PLoS ONE: differentielt udtrykte Androgen-regulerede gener i Androgen-Følsomme Væv Reveal Potentielle Biomarkører fra tidlige Prostata Cancer

Abstrakt

Baggrund

Flere oplysninger favorisere androgen receptor konsekvenser i prostatakræft initiering gennem induktion af flere gen-aktivering. Formålet med undersøgelsen er at identificere potentielle biomarkører til tidlig diagnosticering af prostatacancer (PSA) blandt androgen-regulerede gener (ARG) og evaluere sammenlignende ekspression af disse gener i normale prostata og normale prostata-relateret androgensensitive væv, der ikke (eller sjældent) give anledning til kræft.

Metoder

ARG blev udvalgt i ikke-neoplastisk voksne humane prostata-epitel RWPE-1 celler stabilt udtrykker en exogen human androgen receptor, ved hjælp af RNA-microarrays og validering af QRT-PCR. Ekspression af 48 forudvalgte gener blev kvantificeret i vævsprøver (sædblærer, prostata overgangszoner og prostatacancer, benign prostatahypertrofi opnået fra kirurgiske prøver) ved hjælp TaqMan® lav massefylde arrays. De diagnostiske opførelser af disse potentielle biomarkører blev sammenlignet med gener kendt for at være forbundet med PCa (dvs. PCA3 og DLX1).

Resultater og Diskussion

ved at krydse udtryk studier i 26 matchede PCa og normal prostata overgangszone prøver, og 35 matchede sædblæren og PCA prøver blev 14 gener identificeret. Tilsvarende blev 9 gener overudtrykt i 15 benign prostatahypertrofi prøver sammenlignet med PSA prøver. Samlet set valgte vi 8 gener af interesse for at evaluere deres diagnostiske præstationer i forhold til den af ​​PCA3 og DLX1. Blandt dem, 3 gener: CRYAB, KCNMA1 og SDPR blev overudtrykt i alle tre referencepunkter ikke-kræft væv. Arealerne under ROC kurver af disse gener nåede de af PCA3 (0,91) og DLX1 (0,94).

Konklusioner

Vi identificerede ARG med reduceret udtryk i PCa og med betydelige diagnostiske værdier for at skelne mellem cancerøse og ikke-kræft prostatavæv, lignende den af ​​PCA3. På grund af deres udtryk mønster, kunne de betragtes som potentielt beskyttende mod prostatakræft. Desuden kunne de være et supplement til kendte gener overudtrykt i PCa og inkluderet sammen med dem i multiplex diagnostiske værktøjer

Henvisning:. Altintas DM, Allioli N, Decaussin M, de Bernard S, Ruffion A, Samarut J, et al. (2013) differentielt udtrykte Androgen-regulerede gener i Androgen-Følsomme Væv Reveal Potentielle biomarkører for tidlig prostatakræft. PLoS ONE 8 (6): e66278. doi: 10,1371 /journal.pone.0066278

Redaktør: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Italien

Modtaget: Februar 14, 2013; Accepteret: 3 maj 2013; Udgivet: 28 juni 2013

Copyright: © 2013 Altintas et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra den franske League mod Kræft under programmet “Equipe Labellisée”, af National Cancer Institute (INCA) og de nationale og regionale Cancer programmer. DA var en modtager af en ph.d.-stipendium fra det franske Undervisningsministeriet, forskning og teknologi (MENRT Grant). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Baggrund

Prostatacancer (PCA) er hos mænd den mest udbredte cancer og den anden førende dødsårsag [1]. Nuværende diagnosen er baseret på histologisk undersøgelse af prostata nål-core biopsier. Øget serum PSA (prostata specifikt antigen) er almindeligt anvendt af læger, men ikke specifikt, for at beslutte prostata biopsier og afsløre prostatakræft [2]. Faktisk kan godartet prostatahypertrofi (BPH) og andre ikke-kræft prostata tilstande, såsom akut eller kronisk prostatitis, hæve PSA niveauer. Dette fører til unødvendige prostata biopsier da mere end 60% af biopsier foreslået af PSA-test i sidste ende slå op negativ. Hertil kommer, at PSA-test ikke skelne klinisk signifikant fra indolente tumorer, hvilket resulterer i overdiagnostik og nogle gange overbehandling. Der er således et behov for nye biomarkører, at støtte klinisk beslutningstagning om biopsi og indledende behandling.

Den sædvanlige strategi for kræft biomarkør opdagelse er at sammenligne prostatacancer med benign prostata væv. Således blev identificeret den lovende biomarkør PCA3 (prostatacancer gen 3) ved differential display sammenligne kræft med normale og godartede hyperplasi prostata prøver [3]. High-throughput teknologier, såsom microarray analyse og massespektrometri, har øget inden for prostatakræft biomarkør opdagelse. Siden de første publikationer i slutningen af ​​90 s og begyndelsen af ​​2000-s, mange biomarkører eller “signatur” profiler specifikke for hver patologisk tilstand, f.eks normal

versus

kræft, er blevet foreslået for prostatakræft diagnose (revy i [4], [5]). Hvorvidt disse potentielle nye biomarkører er alle klinisk relevante rester alligevel usikre da ingen nå udviklingsfasen af ​​PCA3 [6].

Prostata er en af ​​de androgen-følsomme væv. Mere specifikt både embryonisk udvikling af prostata og prostata blev holdt ved voksenalderen er afhængige af en normalt væv imprægnering af androgener. Androgener handler gennem en specifik receptor, AR (androgen receptor), der tilhører den nukleare receptorsuperfamilie. AR er involveret i PCa vækst [7], [8], men også i sin indledning [9], gennem induktion af flere gener [10], [11], [12], [13]. Hvorvidt disse gener kan betragtes som potentielle biomarkører for tidlig diagnosticering af prostatacancer fortjener at blive evalueret. Vi foreslog derfor et to-trin strategi med henblik på prostatakræft diagnose biomarkør opdagelse. Vi først hypotese, at potentielle biomarkører for tidlig diagnosticering af prostatakræft kunne identificeres blandt androgen-regulerede gener (args). Vi valgte args i udødeliggjort RWPE-1 epitelial prostata celler stabilt udtrykker AR [14], ved hjælp af RNA microarrays og validering af QRT-PCR. For det andet, vurderet vi sammenlignende udtryk for disse args i normal prostata og normale prostata-relateret androgen-følsomme væv, der ikke (eller sjældent) give anledning til kræft. Vi brugte matchede prøver af sædblærer, prostata overgangszoner og prostatakræft fra patienter opereret for radikale prostatektomi og validerede deres diagnostiske præstationer ved at demonstrere deres evne til at skelne mellem normale prostata, BPH og kræft væv, og sammenligne den med den kendte biomarkører for prostatakræft (PCA3, DLX1).

Metoder

transkriptom analyse på RWPE-1-AR celler stimuleret af R1881

Vi brugte den stabile cellelinie RWPE-1-AR som konstitutivt udtrykker et exogent AR som beskrevet andetsteds [14]. Celler blev holdt i keratinocyt-vækstmedium (Invitrogen 17.005-042) suppleret med rEGF (rekombinant epitelial vækstfaktor) og BPE (bovint hypofyseekstrakt) (Invitrogen 37.000.015), antibiotika og antimykotika. RWPE-1-AR-celler blev stimuleret med det ikke-metaboliserbar androgen, R1881 (10-9 M), i vækstmediet berøvet BPE. Tre uafhængige celledyrkningsforsøg for hver behandlingsgruppe tilstand (køretøj eller R1881 i 3 timer og 24 timer) blev udført for microarray analyse. Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse af RNeasy® mini kit (74.104, Qiagen). RNA-koncentrationen blev målt ved OD aflæsning ved hjælp af en NanoDrop spektrofotometer.

For at kontrollere reaktion på R1881 i de stimulerede celler blev ekspressionen af ​​et panel af kendte mål AR gener analyseret ved kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR) for hver tilstand. Det opnåede fra 1 ug cDNA retrostranscribed RNA (Promega M1701) blev amplificeret under anvendelse QuantiTect SYBR® Green PCR Kit (Qiagen 204.145). Primere leveres fra Qiagen:. Hs_KLK3 /PSA (QT00027713), MME (QT00048755), Hs_TMPRSS2 (QT00058156), Hs_MMP2 (QT00088396), Hs_MCM10 (QT00030338), og Hs_TPB (QT00000721) som husholdning gen

Kvaliteten af ekstraherede RNA blev vurderet ved anvendelse af en Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies). RNA integritet numre på alle prøver var 10. Omvendt transskription, mærkning og hybridisering på Affymetrix Menneskelig 133 plus 2,0 Arrays blev udført af ProfileXpert tjeneste (Bron, Frankrig) i henhold til Affymetrix ™ protokoller (Expression analyse Teknisk Manual, 2008, Affymetrix). Et ug totalt RNA blev anvendt til fremstilling af biotinyleret cRNA og 15 ug cRNA blev hybridiseret. Affymetrix Fluidik Station 450 blev anvendt til vask og farvning. Arrays blev scannet ved hjælp af GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix). Affymetrix CEL filer blev analyseret i R ved hjælp af BioConductor suite af pakker. Rå probe signaler var baggrund korrigeret, normaliseret og sammenfattes ved hjælp af RMA procedure. Lineære modeller blev anvendt ved hjælp af limma emballage for at identificere gener med potentielt signifikant ændring i udtryk som reaktion på tid effekt eller R1881 behandling ved hver varighed (model formel: ~ Duration + Varighed: R1881). Den empiriske Bayes metode blev anvendt til at beregne modererede p-værdier, der blev derefter korrigeret for multiple sammenligninger ved hjælp af Benjamini og Hochberg falske opdagelse sats (FDR), der styrer procedure. De microarray data er blevet deponeret og beskrevet i overensstemmelse med MIAME retningslinjer, i Gene Expression Omnibus under tiltrædelsen nummer GSE29232 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE29232 ).

for at vurdere, at de relative RNA ekspressionsniveauerne af 14 regulerede-udskrifter var i overensstemmelse med de microarray data, RT-qPCR blev udført i tre eksemplarer af den samme RNA som i microarray eksperimenter ved hjælp QuantiTect SYBR® Green PCR Kit (Qiagen 204.145). Primere leveres fra Qiagen: Hs_EGFR (QT00085701), SOX2 (QT00237601), Hs_NDRG1 (QT02290232), Hs_MME (QT00048755), Hs_TFPI2 (QT00062804), Hs_CDK5R1 (QT00231644), Hs_SCNN1G (QT00063217), Hs_RHOB (QT00227409), Hs_PRDM1 (QT00060494) Hs_IL7R (QT00053634), Hs_SERPINB2 (QT00077497), Hs_PAX9 (QT00023317), Hs_FST (QT01665853), Hs_ADAMTS1 (QT00098588) og Hs_TPB (QT00000721) som husholdning gen at normalisere rådata. Korrelationer mellem microarray og qPCR resultater blev udført ved hjælp af Spearman test og lineær regressionsanalyse

Identifikation af kandidat biomarkør gener

Potentielle kandidatgener blev udvalgt med følgende kriterier:. 1) androgen-reguleret: overvejer log2 fold-ændring afskåret værdi til 1,2 og FDR (falsk opdagelse sats) med

P

0,05; 2) udtrykkes ved betydeligt højere niveauer efter behandling (3 h og /eller 24 timer varighed); 3) Gene ontogenese kategorier og relevante veje ved hjælp Ingenuity Pathway Analysis (IPA®) software (Opfindsomt Systems). I alt 36 gen mål blev valgt til bekræftelse af (differential) udtryk i patientprøver.

Vævsprøver

Etik erklæring.

Ikke-interventionel biomedicinsk forskning protokol for væv prøver bevaring efter en prostata operation er blevet sat op på Centre Hospitalier Lyon-Sud og den etiske komité i Lyon (CPP Sud-Est 2) specifikt har godkendt det til denne undersøgelse. Derfor blev patienter indlagt til urologi afdeling i Centre Hospitalier Lyon-Sud informeret og gav frivilligt, underskrevet informeret samtykke forud for enhver bevaring vævsprøve og til forskningsbrug.

Vævsprøver.

prostatacancer (PSA), prostata overgangszonen (PTZ) og sædblære (SV) frosne væv blev opnået fra radikale prostatektomi. Gleason score (GS) anvendes for prostatakræft væv grading. PTN patologisk tumor iscenesættelse blev bestemt i henhold til UICC TNM klassifikationen 2002 (6

th udgave). Frosne væv fra patienter med BPH blev opnået fra transuretral resektion af prostata. Fraværet af cancer hos BPH prøver blev vurderet af en patolog erfarne inden for prostata sygdomme. De patologiske karakteristika kræft patienter inkluderet i undersøgelsen er sammenfattet i tabel 1.

For sammenlignende udtryk studier i PCa, SV og PTZ matchede vævsprøver, er der fås fra de samme kirurgiske prøver, den fravær af kræftceller i SV og PTZ blev kontrolleret af streng histologisk undersøgelse af væv støder op til disse stykker forbeholdt frosne og RNA ekstraktion. Til diagnostiske formål, blev brugt 50 PCA vævsprøver: GS 6 (

n = 1

), GS 7 (3 + 4) (

n = 12

), GS 7 (4 + 3 ) (

n = 24

), GS 8 (

n = 6 fotos), og GS 9 (

n = 7

).

RNA-ekstraktion og revers transkription

Frosne væv blev opbevaret i flydende nitrogen indtil RNA-ekstraktion Totalt RNA blev ekstraheret fra homogeniseret væv ved Trizol® (Invitrogen) og blev bedømt for integritet ved hjælp 2100 Bioanalyzer® (Agilent). 1 ug totalt RNA blev omdannet til cDNA under anvendelse af første streng cDNA-syntese kit® (Invitrogen). Det resulterende cDNA blev anvendt umiddelbart for real-time qPCR

TLDA realtid qPCR

Applied Biosystems TaqMan sourcing (TaqMan® low-density arrays: TLDAs). Anvendes til kvantitativ analyse af genekspression. Princippet af high-throughput real-time qPCR systemet er baseret på den 384-brønds mikrofluid kort (8 separate ifyldningsporte, hver med 48 separate brønde) [15]. Hver 2-pi brønd indeholder konkrete, brugerdefinerede primere og prober, der kan specifikt detektere et enkelt gen. Hver cDNA prøve (100 ng cDNA ækvivalent) blev tilsat til et tilsvarende volumen af ​​2 x TaqMan Gene. Expression Master Mix® (Applied Biosystems) for i alt 100 pi per port. Efter forsigtig blanding og centrifugering blev blandingen overført til en belastning port på et TLDA kort. Grupperingen blev centrifugeret to gange i 1 min, hver ved 1200 rpm, at fordele prøverne fra lastehavnen til hver brønd. Kortet blev derefter forseglet og PCR-amplifikation udføres ved anvendelse af en 7900HT Hurtig Real-time PCR System® (Applied Biosystems) ifølge protokollen beskrevet af producenten.

I denne undersøgelse blev mRNA-niveauer af 48 gener målt. Hver plade havde 18S-specifik primer /probe som en endogen kontrol. Desuden HMBS, RPL13A, ACTB, TBP, og UBB blev målt som potentielle housekeeping-gener. To tekniske dubletter blev udført for hver forskellig prøve.

Statistisk analyse

Real-time data.

Tærsklen cyklus (Ct) blev automatisk givet af SDS2.2® softwarepakke (Applied Biosystems). Relative mængder (RQ) blev bestemt ved anvendelse af ligningen: RQ = 2-ΔΔCt. Alle data blev genereret i to eksemplarer for hver genekspression per prøve. TaqMan Array kort data blev samtidigt analyseret for differentieret udtryk ved hjælp af Integromics RealTime StatMiner 4.0® pakke, som integrerer BioConductor R software. De forskellige trin i arbejdsgangen af ​​PCR dataanalyse: kvalitetskontrol, vælge den mest stabile endogene kontrol, data normalisering og relativ kvantificering, blev opnået med denne bioinformatiske værktøj. Som kontroller for tilstedeværelsen af ​​prostataceller i prostata prøver, to prostata-specifikke markører, medlemmer af kallikrein familien, dvs. KLK2 og KLK3 /PSA, blev anvendt til normalisering. Fold ændringer i genekspression blev præsenteret af Log10RQ (Log10RQ = 0, hvis der ikke udtryk forandringer; Log10RQ = 1, hvis prøven udtrykkes 10 gange større end i kalibratoren prøven Log10RG = -1 hvis prøven udtrykkes 10 gange mindre end i kalibratoren prøven). Den Students t parret test blev anvendt til sammenligninger mellem matchede prøver. Den ikke-parametrisk Wilcoxon test blev anvendt til sammenligninger mellem ikke-matchede prøver. Den Benjamini og Hochberg Falsk Discovery Rate blev taget som signifikansniveau. Signifikans blev betragtet som

P

. 0,01

Evaluering af diagnostiske forestillinger

Receiver-drift karakteristiske (ROC) kurver blev beregnet for at vurdere den diagnostiske magt. hver enkelt variabel univariately ved arealet under kurven (AUC) af ROC-kurven. Værdier for ROC kurver var -ΔCt normaliseret ved hjælp af den geometriske gennemsnit af TBP, KLK2 og KLK3. Den 95% konfidensinterval (95% IC) af AUC-værdierne blev beregnet som beskrevet (13). Til dette udtryk undersøgelse blev potentielle biomarkører anset værdifuldt, hvis AUC ≥0.9 (13). Alle disse statistiske beregninger blev udført ved hjælp STATA®11.0 software (College Station, Texas).

Resultater og Diskussion

Androgen-regulerede gener udtryk profiler og identifikation af potentielle mRNA biomarkører

Vi havde til formål at identificere androgenafhængige gen aktivering potentielt involveret i de tidlige stadier af prostata carcinogenese. Vi besluttede derfor at anvende en celle model så tæt som muligt på normale prostataceller snarere end prostatacancercellelinjer, hvor molekylære begivenheder sandsynligvis repræsentere sene stadier af udvikling af prostatacancer. Vi anvendte ikke-kræft RWPE-1-celler, der tidligere er opnået ved immortalisering af ikke-neoplastisk voksne humane prostata-epitelceller med human papillomavirus 18 [16]. Trods immortalisering, disse celler viste sig at opføre sig som næsten normale prostataceller: bevaring af Y-kromosom, normal ekspression af cytokeratiner og E-cadherin, vækststimulering samt PSA og AR-ekspression som reaktion på androgener [17], [18]. De beholdt også evnen til at udvikle, især i Matrigel 3D-kulturer, well-polariserede hule sfæroider gennemgå og vinder acinære differentiering som reaktion på vækstfaktorer og som et resultat af interaktioner med ekstracellulære matrix [17], [18], [ ,,,0],19].

for at styrke androgenafhængige gen aktivering, brugte vi stabilt transficeret RWPE-1-celler med vildtype-AR-gen [14]. De resulterede RWPE-I-AR celler blev stærkt androgen-følsomme som kontrolleret ved proliferationsassays. Disse celler blev behandlet ved den ikke metaboliserbare syntetiske androgen R1881 i 3 timer og 24 timer. Androgen- induceret stimulering blev først kontrolleres ved kvantitativ RT-PCR af et panel af kendte mål-AR-gener herunder KLK3 /PSA, MME (makrofag metalloelastase), og TMPRSS2 (data ikke vist). Ekstraherede cDNA fra celler behandlet eller ej med R1881 blev derefter hybridiseret på Affymetrix Menneskelig 133 plus 2,0 arrays.

transkriptomisk profilering identificeret ved hjælp af en log2 fold-ændring afskåret værdi på 1,2, 75 gener udstiller opregulering og 33 gener udviser nedregulering i R1881-behandlede RWPE-1-AR celler under 3 timer i forhold til kontrol (køretøj behandlet), overvejer FDR (falsk opdagelse sats) med

P

0,05. Transkriptom profilering identificeret 208 gener udviser opregulering og 116 gener udviser nedregulering i R1881-behandlede RWPE-1-AR celler under 24 timer i forhold til kontrol, overvejer FDR med

P

. 0,05

Valideringsforsøg at bekræfte nøjagtigheden af ​​vifte genekspression målinger på udvalgte udskrifter differentielt udtrykte på 3 timer og /eller 24 timer varighed R1881 behandling (7 opreguleret og 7 nedreguleres) ved hjælp LightCycler real-time qPCR : EGFR, SOX2, NDRG1, MME, TFPI2, CDK5R1, SCNN1G, RHOB, PRDM1, IL7R, SERPINB2, Pax9, FST, og ADAMTS1. Resultaterne bekræftede, at de relative RNA ekspressionsniveauerne var i overensstemmelse med de microarray data (tabel S1).

For at identificere og prioritere biomarkør kandidater blandt gener fundet at være differentielt udtrykte efter 3 timer og /eller 24 timer R1881 behandling, vi bygger

i silico

analyser på biologiske egenskaber anses for at være de mest relevante i både litteraturen undersøgelse og opfindsomhed Pathway Analysis (IPA®). Analyser med denne software returnerede følgende oplysninger: 1 /de relevante funktioner i forbindelse med datasættet og 2 /påvirkede signalering og metaboliske veje er forbundet med datasættet. Ud over høj fold-ændring i microarray datasæt på 3 timer og /eller 24 timer af R1881 redegørelse blev generne konstrueret som af interesse, hvis de har mindst én disse funktionelle anmærkninger eller sygdomstilstande foreninger i Ingenuity Videndatabase: mulig påvisning i urin , velkendte vævsekspression og navnlig, differential ekspression i prostatacancercellelinjer, i prostata godartede væv og /eller i prostatacancer, og /eller stærk association med carcinogene processer. Vi stillede også opreguleret gener til nedreguleret dem i et forsøg på at lette potentiel fremtidig anvendelse i klinisk praksis. Tredive seks gener matchede disse kriterier (tabel 2) og blev anvendt til yderligere undersøgelse.

Kvantitativ RT-PCR-analyse af humane kræft og ikke-kræft prostata matchede væv

For yderligere at undersøge ekspressionsniveauerne af androgen regulerede gener identificeret ved microarray analyse blev kvantitativ RT-PCR-analyse udført på de udvalgte mål med anvendelse human PCa og prostata overgangszone (PTZ) matchede væv. PTZ blev valgt, fordi det er kendt at sjældent giver anledning til prostatacancer [20]. Vores mål var at identificere biomarkører, der kan skelne mellem kræft og ikke-kræft prostata væv. Vi valgte storstilet RT-PCR RNA kvantificering på TaqMan® low-density arrays (TLDAs; Applied Biosystems), som tillader, per prøve, samtidige analyser af op til 48 mål for tilpassede kort. Kvantitativ RT-PCR blev valgt som et grundlag for sammenligning, fordi den tillader mRNA kvantificering, en proces der tidligere blev anvendt til at vurdere vævsekspression [21], [22], [23], [24], [25], [26] og urin mængder [22] af PCA3 (prostatacancer gen 3), et gen vi ønskede at bruge som en kontrol positiv gen. PCA3 er faktisk nu anerkendt som en værdifuld biomarkør for prostatacancer (revy i [27], [28]) og har vist sig at være specifikt udtrykt i op til 95% af PCa [3], [29]. PCA3 blev derfor anvendt som en positiv kontrol, hvilket afspejler PCa- specifikt udtryk panel. TMPRSS2 [30] og DLX1 [31], [32] er også potentielle PCA biomarkører, som beskrevet ved at undersøge microarray data ved hjælp af Oncomine database, og deres ekspression blev ligeledes evalueret som positive kontroller. Desuden evalueres vi ekspression af 6 mulige husholdningsgener: 18S, ACTB, HMBS, RPL13A, TBP, og UBB, samt 2-gener betragtes som prostata-specifikke gener: KLK2 og KLK3 /PSA. Som en global markør for androgen-sensitive væv (prostata og skelsættende vesikler), vi også valgt AR gen til analyse (tabel 2).

Om PCA og PTZ væv udtrykker lignende RNA beløb er ukendt. Normalisering af en husholdning gen blev derfor berettiget. Nylige rapporter har vist, at husholdningsgener faktisk kan præsentere alvorligste forskelle væv, cellelinier eller kliniske prøver [33]. Vi er derfor først søgt at afgøre, hvilke potentielle husholdning gener stabilt blev udtrykt under de forskellige forhold fra blandt de 6 vi valgte. TBP blev fundet som den mest stabile endogene kontrol ved hjælp af NormFinder algoritmen af ​​StatMiner® pakken og blev brugt som en normalisering genet i de følgende dele af undersøgelsen. Prostata-specifikke gener KLK2 og KLK3 /PSA også beskrevet klart udtryk stabilitet og blev brugt sammen med TBP som den endogene kontrol (geometrisk middelværdi).

Vi sammenlignede udtryk for alle de udvalgte gener i 26 matchede normal prostata PTZ og PCA væv, fremstillet af radikal prostatektomi prøver. Følgelig blev 26 gener fundet at være signifikant (

P

0,01) overudtrykt i den normale prostata overgangszonen sammenlignet med PCa (figur 1A og figur S1). Opfindsomhed Pathway analyse viste, at 17 og 21 af disse 26 gener tilhører 2 signifikant repræsenteret biologiske funktioner: cellulær bevægelse (migration af celler i særdeleshed) og cancer (epithelial carcinoma i særdeleshed), hhv. Omvendt blev der kun PCA3 og DLX1 gener bestemt til at have højere niveau (mere end 50- og 60-fold, henholdsvis) i PCA væv sammenlignet med den matchede normale PTZ væv (

P

0,01) (figur 1A). Det er værd at bemærke, at ACTB (kodende beta-actin), normalt betragtes som en potentiel housekeeping-gen, også viste sig at være overudtrykt i PTZ. Faktisk ACTB er androgen-reguleret [34], [35] og har tidligere rapporteret, at differentielt udtrykt mellem kræft og ikke-kræft prostata væv [36]

Y-akse:. Log10 af RQ (relativ mængder); X-akse: gener, hvis udtryk var statistisk signifikant forskellig mellem:. A) 26 matchede normal prostata overgangszonen og prostatakræft prøver B) 27 prostatakræft prøver og 15 prøver af benign prostatahyperplasi C) 35 matchede sædblæren og prostatakræft prøver

Godartet prostatahypertrofi (BPH) er en interessant model, hvortil sammenligning med PCa er relevant. Disse to patologiske tilstande faktisk deler flere punkter, herunder specifikke lokale miljø (forsyning samme blod og udsættelse for mitogener), androgen-følsomhed og ukontrolleret celledeling. I modsætning til PCa, BPH stammer fra PTZ og menes at aldrig være kilden til malign transformation. Angivelse af de udvalgte gener blev derfor sammenlignet i de 26 tidligere testede PCA prøver og i 15 ubeslægtede BPH prøver, hvor fravær af kræftceller blev konstateret af en patolog ekspert i prostata patologi feltet. Vi brugte de samme 3 normalisering gener (TBP, KLK2 og KLK3 /PSA), som viste sig at være stabil efter NormFinder algoritme. På den måde, vi identificeret 9 gener væsentligt (

P

0,01) overudtrykt i BPH sammenlignet med PCa (figur 1B og Figur S2): AR, AUTS2, CDK5R1, CRYAB, FOXA2, KCNMA1, MME, SCEL, og SDPR. CDK5R1 (og kun dette gen) viste sig også at være overudtrykt i BPH væv, når man sammenligner med sit udtryk i normal prostata PTZ. Det koder den såkaldte p35-protein, der virker som et væsentligt aktivator af CDK5, en stærk regulator af neuronal migration. Protein p35 er svagt udtrykt i PCA vævsprøver og viste sig at være involveret i prostata celle apoptose [37]. Så vidt vi ved, har særligt udtryk i BPH aldrig blevet rapporteret. Fem gener blev identificeret som overudtrykt i PCa sammenlignet med BPH: ALCAM, CLDN7, DLX1, PCA3 og RASD1 (figur 1B). PCA3-gen, stærkt specifik for prostatacancerceller, er blevet rapporteret at være overudtrykt 66 til 100 gange i prostatacancer

versus

normal prostata og 140-fold i prostatacancer

versus

BPH [ ,,,0],3], [21]. I vores undersøgelse observerede vi en stærk overekspression i PCa fra 50 til 210 gange i forhold til normal prostata og BPH hhv. DLX1 viste det samme udtryk mønster, som tidligere observeret [31]. Alcam og CLDN7 både koder for proteiner lokaliseret til inter-cellulære kryds af forskellige epithel og har tidligere været foreslået som androgen-reguleret og overudtrykt i PCa [38], [39]. RasD1 blev oprindeligt beskrevet som en dexamethason-inducerbar ras-relateret protein og potentiel aktør i forebyggelse aberrerende cellevækst i flere cellelinier [40]. Ifølge Ingenuity Pathway Analysis®, blandt de 14 gener således fundet at være differentielt udtrykt i BPH og prostatacancer, alle var involveret i et repræsenterede funktionel netværk betydeligt – cellevækst og proliferation – undtagen PCA3 (lidt om dens funktion, men PCA3 i kontrollen af ​​PCa celleoverlevelse, dels gennem modulerende AR signalering [41]) og CDK5R1 (snarere involveret, sammen med 8 andre gener, i en væsentligt repræsenteret biologisk funktion:. celledød og overlevelse)

Kvantitative RT-PCR analyse af humant kræft prostata og sædblære matchede væv

ovenstående sammenlignende ekspressionsundersøgelser tilladt os at identificere gener overudtrykt i ikke kræft prostatavæv sammenlignet med prostatakræft. På trods af deres potentielle diagnostiske værdi, kan disse gener også være af betydning som formodede markører for processer beskyttende mod transformation kræft. Deres høje udtryk i BPH og normal PTZ kunne relateres til de fattige eller nul forekomst af kræft i disse væv, mens deres svage udtryk i prostata kan tillade kræft initiering med stor hyppighed. En sådan mekanisme er for nylig blevet foreslået i et andet prostata-relateret væv: sædblære [42]. Forfatterne brugte en 2-trins strategi ved først at vælge gener med væsentligt højere ekspressionsniveauer i sædblærer snarere end i normal prostata og for det andet ved at krydse denne liste med gener identificeret andre steder, fordi deres udtryk blev stille i PCa ved promotor DNA methylering. Der blev derfor identificeret otte gener af interesse [42]. Den foreliggende undersøgelse er i overensstemmelse med denne offentliggjorte én i, at vi også anvendt en 2-trins strategi, tilladt os at kunne vælge kandidat androgen-regulerede gener, hvis ekspression blev målt i PCA prøver og sammenlignet med referere prostatavæv vides at sjældent eller aldrig give anledning til kræft på trods af deres fælles embryologic oprindelse og kræftfremkaldende eksponering. Ligeledes er det kendt, at der trods træk deles i fællesskab af prostata og sædblærerne, herunder især androgen-afhængige vækst og funktion, forekomsten af ​​kræft i sædblærer og prostata er markant anderledes [42]. Vigtigt er det, kan grundlag af denne forskel være korreleret med mekanismerne bag prostata carcinogenese [42]. Tilføjelse væv fra normale sædblærer blev derfor anset i nærværende undersøgelse, at styrke udtryk sammenligning mellem prostatakræft og en reference godartet væv, meget beskyttet mod transformation kræft.

Vi har derfor vurderet genekspression i 35 matchede sædblæren og PCA væv under anvendelse af de samme udvalgte gener (tabel 2). Manglen på sædblære inddragelse af prostatacancer blev omhyggeligt patologisk konstateret før anvendelse i undersøgelsen. TBP blev fundet som det mest stabile endogene styringen med det NormFinder algoritme ifølge den StatMiner® pakke og blev anvendt som normalisering genet. Som forventet blev prostata-specifikke KLK2 og KLK3 gener underexpressed i sædblæren i forhold til prostata væv (

P

0,01). Ti andre gener blev også signifikant overudtrykt i PCa sammenlignet med sædblære: ALCAM, LOX, BNIP3, CLDN8, AQP3, FOXA2, og NDRG1, samt den forventede TMPRSS2, DLX1 og PCA3 (figur 1C og figur S3). Derimod blev der fundet 18 gener at være signifikant overudtrykt i sædblæren i forhold til PCa: CRYAB, KCNMA1, AKR1C1 /2, TFP12, SDPR, CD24L4, SERPINB1, FLRT3, DACT1, SCNN1G, FST, RHOB, SGK1, LAMA3, AKR1C3 , SEPP1, RGS2 og ACTB (

P

0,01).