PLoS ONE: Ingen Biologisk Bevis for XMRV i blod eller prostata væske fra prostatakræft Patients

Abstrakt

Baggrund

XMRV (xenotropisk museleukæmivirus-relateret virus) blev oprindeligt opdaget i forbindelse med prostatakræft og senere med kronisk træthedssyndrom (CFS). Dens samarbejde med CFS er nu stort set miskrediteret, og aktuelle resultater støtter et laboratorium oprindelsesbetegnelser for XMRV uden reproducerbar evidens for infektion af mennesker. Men nogle resultater, der antyder tilstedeværelsen af ​​XMRV i prostatakræft er vanskelige at henføre til prøve kontaminering. Her har vi søgt biologisk bevismateriale, der kunne bekræfte tilstedeværelsen af ​​XMRV i prostata cancer prøver tidligere er testet positiv.

Metoder og Resultater

Vi har testet for smitsomme XMRV og neutraliserende antistoffer mod XMRV i blod plasma fra 29 individer med prostatakræft, og for smitsomme XMRV i prostata sekreter fra yderligere fem prostatakræft fag. Ni af disse emner havde tidligere testet positiv for XMRV ved PCR eller af virus assay. Vi registrerer ikke XMRV eller relaterede retrovirus i enhver prøve, og de neutraliserende aktiviteter plasmaprøverne var alle meget lav, et resultat uforeneligt med XMRV infektion i plasmadonorer.

Konklusioner

Vi finde nogen beviser for XMRV infektion af enhver testet menneske, enten ved assay for infektiøst virus eller neutraliserende antistoffer. Vore resultater stemmer overens med de fleste publicerede undersøgelser af XMRV, der fastslår XMRV ikke er til stede hos mennesker. Den observerede lav til målbart XMRV neutralisering af humant plasma indikerer en mangel på medfødt begrænsning af XMRV replikation af opløselige faktorer i menneskeblod

Henvisning:. Mendoza R, Silverman RH, Klein EA, Miller AD (2012) nr Biologisk beviser for XMRV i blod eller prostata væske fra prostatakræft patienter. PLoS ONE 7 (5): e36073. doi: 10,1371 /journal.pone.0036073

Redaktør: Gilda Tachedjian, Burnet Institute, Australien

Modtaget: 9. februar 2012; Accepteret: 25 Marts 2012; Udgivet: May 16, 2012 |

Copyright: © 2012 Mendoza et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Støttet af uddannelse tilskud T32 CA080416 fra National Cancer Institute (RM); af pilotprojektet midler fra Core Center of Excellence i Hæmatologi tilskud DK56465 og ved at finansiere fra Fred Hutchinson Cancer Research Center (ADM); og af Charlotte Geyer Foundation, Maltz Family Foundation og Abbott Laboratories (RHS og EAK). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. EAK og RHS er opfindere om patenter licens til Abbott Laboratories, der vedrører metoder til påvisning af XMRV. Men resultaterne i den aktuelle rapport sandsynligvis reducere værdien af ​​en sådan teknologi, og dermed afbøde enhver interessekonflikt spørgsmål. Denne interesse ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker vedrørende datadeling og materialer. RM og ADM har erklæret, at de ikke har nogen konkurrerende interesser.

Introduktion

retrovirus XMRV (xenotropisk museleukæmivirus-relateret virus) blev oprindeligt opdaget i humane prostatakræft prøver [1], og var senere fundet i blodet hos en høj procentdel af patienter diagnosticeret med kronisk træthedssyndrom (CFS) [2], anledning til bekymring, at XMRV var en ny humant patogen. Imidlertid har de fleste af de efterfølgende undersøgelser ikke fastslå XMRV i mennesker med eller uden prostatacancer [3] eller CFS [4]. Derudover XMRV isolater fra de tidlige undersøgelser var alle næsten identisk med et virus produceret af en almindeligt anvendt prostatacancer-cellelinie, 22Rv1 [5] – [7]. Måske XMRV var til stede i prostatacancer hvorfra 22Rv1 cellerne blev afledt, men manglen på XMRV sekvensdiversitet blev forvirrende betragtning af den høje mutationsrate af retrovira. For nylig blev den XMRV stede i 22Rv1 celler vist at være opstået under passage af 22Rv1 prostatacancerceller og deres forfædre i nøgne mus, ved en sjælden rekombinationsbegivenhed mellem to endogene muse retrovira, og blev ikke påvist i tidlige xenotransplantater i prostata tumor [8]. Den forventede sjældenhed af denne begivenhed og den manglende sekvens mangfoldighed i de “menneskelige” XMRV isolater [7], [9] tyder på, at de menneskelige prøver blev forurenet med 22Rv1 XMRV eller plasmid kloner af XMRV.

I øjeblikket , en rolle for XMRV i CFS er i høj grad modbevist, og den oprindelige papir, der fandt denne forening er blevet trukket tilbage [10]. Især en stor kollaborativ undersøgelse viste, at to af de laboratorieundersøgelser grupper, der deltager i den oprindelige forskning ikke pålideligt kunne registrere XMRV i patientprøver, og at laboratorier, der kunne pålideligt registrerer XMRV ikke opdage XMRV hos patienter med CFS eller normale kontroller [11 ]. I tilfælde af sammenslutning af XMRV med prostatakræft, er det stadig uklart, om nogle af de oprindelige prostatakræft prøver måske har indeholdt patient-afledte XMRV eller andre nærtstående retrovirus.

Her har vi analyseret blodplasma og udtrykte prostatasecerneringer (EPS) fra prostatacancerpatienter, hvoraf nogle tidligere er testet positive for XMRV [1], [12] – [15], for tilstedeværelsen af ​​XMRV og beslægtede retrovira ved anvendelse af et assay for infektiøse retrovira. Desuden har vi testet blodplasma for neutraliserende antistoffer mod XMRV der kan begrænse vores evne til at detektere XMRV i plasma, og ville indikere et immunrespons mod XMRV i plasma donor. Vi finder ingen beviser for XMRV eller relaterede retrovira, eller en neutraliserende antistofrespons mod XMRV, i nogen af ​​de patientprøver.

Resultater

XMRV påvisningsmetoder

For at opdage smitsomme XMRV og relaterede retrovira i patientens plasma og EPS prøver, brugte vi S

+ L

– og markør redning analyser, der er blevet vist til effektivt at opdage XMRV [5]. S

+ L

– assay vi bruges måler evnen af ​​en retrovirus til at inficere og forårsage spredning af Moloney sarcomavirus stede i pg-4 cat celler [16], hvilket fører til produktion af transformerede foci i cellelag. Markøren redning assay blev udført under anvendelse af

Mus dunni

hale fibroblaster (dunni celler) transduceret med en retroviral vektor (LAPSN), der producerer human placental alkalisk phosphatase (AP). De dunni /LAPSN celler blev udsat for testprøver, blev passeret i en måned for at tillade virusspredning, og blev analyseret for produktion af LAPSN vektor på naive dunni celler. Dunni celler blev valgt til dette assay på grund af deres følsomhed over for en lang række murine leukæmi virus [17], herunder XMRV, andre xenotrope retrovirus, og polytrop retrovirus af den tidligere detekteret hos mennesker [1], [2], [18 ]. For at detektere neutraliserende antistoffer til stede i patientplasmaprøver anvendte vi S

+ L

– assay til kvantificering replikationskompetent XMRV efter inkubation med prøverne, sammenlignet med XMRV inkuberet med dyrkningsmedium som kontrol. I nogle forsøg målte vi evnen af ​​plasma til at neutralisere LAPSN vektor pakket i XMRV virioner (XMRV-pseudotype LAPSN vektor) som et surrogat for direkte måling af XMRV neutralisering.

For at bestemme kinetikken for virusspredning og følsomheden af ​​markør rednings assayet blev assayet udført ved at udsætte dunni /LAPSN celler til 50, 25, 10, 5, 1, eller 0 fokus-dannende enheder (FFU) af XMRV, som bestemt ved S

+ L

– assay. Cellerne blev derefter analyseret ugentligt i LAPSN produktion under passage af cellerne i en måned. LAPSN produktion blev opdaget på en uge efter infektion med 50 FFU af XMRV, på 2 uger efter infektion med 10 og 5 FFU, og på 4 uger for 1 af 2 plader inficeret med en FFU af XMRV. Disse resultater viser, at markør rednings assayet er omtrent lige så følsomt som S

+ L

– assay til påvisning af XMRV. Imidlertid kan denne markør rednings assay være mere følsom end S

+ L

– assay for nogle retrovira på grund af den kendte følsomhed dunni celler til en bred vifte af murine retrovira, mens færre typer af museretrovira kan inficere katten celler, der anvendes i S

+ L

-. assay

Ingen Beviser for XMRV Infektion af prostatacancer Patienter

Vi først testet, om blodplasma fra et sæt af ti prostatacancerpatienter, hvoraf tre tidligere er testet positive for XMRV ved RT-PCR, indeholdt replikationskompetent XMRV og /eller neutraliserende antistoffer mod XMRV (tabel 1). Vi registrerer ikke XMRV eller relaterede retrovira i enhver prøve af S

+ L

– assay. For at detektere neutraliserende antistoffer, blev plasmaprøver inkuberet ved 1:10 og 1:100 fortyndinger med XMRV-pseudotype LAPSN vektor til 30 minutter ved stuetemperatur, og den resterende LAPSN virus blev målt ved AP

+ fokusere assay. Kun én af de ti plasmaprøver viste svag neutraliserende aktivitet (neutraliserende titer på 10). Dette neutraliserende aktivitet blev elimineret ved varmeinaktivering af plasmaet, der inaktiverer komplement, hvilket viser, at ingen antistoffer var til stede, som umiddelbart kunne blokere virusinfektion.

På grund af det lave til målbart niveau af neutraliserende antistoffer i første sæt af 10 patientprøver, gennemførte vi yderligere neutralisationsbestemmelser med ufortyndet plasma. Derudover målte vi neutralisering af XMRV virus i modsætning til XMRV-pseudotype LAPSN vektor. Vi har ikke afsløre replikationskompetente XMRV eller relaterede retrovirus, som S

+ L

– eller markør redning analyser, i plasma fra nogen af ​​de 21 patienter blev testet, herunder fire, der tidligere har testet positive for XMRV ved PCR (se tabel 2 for patient og prøve detaljer). Endvidere har vi fundet lidt til ingen XMRV-neutraliserende aktivitet i de ufortyndede plasmaprøver, selv uden varmebehandling for at inaktivere komplement (Fig. 1). Prøve VP950 viste den højeste neutraliserende aktivitet (75% neutralisering), men varmeinaktivering af prøven før afprøvning, eller fortynde prøven 10 gange før testning, afskaffede neutraliserende aktivitet (data ikke vist), hvilket indikerer, at denne aktivitet er meget svag og sandsynligvis er afhængig af komplement. Den omstændighed, at infektiøs XMRV kan vedvare efter inkubation med de ufortyndede plasmaprøver viser, at infektiøs XMRV kunne persistere i blodet hos disse prostatacancerpatienter, og ville være detekterbar i vores assays for replikationskompetent virus. Den tilsyneladende mangel på en humorale immunrespons mod XMRV tyder på, at disse patienter ikke er inficeret med XMRV, i overensstemmelse med vores manglende evne til at påvise virus i disse plasmaprøver.

Patient numre er listet i bunden med stjerner angiver dem, der tidligere havde testet positiv for XMRV (se diskussion for detaljer). Den XMRV titer blev bestemt efter inkubation af en lille mængde af XMRV med ufortyndet plasma eller med dyrkningsmedium som kontrol, som beskrevet i Materialer og Metoder. Resultaterne er vist som forholdet mellem XMRV titer efter inkubation med plasma til, at efter inkubering med dyrkningsmedium, udtrykt i procent. Bemærk, at nogle værdier overstige 100%, hvilket indikerer forøgelse af XMRV infektion med disse plasmaprøver.

Vi næste testede EPS væsker opnået fra udskårne prostata kirtler [13] for tilstedeværelsen af ​​XMRV. For at teste for mulige effekter af EPS på XMRV infektivitet, tilføjede vi en lille mængde XMRV til ufortyndede EPS fra en normal prostata, eller dyrkningsmedium som kontrol, og målte titeren af ​​disse blandinger ved hjælp af S

+ L

– assay. Dobbelte prøver for hver blanding gav tilsvarende resultater (XMRV titer på 5 × 10

6 FFU /ml), hvilket viser, at XMRV kan overleve og påvises i EPS fluid. Der blev imidlertid ikke replikationskompetent virus påvist i nogen af ​​5 EPS prøver fra patienter med prostatacancer med S

+ L

– eller markør redning assays (se tabel 2 for prøve-id’er og beløb testet). Tre af disse patienter havde tidligere testet positiv for XMRV i urin (tabel 2) [15].

Aktivering af

M. dunni

Endogen Retrovirus i Nogle Marker Rescue Analyser

Vi har oplevet nogle falsk positive resultater med markøren redning analysen. I få tilfælde opdaget vi LAPSN produktion efter eksponering af dunni /LAPSN celler til plasma, men viral interferens analyse viste, at LAPSN transduktion blev fuldstændigt blokeret i dunni celler, der udtrykker den

M. dunni

endogene retrovirus (MDEV) [19], [20], men var upåvirket i dunni celler, der udtrykker XMRV (data ikke vist). MDEV og XMRV bruge forskellige receptorer for celle indrejse, som er blokeret af infektion med det beslægtede retrovirus, men er upåvirket af infektion med den alternative virus [17]. For at bekræfte, at de positive resultater var faktisk kunstig, udførte vi en markør rednings assay under anvendelse DU145 /LAPSN celler, og fandt, at alle de tilsyneladende falsk-positive patientprøver var faktisk negative for replikationskompetent XMRV (data ikke vist). Tidligere MDEV produktion fra

M. dunni

celler blev observeret efter behandling af cellerne med 5-iod-2′-deoxyuridin eller hydrocortison [19], og det viser sig, at stoffer i patientprøverne har en lignende evne til at aktivere den normalt tavse MDEV locus i dunni celler .

diskussion

af de 29 plasma og 5 EPS prøver fra prostatakræft patienter, som vi testede, ingen havde påvises indhold af replikationskompetent XMRV eller beslægtede retrovirus. Inkluderet var to plasmaprøver (VP29 og VP35) fra patienter, der blev testet XMRV positive ved viral detektion mikromatrice (Virochip) analyse i den oprindelige undersøgelse [1], en plasma prøve (VP234) fra en patient, der testede XMRV positive ved RT-PCR af prostatavæv RNA [12], en plasmaprøve (VP693) fra en patient, der testede XMRV positive ved RT-PCR af RNA isoleret fra EPS [13] og én plasmaprøve (VP432) fra en patient, der blev testet positive for infektiøs XMRV i plasma [14]. Især opmærksom på, at prostatakræft væv fra patient VP35 var den formodede kilde til første fuld-længde klon af XMRV [1]. Også inkluderet i vores analyse var tre EPS prøver (VP830, VP844 og VP881) og en plasmaprøve (VP663) fra patienter, der testede XMRV positive ved RT-PCR af RNA isoleret fra urin [15]. S

+ L

– og dunni cellebaserede markør rednings analyser, som vi brugte til at registrere virus er begge i stand til at detektere xenotropisk og polytropisk retrovirus [5], [17] af de typer der tidligere er rapporteret i prostatakræft og CFS patienter [1], [2], [18], samt amfotropiske murine leukæmi virus. Hertil kommer, at S

+ L

– assay kan detektere RD114 feline retrovirus, Feline leukæmi virus type A, B og C, gibbonabeleukæmivirus, og

Mus caroli

endogene retrovirus (McERV) [16], [17], [21], således de analyser, vi brugte kunne have opdaget tilstedeværelsen af ​​en bred vifte af gamma retrovirus.

for at bestemme om XMRV kunne forblive i blodet og for at opdage mulige immunreaktioner mod XMRV, vi analyseret evne blodplasma at neutralisere XMRV infektivitet. Vi har registreret kun minimal neutralisation selv under de mest stringente betingelser for inkubering af en lille mængde XMRV med ufortyndet, ikke-varmeinaktiveret plasma. På de fleste, blev 75% af XMRV neutraliseret efter inkubation med plasma, hvilket antyder, at XMRV udskilles til blodet ville have en lang nok halveringstid for at tillade detektion. Faktisk 7 af 21 plasmaprøver analyseret på denne måde viste ≤10% neutralisation (Fig. 1), hvilket indikerer, at humant plasma har ringe medfødte neutraliserende aktivitet mod XMRV. Dette resultat er i overensstemmelse med en tidligere undersøgelse af XMRV neutralisering af sera fra CFS og normale individer, som viste fra 0 til 80% XMRV neutralisation af ufortyndet ikke-varmeinaktiveret sera, og ingen XMRV neutralisering af varmeinaktiveret sera [4], men er uforenelig med flere andre undersøgelser, der påviste relativt høj neutralisering af XMRV af humant plasma eller serum, selv i dem, teste negativ for XMRV af andre kriterier [22] – [24]. F.eks Groom et al. [22] fandt eksempler på 50% neutralisation af virus bærende XMRV env-proteiner ved hjælp af varme-inaktiveret serum ved 1:40 og 1:80 fortyndinger, og de fleste af disse positive resultater var fra kontrolpersoner uden prostatacancer eller CFS. Men de fleste af de positive sera også neutraliserede virus der bærer andre env-proteiner, herunder at vesikulær stomatitis-virus, der viser den neutraliserende aktivitet var generelt ikke-specifik. Zhou et al. [24] fandt -30% neutralisation af virus bærende XMRV Env af en 1:80 fortynding af varme-inaktiveret serum, med tre sera viser -50% neutralisation. Alle andre analyser udført viste, at alle disse emner blev inficerede af XMRV

Flere faktorer kan forklare forskellene i neutraliserende antistof aktiviteter:. I) heparin til stede i serum eller plasma fremstillet af blod opsamlet i hepariniserede rør kan uspecifikt hæmme virus infektivitet, ii) gentagen nedfrysning og optøning af prøver kan inaktivere komplement resulterer i reduceret neutralisering, iii) specifikke virale komponenter af virus, der anvendes til neutralisering undersøgelser kan påvirke resultaterne (fx anvendelse af Gag-proteiner fra HIV eller andre murine retrovira i kombination med XMRV Env [22] – [24]), og iv) cellulære faktorer inkorporeres i virioner under fremstilling af det virus, der anvendes til neutralisering kan påvirke resultatet [25] – [27]. I vores undersøgelse og undersøgelsen af ​​Knox et al. [4], blev autentisk XMRV produceret fra den humane prostatacancer-cellelinie 22Rv1 anvendt i neutraliseringsassays, mens undersøgelser af Groom et al. [22] og Zhou et al. [24] anvendte vira foretaget med Moloney Gag-pol-proteiner og XMRV Env, og blev produceret ved transfektion af humane 293T-celler. Yderligere antigener til stede i de sidstnævnte virus kunne redegøre for nogle af de uspecifikke neutralisering observeret.

Sammenfattende har vi ikke registrerer replikationskompetent XMRV i plasma eller EPS væske fra patienter med prostatacancer, heller ikke gjorde vi registrerer betydelig niveauer af neutraliserende antistoffer i plasma. Disse data understøtter den konklusion fra andre undersøgelser, XMRV ikke er trådt den menneskelige befolkning.

Materialer og metoder

personmotiver

Blod plasma og udtrykte prostata væske (EPS) prøver anvendt i den aktuelle undersøgelse blev opnået ved Cleveland Clinic efter godkendelse af Cleveland Clinic Foundation Institutional Review Board. Alle prøver blev opnået fra individer med prostatacancer efter skriftligt informeret samtykke blev opnået. Plasmaprøver blev fremstillet fra blod opsamlet i standard EDTA-rør, EPS væske blev opnået ved massage af udskårne prostatakirtler efter prostatektomi, og alle prøver blev opbevaret ved -70 ° C. Mange af plasmaprøver blev frosset og optøet en gang til analyse, mens andre blev frosset og optøet et begrænset antal gange (tabel 2).

Cell Culture

M. dunni

tail fibroblaster (dunni celler) [28], 293 humane embryoniske nyreceller [29], 22Rv1 prostatacarcinomceller (ATCC CRL-2505), HTX celler (en tilnærmelsesvis diploid subklon af human HT-1080 fibrosarcomaceller) [ ,,,0],5] og DU145 prostatacancerceller [30] blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium med 4,5 g /l glucose og 10% føtalt bovint serum (FBS). PG-4 katteceller [16] blev dyrket i McCoys medium med 15% FBS. XMRV virus, som benyttes i denne undersøgelse blev høstet fra 22Rv1 celler opnået direkte fra ATCC

S

+ L

-. Og XMRV neutralisationsbestemmelser

PG-4 celler blev podet ved 2,5 × 10

5 pr 6-cm skål på dag 1. på dag 2, plasma og EPS-prøver blev optøet og portioner af hver prøve (eller dyrkningsmedium som et ikke plasma kontrol) blev inkuberet med et lille volumen af ​​infektiøs XMRV (høstet fra 22Rv1 celler) i 15 til 30 minutter ved stuetemperatur, mens de øvrige dele af plasma- og EPS-prøver blev holdt på is. Virus-spiked og ubehandlede prøver blev tilsat til PG-4-celler i nærvær af 4 ug /ml Polybrene. Celler blev fodret på dag 3, og foci blev talt på dag 4 eller 5. I nogle eksperimenter blev plasmaet varmeinaktiveret ved 56 ° C i 30 minutter før analyse for virusneutralisation.

Marker Rescue Assay

dunni og DU145 celler indeholdende LAPSN retroviral vektor (dunni /LAPSN og DU145 /LAPSN celler) blev frembragt ved at eksponere celler til hjælper-fri LAPSN vektor genereret fra PA317 retrovirus pakkende celler [31] og derefter vælge cellerne i G418 i 1 uge for at sikre tilstedeværelsen af ​​vektoren i alle celler i populationer. Markøren redning assay blev udført som følger. Dunni /LAPSN eller DU145 /LAPSN celler blev podet ved 5 × 10

5 pr 6-cm skål på dag 1 og blev udsat for prøver (blod plasma eller EPS) i tilstedeværelse af 4 pg /ml Polybrene på dag 2 . cellerne blev derefter passeret i en måned ved høj densitet (for at lette virusspredning) ved trypsinbehandling og tilsået cellerne ved en 1:10 fortynding, hver gang cellerne blev sammenflydende. LAPSN produktion blev derefter målt ved at fodre sammenflydende celler, høst mediet næste dag, fjerner celler ved filtrering (0,2 um-porestørrelse uden overfladeaktivt celluloseacetatfiltre) eller ved centrifugering (4.000 x g i 15 minutter), ved at tilsætte medium prøver med 4 ug /ml Polybrene at dunni eller 293 celler podet dagen før ved 5 × 10

4 per brønd af 12-brønds plader, og ved farvning af cellerne i AP to dage senere.

virus interferens assay

replikerende virus påvist i markør rednings-analysen blev udsat for interferens analyse ved hjælp dunni celler kronisk inficeret med enten XMRV fra 22Rv1 celler eller med

M. dunni

endogene retrovirus (MDEV) fra dunni celler. På dag 1 blev de inficerede og ikke-inficerede dunni celler podet i 12-brønds retter på 5 × 10

4 per brønd. På dag 2 blev mediet erstattet med 1 ml medium indeholdende 4 ug Polybrene og 0,1 ml medium høstes fra markering rednings assay celler. På dag 4 blev cellerne farvet for AP. De MDEV-inficerede dunni celler er resistente over for MDEV men eftergivende til XMRV mens XMRV-inficerede dunni celler er resistente over for XMRV men eftergivende til MDEV.

Tak

Vi takker Christina Gaughan (Cleveland) for ekspert teknisk bistand.