PLoS ONE: I modsætning bugspytkirtelkræftceller Bugspytkirtelkræft associerede fibroblaster Display Minimal Gene Induktion efter 5-Aza-2′-Deoxycytidine

Abstrakt

Formål

Cancer forbundet stromale fibroblaster (CAFS) gennemgår transkriptionel og fænotypiske ændringer, der bidrager til tumorprogression, men de mekanismer, der er ansvarlige for disse ændringer er ikke godt forstået. Aberrant DNA methylering er en vigtig årsag til transkriptionelle ændringer i kræftceller, men det vides ikke, hvor vigtig DNA methylering ændringer er til CAF adfærd.

Eksperimentel Design

Vi brugte Affymetrix exon arrays til at sammenligne gener induceret af DNA-methylering inhibitor 5-aza-dC i dyrkede bugspytkirtelkræft forbundet fibroblaster, pancreas kontrol fibroblaster og kræft i bugspytkirtlen cellelinjer.

Resultater

Vi fandt, at pancreas CAF og styre pancreas fibroblaster var mindre lydhøre over for 5-aza-dC-medieret gen reaktivering end bugspytkirtelkræftceller (gennemsnit +/- SD af gener induceret ≥5 gange var 9 ± 10 gener i 10 pancreas CAF kulturer, 17 ± 14 gener i 3 kontrol bugspytkirtlen fibroblastkulturer, og 134 ± 85 gener i 4 bugspytkirtelkræft cellelinjer). Vi undersøgte differentielt udtrykt gener mellem CAF og kontrol fibroblaster til kandidat methylerede gener og identificeret disintegrin og metalloprotease,

ADAM12

så hypomethylated og overudtrykt i pancreas CAF linjer og overudtrykt i fibroblaster støder op til primære bugspytkirtlen adenokarcinomer.

konklusioner

i forhold til bugspytkirtelkræftceller, er få gener reaktiveres ved DNMT1 hæmning i pancreas CAF tyder disse celler ikke havnen mange funktionelt vigtige ændringer i DNA-methylering. CAF kan heller ikke være meget lydhøre over for terapeutisk målrettet med DNA methylering hæmmere

Henvisning:. Yu J, Walter K, Omura N, Hong S-M, Young A, Li A, et al. (2012) I modsætning til bugspytkirtelkræftceller Bugspytkirtelkræft associerede fibroblaster Display Minimal Gene Induktion efter 5-Aza-2′-deoxycytidin. PLoS ONE 7 (9): e43456. doi: 10,1371 /journal.pone.0043456

Redaktør: Brock C. Christensen, Geisel School of Medicine ved Dartmouth, USA

Modtaget: April 10, 2012; Accepteret: 24 juli 2012; Udgivet: 11 september, 2012 |

Copyright: © Yu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Cancer Institute tilskud (CA62924 og RC2148346), og Michael Rolfe Foundation. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Epigenetisk ændringer i genekspression er et grundlæggende træk ved cancerceller [1]. En af de bedst karakteriserede epigenetiske ændringer er DNA-methylering. DNA methyleringsmønstre er arvelige og opretholdes efter celledeling hovedsageligt af DNA methyltransferase Dnmt1. Afvigende DNA hypermethylering ofte sker på CpG øer i genpromotorer og er forbundet med en lukket kromatin tilstand og gen-undertrykkelse. Betydelig evidens for, at afvigende hypermethylering og gendæmpning af tumor undertrykkere og andre regulatoriske gener bidrager til udviklingen af ​​pancreas og andre kræftformer [2]. Afvigende hypometylering af normalt methylerede og bragt til tavshed gener er også blevet beskrevet i bugspytkirtlen og andre kræftformer som en årsag af afvigende gen overekspression [3], [4].

De mekanismer, der er ansvarlige for disse afvigende methylering mønstre i kræftformer er ikke godt forstået, men formodede mekanismer omfatter overekspression af

DNMT1

, ophobning af DNA methylering ændringer med alderen [5], [6] og miljømæssige påvirkninger [7], ændret aktivitet af

de novo

methylering enzymer

DNMT3a

DNMT3b

[8], [9], og eventuelt fra ændrede cellulære mikromiljø såsom fra kronisk inflammation [3], [10].

ikke neoplastiske stromale celler i tumormikromiljøet undergår også transkriptions- og andre fænotypiske ændringer i forhold til normale celler, der menes at bidrage til tumorudvikling. Pancreas cancer er en dødelig sygdom [11] og er kendt for sit omfattende desmoplastiske stromal respons omfatter en gennemsnitlig 75% af cellerne i tumormassen [12]. Der er mistanke om, at det stromale komponent bidrager til modstand pancreascancer til lægemiddelbehandlinger [13], og flere undersøgelser implicerer forskelle i stromale adfærd med patient resultat i bugspytkirtlen og andre kræftformer [14], [15], [16], [ ,,,0],17], [18]. Cancer forbundet fibroblaster (CAFS), den dominerende celletype i det stromale mikromiljø, vedtage en aktiveret fænotype under tumorigenese, undergår morfologisk, funktionelle og genekspression skifter i forhold til normale fibroblaster [19]. Disse aktiverede CAF er kendetegnet ved α-glat-muskel-actin (α-SMA) ekspression [20], forbedret kontraktile og sekretorisk evne, og øget syntese af collagener, ekstracellulære matrixproteiner [21] samt vækstfaktorer, herunder epitelvækstfaktor, platelet- afledte vækstfaktorer (PDGF), basisk fibroblastvækstfaktor, hepatocytvækstfaktor, og transformerende vækstfaktor beta (TGF-β) [22]. Gennem disse og andre signaler, CAF interagerer intimt med tumorceller til at fremme deres vækst, og derfor CAF er af stor interesse som et terapeutisk mål. Faktisk vil nylige strategier målrette CAF indbefatter anvendelsen af ​​kinaseinhibitor, imatinib at blokere stromal PDGF-receptorer [23], antistoffer til at blokere vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) afledt af både cancerceller og CAF at inhibere tumor angiogenese [24] og brugen af ​​glittesinden (Markedsobservatoriet) inhibitorer til at blokere tumor-stromale Hedgehog signalering og nedbryder stromale fibroblaster, der overudtrykker pindsvinet (Hh) receptor Smo [25], [26], [27], [28]. At indledende forsøg med smoothened inhibitorer i pancreascancer viste ikke tegn på gavn understreger behovet for grundlæggende studier der undersøger tumor stromale interaktioner. En anden potentiel fordel ved at målrette kræft stroma er at forbedre adgangen til lægemidler til bugspytkirtelkræftceller. For eksempel lægemidlet nab-paclitaxel (Abraxane), en nanopartikel formulering af paclitaxel, binder til Sparc, en stromal matrixprotein ofte højt udtrykt i bugspytkirtelkræft stroma, som medierer tumor stromale interaktioner, hvorved potentielt forbedres lægemiddeladministration til tumoren [29] , [30]. Kliniske forsøg med Abraxane i bugspytkirtelkræft lovende og i dyremodeller er der tegn på, at levering af gemcitabin til tumoren er forbedret med Abraxane, og med pindsvin hæmmere [25]. Effekten af ​​kombinationen Gemcitabin /Abraxane stof afventer stadig resultaterne af kliniske fase 3 studier.

indflydelse CAF på vækst kræft er blevet påvist i mange undersøgelser [31], [32] men de molekylære mekanismer, der ligger bag CAF fænotype er ikke godt forstået. Selv om en stor indflydelse på CAF er mistænkt for at være tumor mikromiljø, herunder påvirkninger fra kræftcellerne selv, CAF bevarer deres tumorfremmende egenskaber

in vitro

efter langvarig cellekultur [33], hvilket tyder på, at arvelige mekanismer er ansvarlige . Selvom genetiske ændringer i CAF er blevet beskrevet, har nyere undersøgelser, der undersøger muligheden for, at CAF gennemgår klonale genetiske ændringer ligner kræftceller fundet noget bevis for sådanne ændringer [33], [34], [35], [36], [37 ], [38]. I mangel af udbredte genetiske mutationer, er det rimeligt at formode, at epigenetiske mekanismer såsom DNA methylering, som er mitotisk arvelige, er ansvarlige for de stabile genekspression ændringer i CAF. Faktisk flere gener impliceret i tumor-stromale interaktioner og induceret i CAF ved cokultur med kræftceller, såsom

SPARC

[29], [30],

COX-2

og matrix-metalloproteinaser (MMP’er) [39] er reguleret af DNA-methylering. Endvidere er CAF underkastes de samme påvirkninger i tumormikromiljøet, som menes at bidrage til methylering ændringer i cancerceller, såsom kronisk inflammation [34].

heterogenitet CAF fra forskellige tumorer og selv inden for samme tumor [14], [30] foreslår også, at CAF har flere kilder, som kunne bidrage til epigenetiske forskelle. Ud over aktivering af residente fibroblaster i tumormikromiljøet, nogle CAF er knoglemarvafledte mesenchymforstadieceller [40], [41] og måske epiteliale eller endotelceller undergår mesenkymale overgang [21], [42]. Fordi disse differentiering og transdifferentiering processer reguleres af epigenetiske mekanismer [43], CAF, der stammer fra forskellige kilder har forskellige epigenetiske og transkriptionelle profiler i forhold til deres bopæl væv modstykker.

Kun få undersøgelser er begyndt at udforske epigenetiske mekanismer for disse transkriptionelle ændringer i CAF. En af de første undersøgelser for at dokumentere DNA methylering forskelle mellem normale og tumorassocierede stromale celler tog en genom-dækkende tilgang med methylering specifik digital karyotypebestemmelse (MSDK) at profilere epitelceller, myoepitelcellerne og stromale fibroblaster under bryst tumor progression [35] . En anden tilgang, der kombinerer laser capture mikrodissektion med methylering specifik PCR (MSP) af kandidatgener identificeret hyppig promotor methylering af

GSTP1

og

RARB2

i prostata tumor-associerede stromaceller i forhold til normal prostata stromale celler [ ,,,0],44]. En tredje tilgang med methylering-sensitive SNP array analyse (MSNP) viste fokale gevinster i methylering og global hypometylering i gastriske cancerassocierede myofibroblaster [36].

En nyttig strategi til at identificere methylering begivenheder er at udføre et gen reaktivering screen anvendelse af DNA methylering inhibitorer, såsom 5-aza-2′-deoxycytidin (5-aza-dC), som selektivt målretter DNMT1 enzym til udtynding. Denne fremgangsmåde har den fordel, at identificere de DNA methylering ændringer, der regulerer transkription og derfor mere tilbøjelige til at være funktionelt vigtig. Selv om denne fremgangsmåde med succes har identificeret methylering begivenheder i cancerceller fra flere tumortyper [45] Så vidt vi ved denne fremgangsmåde ikke er blevet anvendt til at identificere gener reguleres ved methylering i CAF. For at bestemme om DNA-methylering er ligeledes vigtige regulatorer af genekspression ændringer i CAF som for cancercellelinjer, udførte vi en genom-dækkende reexpression analyse af humane pancreatiske cancerassocierede fibroblaster og pancreatiske cancercellelinier anvendelse af 5-aza-dC.

Materialer og metoder

Kultur cellelinier

Primære kulturer af stromale fibroblaster, der er udpeget kræft forbundet fibroblaster (CAF) CAF9, CAF11, CAF12, CAF13, CAF14, CAF15, CAF16, CAF18, CAF19, CAF20, CAF21, CAF22, CAF25, og CAF35 blev etableret fra kirurgisk resektion bugspytkirtelkræft væv fra 13 patienter (6 hanner middel ± standardafvigelse (SD) alder af 58 ± 7 år) med klinisk sporadisk pancreas duktalt adenokarcinom. De cancerformer var alle moderat til dårligt differentieret med en gennemsnitlig tumorstørrelse på 3,5 cm. Disse primære CAF kulturer blev etableret som beskrevet tidligere [27], som var to hTERT-udødeliggjort kontrol fibroblaster (SC2 og SC3, der er etableret fra kirurgisk resektion ikke-neoplastisk bugspytkirtlen væv fra 2 hunner (gennemsnitsalder, 63 år) [27]. Den udødeliggjort human pancreas Nestin-udtrykkende (HPNE) cellelinje blev generøst tilvejebragt af Dr. Michel Ouellette (University of Nebraska Medical center) [46]. Fire bugspytkirtelkræft cellelinjer, herunder A32-1, Panc2.8, Panc3.014 og Panc215 etableret fra primære pancreatiske ductale adenocarcinomer i vores institution og tidligere beskrevne [47] blev også anvendt i denne undersøgelse Alle cellelinier blev opretholdt i DMEM (4,5 mg /ml glucose, Invitrogen). indeholdende 10% FBS under standardbetingelser som tidligere beskrevet [48] . Alle undersøgelser blev udført med godkendelse fra Johns Hopkins udvalg for Clinical Investigation.

5-aza-dC behandling og RNA-ekstraktion

celler blev udsået på 2 × 10

5 celler pr T75 kolbe og behandlet den følgende dag med en pmol /L 5-aza-2′-deoxycytidin (5-aza-dC, Sigma) [49] i 4 dage under den eksponentielle vækstfase, med en ændring af medier og stof hver 24 timer. På dag 5, når cellerne var nær-sammenflydende, blev de vasket med kold PBS og totalt RNA isoleret ved anvendelse af et Qiagen (Qiagen) eller Mirvana miRNA kit (Ambion) ifølge producentens instruktioner som tidligere [50] beskrevne.

Exon array og udvælgelse af gener for validering

Affymetrix GeneChip menneskelige Exon 1.0ST Array platform blev brugt til at analysere genekspressionsmønstre i ubehandlet og 5-aza-dC behandlede fibroblaster og kræft cellelinjer, som tidligere beskrevet [27]. Vi er i overensstemmelse med den Minimum oplysninger om en Microarray Eksperiment retningslinjer og har afgivet vores microarray data sat til Gene Expression Omnibus repository (GEO tiltrædelse # GSE20911).

Kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR)

1 pg totalt RNA blev revers transkriberet i overensstemmelse med producentens instruktioner (Invitrogen). Det resulterende cDNA blev amplificeret på en ABI 7300 Real-Time PCR thermocycler under anvendelse SYBR GREEN PCR Master Mix og anbefalede PCR-betingelser (Applied Biosystems). Husholdning gen

GAPDH

blev brugt til normalisering. Primerspecificitet blev bekræftet ved smeltekurveanalyse. Resultater udtrykkes som normaliserede ekspressionssystemer værdier i forhold til den angivne cellelinie (= 2

-ΔΔCt). Alle PCR-reaktioner blev udført tre gange. Primere sekvenser er som følger:

Stratifin

RTsense: 5′-TCTGATCCAGAAGGCCAAG-3 ‘;

Stratifin

RTantisense: 5′-GTTTCGCTCTTCGCAGGAG-3 ‘;

TKTL1

RTsense: 5′-AGCTCCGGCCACCCTACATCATG-3 ‘;

TKTL1

RTantisense: 5′-TGCCACATCCACAAACGACAGTCT-3 ‘;

ADAM12

RTsense: 5′-AAATGAAGGTCTCATTGCCAG-3 ‘;

ADAM12

RTantisense: 5′-AGAATTACCCGTGTAATTTCGAG-3 ‘;

GAPDH

RTsense: 5′-CAACAGCCTCAAGATCATCAG-3 ‘;

GAPDH

RTantisense: 5′-ACTGTGGTCATGAGTCCTTC-3 ‘.

Bisulfite Sequencing

status methylering af de 5′ CpG øer af kandidatgener blev bestemt ved bisulfit sekventering. Bisulfit modifikation og PCR blev udført som tidligere beskrevet [51]. Bisulfit Modificerede sekventering (BMS) primere var som følger:

TKTL1

BMS frem: 5′-TGTGTAGAGAAAGAAGATTTTGTATT-3 ‘,

TKTL1

BMS omvendt: 5′-CCCTTTAAAATCTAAAAACCCACTC-3′, og intern sekventering primer

TKTL1

BMS-Seq: 5′-GATTGTAGGAGAGAAGATGAG-3 ‘;

ADAM12

BMS frem: 5′-TTTAGTTTTAGTTTGAAAAGTTGGA-3 ‘,

ADAM12

BMS omvendt: 5′-CTAAACTCTTCTAACCTTTCAT-3′, og intern sekventering primer

ADAM12

BMS-Seq : 5′-TTCTAACACAAACCAACCTTAACC-3 ‘. Oprensede produkter blev sekventeret ved Johns Hopkins Core Sequencing Facility.

Western blot-analyse af DNMT1 Expression

Western blot-analyse blev udført under anvendelse af lysater af ubehandlet eller 5-aza-dC-behandlede HPNE eller CAF12 celler. En Bradford assay blev anvendt til at estimere proteinkoncentration, under anvendelse af bovint serumalbumin (BSA, Invitrogen) som en standard. Lige store mængder protein (40 ug pr bane) blev adskilt ved 4-12% gradient SDS-gelelektroforese (Invitrogen), overført til nitrocellulosemembraner og inkuberet i blokerende opløsning (5% mælk i TBS med 0,1% Tween 20) i 30 minutter . Membraner blev inkuberet i 60 minutter med et anti-DNMT1 polyklonalt antistof (generøst tilvejebragt af Dr. Bill Nelson, JHU) ved 1:200 fortynding eller et monoklonalt antistof mod GAPDH (Cell Signaling, Danvers, MA) ved 1:2000 fortynding. Sekundære HRP-linked antistoffer (Santa Cruz Biotechnology, og Amersham Biosciences) blev anvendt ved 1:2000 fortynding og proteiner påvises ved hjælp af en ECL kit (Amersham Biosciences).

pancreasadenocarcinom Tissue Microarrays og ADAM12 Immunhistokemi

ekspressionen af ​​ADAM12 protein blev undersøgt ved anvendelse af immunhistokemiske (IHC) mærkning af formalinfikserede, paraffinindlejrede væv microarrays (TMAs) under anvendelse af en DAKO Autostainer (DAKO, Carpinteria, CA). Fire TMA’er indeholder i alt 72 forskellige kirurgisk resektion pancreas ductusceller adenokarcinomer og tilsvarende normale pancreas væv blev konstrueret som tidligere beskrevet [29]. ADAM12 IHC-farvning blev udført som tidligere beskrevet [29] under anvendelse af et kanin-anti-humant ADAM12 antistof (A2601, Sigma) ved en 1:100 fortynding og en 60 minutters inkubationstid. Mærkning blev udført ved hjælp af Envision-Splus Detection Kit (DAKO).

Statistisk analyse

Beskrivende statistiske værdier og grunde blev genereret ved hjælp af Microsoft Excel-pakke eller Partek® Genomics Suite ™ v6.3 beta . Robust multichip Gennemsnit (RMA) blev anvendt til at normalisere de rå intensitet målinger af alle probesæt. Genekspression værdier blev derefter opnået ved anvendelse af et-trins Tukeys biweight metode. To-vejs ANOVA blev udført for at identificere væsentlige udtryk ændringer mellem ubehandlet og 5-aza-dC-behandlede fibroblaster eller kræft cellelinjer, eller mellem CAF og kontrol fibroblaster. Forskelle blev betragtet som signifikante ved

P

0,05, og rapporterede værdier er middelværdier ± SD

Resultater

Global genekspression analyse af humane pancreas fibroblaster og kræft cellelinjer behandles. med 5-aza-dC

Vi har etableret primære pancreas CAF kulturer og kontrol fibroblastkulturer som beskrevet tidligere [38]. Brug global genekspression profilering, vi tidligere identificeret genekspression forskelle i bugspytkirtlen CAF forhold til kontrol fibroblaster [27]. Hierarkisk klyngedannelse af genekspressionsprofilerne af ubehandlede CAF og kontrol-fibroblaster er tilvejebragt i figur S1. Mistanke om, at disse ændringer i genekspression blev delvist medieres af ændringer i DNA-methylering, sammenlignede vi genekspressionsprofilerne af CAF og kontrol fibroblastkulturer før og efter behandling med 5-aza-dC ved anvendelse af Affymetrix Exon Arrays (ST 1.0) (CAF11, CAF12, CAF13, CAF15, CAF16, CAF18, CAF19, CAF22, CAF25, og CAF35 for CAFS HPNE, SC2, og SC3 til kontrol fibroblastceller, henholdsvis)

Vi først bekræftet 5-aza-dC udtynding. af Dnmt1 enzym ved Western blot. 5-aza-dC behandling af HPNE og CAF12 celler resulterede i nedbrydning af Dnmt1 protein ved 1 uM koncentrationer, men ikke GAPDH kontrolprotein (figur 1). For yderligere at undersøge effekten af ​​5-aza-dC koncentrationer, vi sammenlignet antallet af gener induceret af 1 uM og 10 uM 5-aza-dC i yderligere to CAF, CAF19 og CAF35, og fandt ingen større forskel i antallet af gener induceret mellem disse medikamentkoncentrationer (data ikke vist). Vi brugte derfor 1 pM koncentrationer af 5-aza-dC at behandle hver CAF. Vi behandlede CAF celler i 4 dage, da dette var tilstrækkelig varighed til celleproliferation. Længere behandlinger (i 5-7 dage) ofte resulteret i CAF vokser til konfluens (data ikke vist). I overensstemmelse med dette udførte vi proliferationsassays på CAF19 ved forskellige 5-aza-dC-koncentrationer (0 um, 1 um, 5 um, 10 um og 20 um) og fandt, at væksten blev ikke signifikant påvirket ved 1 uM koncentration vi ansat (Figur S2).

DNMT1 protein er brugt (i forhold til GAPDH) i 5-aza-dC behandlede HPNE og CAF12 celler.

Efter at have sammenlignet udtrykket profiler af hver CAF før og efter 5-aza-dC behandling, vi først identificeret gener, der blev opreguleres af en samlet fold-change gennemsnit ≥2.0 i alle ti 5-aza-dC-behandlede CAF forhold til ubehandlede CAF. Vi valgte en 2-fold cut-off som mere beskedne forskelle i RNA blev anset mere tilbøjelige til at være relateret til eksperimentel variation. Da vi var interesserede i at identificere gener tavshed i CAF, hvis ekspression blev induceret med 5-aza-dC, vi så udelukkede den delmængde af gener, der blev udtrykt i ubehandlede CAF. Dette kriterium identificeret 42 kandidatgener (tabel 1).

For yderligere at bekræfte den 5-aza-dC medieret gen induktion vi udførte QRT-PCR på genet

Stratifin

(14- 3-3 sigma) og

Transketolase-lignende protein 1 Hotel (

TKTL1

), fordi deres udtryk er reguleret af methylering i andre celletyper og exon array analyse identificeret deres udtryk som induceret af 5- aza-dC [52] [53]. I overensstemmelse med exon vifte resultat,

stratifin

(

SFN

) mRNA niveauer var lave eller målbart i alle ubehandlede fibroblaster (CAF og kontrol fibroblaster) og forøget ekspression af

SFN

mRNA blev påvist i de fleste af de 5-aza-dC behandlede fibroblaster (fig. 2 A og B). Vi observerede næsten fuldstændig methylering af

SFN

promotorregion i alle CAF af bisulfit sekventering (data ikke vist). Tilsvarende

TKTL1

mRNA-niveauer var upåviselige i næsten alle ubehandlede fibroblaster undtagen SC2 celler, og forøget ekspression af

TKTL1

blev påvist i de fleste af de 5-aza-dC behandlede fibroblaster (fig. 2 C). I overensstemmelse hermed fandt vi bevis for methylering af 5 ‘CpG’er af

TKTL1

i fibroblaster efter MSP (data ikke vist). Bisulfit sekventering af 18 CpG sites opstrøms for

TKTL1

transkriptionsstartstedet (fig. 2 D) viste, at alle eller de fleste bindingssteder for CpG var fuldt methyleret i de ikke-udtrykkende fibroblastlinier, HPNE og SC3 og CAF19 og CAF25 (fig. 2 E). I modsætning hertil

TKTL1

udtrykkende linje, SC2, manglede methylering af mange af disse steder, understøtter en rolle for DNA methylering i reguleringen af ​​

TKTL1

udtryk. Vi identificerede også opregulering af

DAZL

ANXA3

(data ikke vist), gener tidligere rapporteret at være fremkaldt af 5-aza-dC [36],

NDN

, rapporteres at være præget [54], og

MT1G

, rapporteres at methyleres i andre kræftformer [55].

(A) Affymetrix exon array analyse af

SFN

mRNA-ekspression i fem pancreas CAF før (grøn) og efter (rød) 5-aza-dC behandling. (B) og (C) Kvantitativ RT-PCR-analyse af

SFN

og

TKTL1

mRNA udtryk i forhold til

GAPDH

mRNA i pancreas fibroblastkulturer før (blå søjler) og efter (røde søjler) 5-aza-dC behandling. Hvert assay blev udført tre gange. Dataene er hjælp af tre uafhængige forsøg; barer er SD-værdier. (D) Top:

TKTL1

gen struktur og fordeling af CpG-dinukleotider. Korte lodrette søjler repræsenterer CpG sites. Pil peger på transkriptionel startsted. Herunder: bisulfit genomisk sekventering analyse i pancreas CAF og kontrol fibroblaster. Åbne cirkler repræsenterer umethylerede CpG sites, massive sorte cirkler methylerede CpG sites, og udklækket kredse delvist methylerede CpG sites. (E) bisulfit sekventering kromatogrammer af

TKTL1

promotor i en pancreas CAF (CAF19) og kontrol fibroblastlinier (HPNE og SC2). Pile peger på cytosinrester.

Vi undersøgte RNA profiler til at bestemme, om der var nogen differentierede svar på 5-aza-dc i CAF forhold til at styre fibroblaster. Femogtredive af de 42 gener induceret i CAF med 5-aza-dc (tabel 1) blev også induceret i en eller flere af kontrollen pancreatiske fibroblastlinier indikerer, at kun få om nogen gener selektivt og konsekvent opreguleret med 5-aza-dC i CAF.

DAZL

var den mest inducerede gen i fire CAF (CAF12, CAF15, CAF16, og CAF19) og var blandt de ti bedste gener induceret i to CAF (CAF18 og CAF22) og en kontrol fibroblast (HPNE) ( data ikke vist). Vi udførte hierarkisk klyngedannelse af generne induceret af 5-aza-dC i CAF og kontrolforanstaltninger fibroblaster at bestemme, om der var observerbare forskelle i den overordnede mønstre af gen respons til 5-aza-dC, men der var ingen clustering af fibroblast klasse (figur S3). Fem af de syv CAF grupperet sammen, de andre to CAF klyngedannelse med kontrol fibroblaster.

Yderligere bevis for denne mangel på gener tavshed ved DNA methylering i CAF kommer fra en vurdering generne underexpressed i CAF. Vi identificerede gener, som blev underexpressed med en middelværdi på ≥4.0-fold i alle CAF forhold til pancreas kontrol fibroblaster (tabel S2). Især var der ingen overlapning mellem denne liste over 86 underexpressed gener og generne induceret af en middelværdi på 2 gange med 5-aza-st i CAF (Tabel 1). Disse data indikerer, at nogle eventuelle gener konsekvent underexpressed i CAF er bragt til tavshed ved hjælp af DNA methylering.

Identifikation af kandidatgener for hypometylering analyse

Vi har tidligere identificeret 200 gener, såsom

SMO

, opreguleret i bugspytkirtlen CAF forhold til pancreas kontrol fibroblaster [27]. For at identificere kandidat hypomethylated gener i CAF, vi fusionerede denne liste af gener overudtrykt i pancreas CAF med listen over 581 gener induceret af ≥3.0 fold i mindst en fibroblast cellelinie ved 5-aza-dC behandling. Dette kriterium identificeret 49 kandidatgener (tabel S1) hvoraf nogle kan være reguleret af methylering, og potentielt hypomethylated i pancreas CAF forhold til kontrol fibroblaster.

5-aza-dC behandling af humane pancreas CAF, kontrol fibroblaster og cancer cellelinjer

Vi næste sammenlignet svarene fra CAF og kontrol fibroblaster til 5-aza-dC med svarene fra bugspytkirtelkræft cellelinjer. Vi genererede et individuelt gen liste for hver fibroblast linie eller cellelinie og derefter talt det samlede antal gener induceret ved ≥5 gange i hver linje (figur 3). Vi sammenlignede derefter det gennemsnitlige antal gener fremkaldt af ≥5 gange ved 5-aza-dC i de ti CAF, de tre kontrol fibroblast linjer, og de 4 bugspytkirtelkræft cellelinjer. Signifikant færre gener blev induceret med 5-aza-dC i CAF end i bugspytkirtelkræft cellelinier (

P

= 0,0009). Antallet af gener induceret ved ≥5 gange i de ti CAF var kun 9 ± 10 gener (gennemsnit +/- standardafvigelse) sammenlignet med 17 ± 14 gener induceret ved ≥5 gange i de tre pancreas kontrol fibroblaster og 123 ± 86 gener fremkaldt af ≥5 gange i de 4 bugspytkirtelkræft cellelinier (Figur 3). Der var ingen signifikant forskel i antallet af gener induceret ved ≥5.0 fold i CAF og i pancreas kontrol-fibroblaster. For at sikre, at vi havde valgt en rimelig fold-change cutoff til sammenligning sammenlignede vi også antallet af gener induceret ved ≥3 gange. Der blev også observeret Tilsvarende forskelle: Antallet af gener induceret ≥3 gange ved 5-aza-dC blev 83 ± 47 gener induceret i kontrol fibroblaster og 48 ± 42 gener induceret i CAF og 430 ± 271 gener i pancreas cancer cellelinier (

P

= 0,0006 for CAF i forhold til kræft cellelinjer). Der var ingen signifikante forskelle i relation til patientens alder eller køn i antallet af gener induceret af 5-aza-dC.

Et gennemsnit på 123 ± 86 gener blev induceret 5 gange eller mere med 5-aza-dC behandling i fire bugspytkirtelkræft cellelinjer, 9 ± 10 gener i ti pancreas CAF (

P

= 0,0009) og 17 ± 14 gener i tre kontrol pancreas fibroblastlinier.

Differential methylering af kandidat hypomethylated gen ADAM12

Vores analyse af gener selektivt opreguleres med 5-aza-dC i CAF gav ingen gener vides at være reguleret af DNA methylering der påvirker stroma fibroblast adfærd. Vi undersøgte også vores lister af gener udtrykkes forskelligt i CAF i forhold til at styre pancreas fibroblaster for kandidater, der påvirker tumor /stromale interaktioner. En kandidat overudtrykt i CAF var

ADAM12

.

ADAM12

(a disintegrin og metalloprotease 12), en regulator af celle-celle- og celle-matrix-interaktioner, overudtrykkes i cancerassocierede fibroblaster og er impliceret i tumorudvikling [56]. Vi bekræftede første opregulering af

ADAM12

mRNA i CAF i forhold til kontrol-fibroblaster under anvendelse af kvantitativ RT-PCR. I overensstemmelse med vores exon vifte resultat (fig. 4a),

ADAM12

mRNA blev stærkt overudtrykt i bugspytkirtlen kontrol fibroblast afledt af en pancreatitis eksemplar (SC3) og ni CAF i forhold til kontrol fibroblaster HPNE og SC2 (fig. 4b).

(A) Affymetrix exon array analyse af

ADAM12

mRNA-ekspression i pancreas CAF og kontrol fibroblaster. (B) Kvantitativ RT-PCR-analyse af

ADAM12

mRNA-ekspression i pancreas CAF og kontrol fibroblaster efter normalisering til

GAPDH

niveauer. Hvert assay blev udført tre gange. Dataene er hjælp af tre uafhængige forsøg; barer er SD værdier.

For at afgøre, om

ADAM12

blev forskelligt methyleret i CAF forhold til at styre fibroblaster, vi udførte hydrogensulfit sekventering af

ADAM12

gen promotor i 9 CAF og 3 kontrolpunkter fibroblastlinier. Vi amplificerede en 481 bp region opstrøms for

ADAM12

transkriptionsstartstedet indeholdende 38 CpG sites (figur 5a). Bisulfit sekventering afslørede, at 29 af 38 (76%) CpG sites var fuldt methyleret i kontrolgruppen fibroblast linie HPNE (figur 5b). Derimod seks af ni CAF (CAF12, CAF14, CAF15, CAF16, CAF20, og CAF22) var helt (100%) umethyleret på alle CpG sites. De resterende CAF var delvis methyleret ved 2 til 7 af 38 CpG sites og fuldt ikke-methyleret på alle andre CpG’er (figur 5A). Kontrolsekvenserne fibroblaster SC2 og SC3 var fuldt methyleret ved CpG’er nær 5′-enden af ​​det sekventerede region og delvist methyleret ved CpG’er nær 3′-enden af ​​denne region. De var fuldt methylerede på alle andre CpG’er. Der var således relativ hypometylering på flere CpG’er mellem fibroblaster, der udtrykte

ADAM12

og dem, der ikke gjorde det, implicerer afvigende hypometylering af

ADAM12

som en mekanisme for sin overekspression i pancreas CAF i forhold til kontrol pancreas fibroblaster

(A) Top:.

ADAM12

gen struktur og fordeling af CpG-dinukleotider. Korte lodrette søjler repræsenterer CpG sites. Pil peger på transkriptionel startsted. Herunder: bisulfit genomisk sekventering analyse i pancreas CAF og kontrol fibroblaster. Åbne cirkler repræsenterer umethylerede CpG sites, massive sorte cirkler methylerede CpG sites, og udklækket kredse delvist methylerede CpG sites. (B) bisulfit sekventering kromatogrammer af

ADAM12

promotor i en pancreas CAF (CAF19) og kontrol fibroblast linje (HPNE). Pile peger på cytosinrester.

For at afgøre, om ADAM12 protein blev overudtrykt i stroma af primære pancreas adenocarcinomer, vi udførte immunhistokemi på væv microarrays. Mens ADAM12 proteinekspression blev ikke påvist i fibroblaster omgiver normale pancreas kanalen (figur 6b), CAF af primære pancreatiske adenocarcinomer var positive for ADAM12 proteinekspression (figur 6C).