk for miR-375 nåede et højdepunkt på dag 7 efter paclitaxel administration, efterhånden faldt efter paclitaxel fjernet og restaureret til niveauet før lægemiddelbehandling på omkring dag 21

14. Derudover var der en stærk negativ korrelation mellem ekspressionen af ​​MIR-375 og den relative spredning andelen af ​​cervicale cancerceller (SiHa, R = -0,472, p = 1,52 × 10

-3, CaSki, r = -0,835 , P = 3,03 × 10

-4). (Figur S2) Vores data viste, at paclitaxel opreguleret miR-375 udtryk og hæmmede spredning samtidig i livmoderhalskræft celler men begge paclitexel-inducerede ændringer vendt efter tilbagetrækning stof, hvilket tyder på, at nogle af livmoderhalskræft celler overleve i paclitaxel, sandsynligvis selv op- regulering mIR-375-ekspression og erhvervelse maligne mesenkyme fænotyper, derefter udvikle en potentielt nedsætte proliferation og modstå lægemiddeltoksicitet. Disse korrelation antyder, at miR-375 overekspression kan have en kausal rolle i kemoterapi-induceret EMT.

MIR-375 medierer EMT ved direkte rettet mod Ecadherin

Af miRDB og Targetscan søgeprogrammer analyse, vi fundet en forudsagt binding af miR-375 med CDH1 (Ecadherin) 3′-UTR, som viste, at Ecadherin var en potentiel direkte mål for miR-375 (figur 2c). For yderligere at fastslå, at Ecadherin er et target-gen af ​​miR-375, vi først analysere forholdet mellem Ecadherin og miR-375-ekspression i livmoderhalskræft celler under forskellige mængder af paclitaxel behandling. Som vist i figur 1b og figur S2, MIR-375-ekspression i celler var markant ureguleret på en dosisafhængig måde under paclitaxel-induceret EMT proces, samt Ecadherin protein og MIR-375-ekspression blev omvendt korrelerede (r = -0,752, P = 2,32 × 10

-4). Så vi yderligere anvendte luciferaseaktiviteten Assay for at bekræfte binding af MIR-375 til 3′-UTR of Ecadherin. (Figur 2c).

(a) fasekontrast billeder af livmoderhalskræft celler inficeret med præ-miR-375 eller negativ lentivirus vektor og blank kontrol. (B) Immunoblotting måling af Ecadherin og EMT relaterede proteiner i livmoderhalskræft tercells inficeret med præ-miR-375 eller negativ lentivirus vektor. (C) Et forudsagt duplex-dannelse mellem human CDH1 (Ecadherin) 3′-UTR og MIR-375. En reduceret luciferaseaktivitet blev observeret efter cotransfektion af Ecadherin 3′-UTR vildtype vektor med MIR-375, men ikke muteret eller tom vektor (p = 0,014). Data i a-c blev præsenteret som gennemsnittet af trillinger prøver fra uafhængige forsøg. Alle fejlsøjler angivet s.e.m. (** P≤0.01, * p ≤ 0,05).

For at teste, om opregulering af miR-375 bidrog til paclitaxel-induceret EMT, virkningerne af miR-375 overekspression på disse begivenheder blev evalueret. Ekspressionen af ​​MIR-375 blev analyseret ved realtids-PCR på den anden uge, tredie uge og første måned efter forbehandling miRNA lentiviral stabil transfektion. Som vist i figur 2a og 2b, tvungen overekspression af MIR-375 inducerede EMT proces i cervicale cancerceller, kendetegnet ved erhvervelse af fibroblastlignende cellemorfologi, undertrykkelse af Ecadherin ekspression (65% ~69.2%), og forbedring af vimentin, Ncadherin, og fibronektin udtryk, der svarer til de observerede i paclitaxel behandlede celler effekter.

således er vores resultater viser, at miR-375 overekspression fremmer paclitaxel-induceret EMT dels ved direkte rettet mod Ecadherin i livmoderhalskræft celler.

EMT regulerer paclitaxel følsomhed, men ikke miR-375 udtryk

for at afgøre om EMT kan regulere miR-375 udtryk omvendt, blev det næste sæt af eksperimenter udført. Vi induceret EMT af TGF-β1 eller EGF-β i cervicale cancerceller (SiHa og CaSki) og observeret påvirkning af EMT på paclitaxel følsomhed og MIR-375-ekspression. Stimuleret af TGF-β1 eller EGF-β, cervicale cancerceller undergik EMT ledsager synlige morfologiske ændringer (figur 3A), såsom fremkomsten af ​​en spindel-lignende form i celler, og EMT markør ændring, herunder nedsat Ecadherin proteinekspression (28,5% ~ 65,8% for TGF-β1 og 47,5% ~67.6% for EGF-β), samt øget Ncadherin, vimentin, og fibronectin proteinekspression (figur 3c). Imidlertid blev ekspressionen af ​​miR-375 ikke ændres under TGF-β1 eller EGF-β induceret EMT proces i livmoderhalskræft celler (SiHa,

s

= 0,538; CaSki

s

= 0,542) (figur 3d).

(a) Synlige morfologiske ændringer i SiHa og CaSki under TGF-β1 eller EGF-β tilskyndelse. (B) MTS analyse af paclitaxel-følsomhed i livmoderhalskræft celler. (C) Immunblotting analyse af Ecadherin og andre EMT relaterede proteiner efter TGF-β1 eller EGF-β induktion. (D) MIR-375 ekspression i SiHa og CaSki under TGF-β1 eller EGF-β tilskyndelse. Data i b-d blev præsenteret som gennemsnit af trillinger prøver fra uafhængige forsøg. Alle fejlsøjler angivet s.e.m. (** P≤0.01, * p ≤ 0,05).

Endvidere vi afgrænset lægemidlet følsomhed celler, som undergår EMT under anvendelse MTS assay. Paclitaxel følsomhed blev signifikant reduceret i SiHa og CaSki celler efter TGF-β1 eller EGF-β stimulation sammenlignet med serumfri kontroller kultur (figur 3b). IC50-værdierne blev forøget i SiHa og CaSki med 5 ng /ml TGF-β1 (95,81 ± 2,53 nM og 66,66 ± 2,32 nM henholdsvis SiHa,

s

= 0,032; CaSki,

s

= 0,023) eller 2 ng /ml stimulation EGF-β (96,74 ± 2,47 nM og 94,78 ± 1,72 nM henholdsvis SiHa,

s

= 0,038; CaSki

s

= 0,028) sammenlignet med serum -fri kultur kontroller (24,54 ± 1,37 nM, og 23,98 ± 2,62 nM).

Vores resultater viser, at TGF-β1 eller EGF-β inducerer EMT men dosis ikke ændre miR-375-ekspression i livmoderhalskræft celler, og mesenchymal celle-lignende livmoderhalskræft celler induceret af TGF-β1 eller EGF-β er typisk paclitaxel resistente. Den markant opreguleres ekspressionen af ​​miR-375 i paclitaxel behandlet cervikale Caner celler induceres ved paclitaxel men ikke EMT.

Ecadherin overekspression dæmper evnen miR-375 at mægle EMT og paclitaxel-modstand

Ecadherin er ikke kun en vigtig molekyle i initiering af EMT men også kendetegnende for EMT og mIR-375 medierer EMT ved direkte målretning Ecadherin.To undersøge den rolle, Ecadherin i EMT og paclitaxel følsomhed og at teste, om opreguleringen ofEcadherin kan dæmper effekten af ​​miR-375 på EMT og paclitaxel-modstand i livmoderhalskræft celler; den Ecadherin overudtrykt lentviral pGC-flag-CDH1 vektoren blev anvendt. Vi transficeret henholdsvis Ecadherin overudtrykt lentviral vektor og negativ kontrol i SiHa og CaSki celler med og uden miR-375 overekspression, og bemærkede, at effekten af ​​tvungen overekspression Ecadherin om EMT og paclitaxel-resistens. I Ecadherin over-udtrykkende kloner med og uden MIR-375 overekspression, var der en markant og signifikant stigning i ekspressionen af ​​Ecadherin (figur 4a). I celler uden miR-375 overekspression, ingen bemærkelsesværdige forskelle i morfologi og mesenkymale markører blev observeret i SiHa og CaSki celler efter Ecadherin overekspression, hvilket sandsynligvis fordi deres forældre celler allerede udviste en epitelial fænotype. Modsat, i celler med MIR-375 overekspression, var der en overgang fra isolerede fibroblastceller til “brosten” -lignende epitelceller. I mellemtiden blev de udtryk for Ncadherin, vimentin og fibronektin faldt betydeligt efter Ecadherin overekspression (figur 4a, 4c).

immunblotting (a) og MTS (b) analyse af Ecadherin og andre EMT relaterede proteiner i SiHa med og uden mIR-375 overekspression efter Ecadherin-udtrykkende eller negativ lentivirusvektor transfektion. Data i (a) og (b) blev præsenteret som gennemsnittet af trillinger prøver fra uafhængige forsøg. Alle fejlsøjler angivet s.e.m. (** P≤0.01, * p≤0:05). (C) Morfologiske ændringer i SiHa med og uden MIR-375 overekspression efter Ecadherin-udtrykkende eller negativ lentivirusvektor transfektion. De repræsentative celler med morfologiske ændringer var blevet mærket.

paclitaxel kemo-følsomhed blev derefter evalueret af MTS-analyser. Som forventet blev paclitaxel følsomhed steget betydeligt i Ecadherin lentvirus-transficerede celler med og uden miR-375 overekspression sammenlignet med kontrol- celler. IC50-værdierne blev nedsat i SiHa og CaSki med Ecadherin overekspression (12,82 ± 2,54 nM og 7,62 ± 0,93 nM henholdsvis SiHa,

s

= 0,043; CaSki,

s

= 0,038) sammenlignet med negative kontroller (20,73 ± 1,23 nm og 11,68 ± 0,62 nM henholdsvis SiHa,

s

= 0,028; CaSki,

s

= 0,021). Desuden blev paclitaxel modstand betydeligt svækket efter Ecadherin var effektivt over-udtrykt i cervikale celler med overudtrykt MIR-375 sammenlignet med negativ kontrol (figur 4b). IC50-værdierne blev nedsat i SiHa og CaSki med Ecadherin og miR-375 cotransfektion (22,82 ± 3,54 nM og 13,68 ± 0,64 nM henholdsvis SiHa,

s

= 0,033; CaSki,

s

= 0,038) sammenlignet med SiHa og CaSki med negativ kontrol og miR-375 cotransfektion (82,83 ± 2,23 nM og 20,31 ± 3,01 nM henholdsvis SiHa,

s

= 0,032; CaSki,

s

= 0,025 ). Vores resultater viste, at Ecadherin overekspression væsentligt forbedret paclitaxel følsomhed i livmoderhalskræft celler med eller uden miR-375 overekspression, hvilket tyder på, at Ecadherin overekspression dramatisk øger paclitaxel følsomhed, yderligere, re-ekspressionen af ​​Ecadherin vender, i det mindste delvis, EMT fænotype og paclitaxel-resistens medieret af miR-375 i livmoderhalskræft celler.

miR-375 overekspression korrelerer med Ecadherin udtryk i post-kemoterapi humane cervical carcinoma væv

for at etablere kliniske relevans af miR-375 mellem Ecadherin udtryk under kemoterapi effekter, vurderede vi miR-375 og Ecadherin udtryk i 23 par af selvstændige parret før og efter kemoterapi humane livmoderhalskræft væv. Den immunfarvning for Ecadherin afslørede mere omfattende og stærkere ekspression i præ-kemoterapi end den post-kemoterapi tumorvæv (figur 5). Samtidig blev MIR-375 markant opreguleret (4,67 gange) i paclitaxel-behandlede cervikale prøver blev Ecadherin og MIR-375-ekspression omvendt korreleret i alle væv, herunder præ- og post-kemoterapi (r = -0,905, p = 1,81 × 10

-3) (tabel S1).

(a) Ecadherin og miR-375-ekspression blev omvendt korreleret i alle væv, herunder præ- og post-kemoterapi (r = -0,905, P = 1,81 × 10

-3). (B) Farvning af menneske-specifikke Ecadherin udtryk i tre repræsentanter (1 PD og 2 PR) (× 200). En nedsat Ecadherin udtryk blev vist i vævene efter kemoterapi (p = 0,0023).

Af alle 23 patienter, 19 var kemo-følsomme og 4 kemo-modstand, den opreguleret udtryk for miR-375 er mere markant i kemo-resistens patienter, når sammenlignet post-kemoterapi væv med deres self parret før kemoterapi væv (6,7 ± 2,3 gange i kemo-modstand og 4,35 ± 0,63 gange i chemosensitive patienter henholdsvis

s

= 0,033) . Men det skal bemærkes, at der ikke er strøm nok til at konkludere, at miR-375-ekspression er højere i kemo-modstand patienter, delvist på grund af den lille stikprøve af de kemo-modstand patienter (N = 4).

Discussion

Chemo-resistens er en af ​​de vigtigste årsagsfaktorer i kræft tilbagefald og progression. De fleste af kræftceller reagerer godt i første omgang at kemoterapi, men til sidst udvikler resistens efter eksponering narkotika. Emerging beviser har afsløret, at cancerceller gennemgår EMT fremmer celleoverlevelse og resistens mod kemoterapi [3]. Selv om det er blevet rapporteret, at miRNA kan spille en integrerende rolle i modulering EMT [16]; dog detaljeret forskriftsprocedure forbliver uudforsket. MIR-375 blev oprindeligt fundet at blive udtrykt i pancreas-ø, hvor det regulerer sekretionen af ​​insulin og metabolisme af glucose [17]. For nylig blev miR-375 identificeret som en vigtig regulator i tumorgenese og kræft progression; Men de præcise funktioner i denne miRNA stort set obskure. MIR-375 blev identificeret som en tumorsuppressor i de fleste af kræftformer, såsom gastrisk cancer [18], [19], levercancer [20], hoved og hals pladecellecarcinom [21] og prostatacancer [22], men spiller et onkogent rolle i ERa-positiv brystkræft [23], i lunge-adenocarcinom patienter [24], og i HBV positiv HCC patienter [25]. Således er disse modstridende rapporter angående associationen mellem MIR-375 niveau og kræft foreslog en mere kompleks og muligvis cancer særligt forhold. I en anden undersøgelse af vores, observerede vi sammenhængen mellem miR-375 overekspression og paclitaxel -resistance livmoderhalskræft

16. Her har vi direkte link miR-375 til kemoterapi-induceret EMT proces i livmoderhalskræft. Vi fandt for første gang, at paclitaxel hæmmer spredning, inducerer EMT, og op-regulerer miR-375 udtryk i en dosisafhængig måde samtidig i livmoderhalskræft celler, men alle disse paclitaxel-inducerede ændringer vendt efter tilbagetrækning narkotika. Mekanistisk, ektopisk overekspression af miR-375 resulterede i reduceret Ecadherin udtryk og ledsaget af erhvervede mesenkymale egenskaber og kemo-resistens i livmoderhalskræft celler. Således er vores fund antydede, at paclitaxel ikke fjerner alle cervicale cancerceller og nogle af resterende celler kan overleve under lægemiddeleksponering. Under denne procedure disse resterende livmoderhalskræft celler med opreguleret MIR-375-ekspression sandsynligvis besidder et potentiale for at erhverve mesenchymal fænotyper, bremse proliferation og modstå lægemiddeltoksicitet.