PLoS ONE: Funktionel karakterisering af cirkulerende tumorceller med en prostata-kræft-Specifikke Mikrofluid Device

Abstrakt

Kræft metastase tegner sig for størstedelen af ​​kræftrelaterede dødsfald på grund af dårlig respons på mod kræft behandlinger. Molekylær forståelse af metastase-associerede lægemiddelresistens stadig undvigende på grund af mangel på tilgængelige tumorvæv. Isolering af cirkulerende tumorceller (CTCs) fra det perifere blod fra patienter er dukket op som en gyldig alternativ tumorvæv, som kan underkastes molekylær karakterisering. Imidlertid har problemer med lav renhed og følsomhed hæmmet vedtagelse til klinisk praksis. Her rapporterer vi en ny metode til at indfange og molekylært Karakteriserer CTCs isoleret fra kastrationsniveauer-resistente patienter med prostatacancer (CRPC), som fik taxan kemoterapi. Vi har udviklet en geometrisk forbedret differential immunocapture (GEDI) mikrofluidanordning der kombinerer et anti-prostataspecifikt membran-antigen (PSMA) antistof med en 3D geometri, der indfanger CTCs samtidig minimere uspecifik leukocytadhæsion. Tælling af GEDI-erobrede CTCs (defineret som intakt, kerneholdige PSMA + /CD45- celler) viste en median på 54 celler pr ml identificeret i CRPC patienter versus 3 i raske donorer. Direkte sammenligning med det kommercielt tilgængelige CellSearch® afslørede en 2-400 gange højere følsomhed, der opnås med GEDI enheden. Konfokal mikroskopi af patient-afledt Gedi-fanget CTCs identificeret TMPRSS2: ERG fusionsprotein mens sekventering identificerede specifikke androgen receptor punktmutation (T868A) i blodprøver tilsat kun 50 pc c4-2 celler. On-chip behandling af patient-afledte CTCs med docetaxel og paclitaxel tilladt overvågning af narkotika-target engagement ved hjælp af mikrotubuli bundling. CTCs isoleret fra docetaxel-resistente CRPC patienter viste ingen tegn på narkotika aktivitet. Disse målinger udgør de første funktionelle assays af lægemiddel-target engagement i levende cirkulerende tumorceller, og derfor har potentiale til at gøre det muligt for langsgående overvågning af mål respons og præge udviklingen af ​​nye midler mod cancer

Henvisning:. Kirby BJ, Jodari M, Loftus MS, Gakhar G, Pratt ED, Chanel-Vos C, et al. (2012) Funktionel karakterisering af cirkulerende tumorceller med en prostata-kræft-Specific mikrofluidapparatet. PLoS ONE 7 (4): e35976. doi: 10,1371 /journal.pone.0035976

Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA

Modtaget: December 20, 2011; Accepteret: 23. marts 2012; Udgivet: 27 april, 2012 |

Copyright: © 2012 Kirby et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra det amerikanske National Institutes of Health (R01 CA137020-01 og U54 CA143876) (PG), NIH Physical Sciences Oncology center på Cornell (BK, PG DN), New York Kontoret for Videnskab, Teknologi og Forskning ( BK), den Weill Cornell Clinical og Translational Science center (DN, PG BK) en Kreativitet Award fra Prostate Cancer Foundation (PG og DN) og støtte fra Urogenitale Research Fund Oncology (DN). CCV er en modtager af en NRSA postdoc stipendium. EP og SS blev støttet af National Science Foundation Graduate Research Fellowships. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. BK, PG, ST og DN videregive rådgivning indtægter fra Sanofi USA. Dette ændrer ikke vores tilslutning til alle de PLoS ONE politik vedrørende datadeling og materialer.

Introduktion

Udviklingen af ​​metastaser hos patienter med solide tumorer maligniteter menes at skyldes tumorceller ind i kredsløbssystemet og migrere til fjerne organer, hvor de ekstravasere og formere [1] – [3]. Selvom cirkulerende tumorceller (CTCs) er sjældne så få som en celle pr 100 millioner blodlegemer [3], [4], molekylære og funktionelle analyser af CTCs kan give en større forståelse af biologi kræft metastaser, hjælpe med at identificere nye terapeutiske mål, og gøre det muligt for kliniske korrelationer til at overvåge patienter i behandling [5]. En række teknologier er blevet udviklet for at forbedre påvisningen og opsamling af CTCs fra det perifere blod. Disse omfatter densitetsgradientcentrifugering, immunomagnetisk bead separation under anvendelse af monoklonale antistoffer rettet epitelcelle-overfladeantigener, cellesortering under anvendelse af flowcytometri, filtrering baseret størrelsesseparation [6] og mikrofluidenheder. Selvom fremskridt i CTC fange er blevet gjort, den lavfrekvente af CTCs i kræftpatienter, har deres heterogenitet, mangel på organ-specifikke capture tilgange, og plasticitet CTC befolkning begrænsede evne til at indfange og spore alle CTCs [2] [6]. I øjeblikket er den epitelcelle-adhæsionsmolekyle (EpCAM), repræsenterer antigenet af valg for de fleste mikrofluidenheder der er blevet udviklet til at indfange cirkulerende tumorceller [7] – [10].

Men akkumulere beviser tyder på, at ekspressionen af ​​EpCAM under kræft progression og især under epitel-til-mesenkymale overgang ikke er godt karakteriseret, anledning til bekymring om universalitet denne antigen til immunocapture systemer [11], [12]. EpCAM er blevet rapporteret at have onkogent potentiale [13] og korrelerer med proliferation i cellelinier [14]; er det imidlertid nedreguleres under EMT [1], og EMT markører har vist sig at være vigtigere end epiteliale markører fx cytokeratin forudsige udviklingen af ​​kræft [15]. Således, mens EpCAM er tydeligvis nyttig til at identificere CTC befolkninger i mange kræftformer, de fordomme, der er forbundet med EpCAM berigelse er i øjeblikket ukendte.

Ud over usikkerheden om overfladeantigener, specificitet immunocapture fra blodet forvirrede af de ikke-specifikke adhæsive egenskaber af leukocytter på de fleste antistof-overflader. På grund af tilstedeværelsen af ​​talrige leukocytter i blod på en ca. 10

4-10

05:01 forholdet med hensyn til CTCs, immunspecifikke overflader berige CTCs men kan ikke isolere dem fra kontaminerende leukocytter helt. Identificering CTCs kræver yderligere trin og ofte indebærer farvning med DAPI for at sikre tilstedeværelsen af ​​et intakt kerne og immunfarvning at identificere tilstedeværelsen af ​​epiteliale markører (dvs. cytokeratin) og manglen på den leukocytisk markør CD45. En sådan immunfarvning har identificeret en familie af kriterier, der korrelerer CTC nummer med patientens prognose [16], men det kræver, at fiksering og farvning være centralt for CTC identifikation, som i den kommercielle CellSearch® systemet [17], [18]. Selv tælling af CTCs fra patienter med fremskreden prostatacancer, der fik kemoterapi ved hjælp af kommercielt tilgængelige CTC capture system ved CellSearch® har vist anvendelighed som en prognostisk indikator for patientens overlevelse [17], [18] og tælling i øjeblikket ved at blive undersøgt i en række kliniske forsøg, tilstedeværelsen af ​​kontaminerende leukocytter hindre nedstrøms anvendelighed af CTC capture udstyr, idet assays baseret på RNA eller protein kvantificering er korrumperet af behovet for fiksering og materiale leukocytisk oprindelse.

for at lette indfangning højeffektiv af prostata CTCs, har vi udviklet en prototype mikrofluidanordning der beskæftiger en tilgang, som vi kalder geometrisk forbedret differential immunocapture (GEDI). Denne enhed kombinerer en geometri, der reducerer indfangning af kontaminerende leukocytter ved at generere size-afhængig celle-væg kollisioner. Vi kombinerer denne geometriske tilgang med prostata-specifikt immunocapture overflade under anvendelse af J591 monoklonalt antistof, som genkender det ekstracellulære domæne af prostataspecifikt membran-antigen (PSMA) [10]. PSMA er et celleoverflade peptidase højt udtrykt ved maligne prostata-epitelceller. PSMA er et attraktivt mål for prostatakræft CTC fange, da det er udtrykt på stort set alle prostata kræftceller og ekspression øges efter kastration. Vi rapporterer her en detaljeret demonstration af de multiple anvendelser af den GEDI indretningen, herunder en sammenligning af CTC tælling med CellSearch®, påvisning af en specifik AR mutation fra blodprøver tilsat kun 50 celler; identifikation af TMPRSS2-ERG fusion ved immunfarvning, og

ex-vivo

vurdering af CTC følsomhed over for taxan-behandling med mikrotubuli bundling som en markør for lægemiddel-target engagement.

Materialer og Metoder

Device Fabrication

Alle enhed fabrikation blev udført ved Cornell nanoskala Videnskab og Teknologi Facility (Ithaca, NY). Standard fotolitografiske teknikker blev anvendt til at definere array-geometrier på siliciumskiver. Vaflerne blev ætset med et oxygenplasma dyb reaktiv ion etcher (Uniaxis SLR770) til en dybde på 100 um, og rengøres under anvendelse af svovlsyre og hydrogenperoxid forud for antistof overfladefunktionalisering. Den J591 monoklonalt antistof (fremstillet af Lonza plc (Slough, England) for Bzl Biologics, inc.) Blev immobiliseret på overfladerne enhed ved hjælp MPTMS-GMBS-NeutrAvidin-biotin kemi [10]. Polydimethylsiloxan (PDMS) ark (05:01 base:curing agent), ca. 3 mm tykke, blev polymeriseret i 18 timer ved 60 ° C og trimmet til dannelse dækker for GEDI enheden. En PDMS plade blev fastspændt til toppen af ​​enheden med en brugerdefineret jig til at skabe lukkede kanaler befolket med indlæg arrays. Indløbs- og ud- huller blev skabt med en biopsitang, og 23-gauge metalrør blev indsat i PDMS at forbinde indløbet og udløbene til ekstern slange. Enheder blev primet med en 50/50 isopropanol /vand-blanding, og derefter skylles med demineraliseret vand og PBS før eksperimenter.

Prøvetagning og Mikrofluid Capture

Perifere blodprøver blev opsamlet i rør indeholdende natrium citrat antikoagulant (Becton-Dickinson) fra raske frivillige og patienter med metastatisk kastrationsniveau-resistent prostatacancer under en klinisk protokol med titlen “Analyse af cirkulerende tumorceller i prostatacancer. Forudsigelse reaktion på taxaner:. En pilotundersøgelse “, som blev godkendt af Institutional Review Board (IRB) af Weill Cornell Medical College of Cornell University Blod blev opnået fra patienter eller raske donorer efter skriftligt informeret samtykke, som også blev godkendt af IRB udvalg af Weill Cornell Medical College of Cornell University. som tidligere beskrevet [10], 1 ml blod fra hver prøve blev behandlet gennem GEDI chip inden 24 timer af blod uafgjort ved at skubbe blodet gennem enheden ved en volumenstrøm på 1 ml /hr (Chemyx sprøjtepumpe)

Cellefarvning og analyse

de cellelinjer, der anvendes i disse forsøg som kontroller til farvning eller i spidse eksperimenter er:. den menneskelige leukæmi U937, og .. human prostatacancer-cellelinier PC-3, LNCaP og c4-2 Alle cellelinier blev indkøbt fra ATCC post-capture blev celler fikseret on-chip med PHEMO fiksativ ved 37 ° C (PHEMO buffer: PIPES syre, HEPES syre, EGTA dinatriumsalt, Mg-Cl2-6H

20, 10% DMSO), glutaraldehyd, og 3,7% formaldehyd. Celler blev derefter blokeret (10% normalt gedeserum – Jackson Immuno Research) og immunfarvet med FITC-konjugeret humaniseret mAb J591 at detektere PSMA-ekspression. Monoklonalt muse-anti-CD-45 (BD Biosciences) efterfulgt af AlexaFluor568 mærket gede-anti-muse-sekundært (Invitrogen) og muse-anti-EpCAM direkte konjugeret til AlexaFluor647 (Biolegend). Til påvisning af intracellulære antigener blev celler permeabiliseret med 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich) i PBS og farvet ved anvendelse af rotte-anti-alfa tubulin (YL1 /2, Millipore) og kanin-anti-ERG monoklonalt antistof (klon EPR 3864, Epitomics, Burlingame, CA). Den anti-ERG antistof var en generøs gave fra Dr. Mark Rubin (Weill Cornell Medical College, New York, NY). Alle primære antistoffer blev inkuberet i 1 time ved stuetemperatur; sekundære antistoffer blev farvet ved stuetemperatur i 30 minutter. DAPI blev anvendt til DNA modfarvning. Gedi indretninger blev monteret på dækglas med Mowiol og opbevaret ved -20 ° C før analyse.

CTC tælling

Blinded CTC tælling efter antistofmærkning blev udført ved anvendelse af et Zeiss LSM-700 point scanning konfokal mikroskop, er udstyret med 405-, 488-, 555- og 632-nm laser linjer. Alle PSMA + /CD45- kerneholdige celler blev identificeret som CTCs. Indledende validering af CTC tælling blev gennemført ved to uafhængige, blindede testere. Positive og negative kontroller til antistof ydeevne og farvning blev inkluderet i hvert forsøg: U937 humane leukæmiceller (CD45 + /PSMA- /EpCAM-), og de menneskelige prostata cancer cellelinjer (c4-2 og LNCaP: PSMA + /CD45- /EpCAM + og PC-3 (PSMA- /Cd45- /EpCAM dim). Individuelle

z

-stacks erhvervet ved hjælp af 100X /NA 1,46 og 63x /NA 1.3 Plan-Apo Zeiss målsætninger kontrolleres af Zen software (Zeiss) og præsenteret de maksimale projektioner intensitet.

RNA-ekstraktion

efter celle capture blev GEDI enhed skylles ved at strømme PBS i 30 minutter ved en hastighed på 1 ml /time. Cellerne blev lyseret med 700 pi RLT Lysis buffer suppleret med 1% β-mercaptoethanol ved en strømningshastighed på 15 ml /time. lysatet blev opsamlet, og RNA blev ekstraheret under anvendelse af QiagenRNEasy Micro Plus Kit (Qiagen Inc, Valencia, CA) ifølge producentens instruktioner.

ex-vivo drug behandlinger og Analyse

for

ex vivo

narkotikabehandling eksperimenter blev blodprøven fra hver patient delt og 1 ml blev fløjet til hver af tre Gedi enheder samtidigt. Efter CTC indfangning og efterfølgende PBS vask blev hvert GEDI microdevice forsigtigt anbragt i en dyrkningsskål med RPMI-1640-medier indeholdende 2% serum og suppleret med enten 0,1% DMSO kontrol eller paclitaxel ved koncentrationer på 100 nM eller 1 pM og inkuberet ved 37 ° C i 24 timer. Ved afslutningen af ​​behandlingen blev Gedi-indfangede celler fikseret med PHEMO puffer og forarbejdet til multiplex konfokal mikroskopi efter immunfarvning med forskellige celleoverflade og cytoplasmiske antistoffer som angivet. Alle CTCs (PSMA + /CD45- /DAPI +) blev vurderet for tilstedeværelsen af ​​bundter mikrotubuli som bevis for effektivt lægemiddel-target engagement. Den procent af CTCs med tegn på mikrotubuli bundling blev beregnet. I alle analyserede prøver, bundtning var tydeligt ved den særskilte form, bredde, orientering og øget fluorescensintensitet af bundter mikrotubulus sammenlignet med mikrotubuli fra ubehandlede celler. Derudover anvendte vi DAPI kontrastfarve at vurdere tilstedeværelsen af ​​mitotiske eller apoptotiske kerner efter lægemiddelbehandling.

Statistical Analysis

Statistisk analyse blev udført for at sammenligne de gennemsnitlige CTC tællinger opnået fra CRPC patienter og sunde donorer. Vi brugte en ikke-parametrisk (Wilcoxon signed-rank) analyse, som CTC tæller ikke udviste normalfordeling. Statistisk signifikans blev defineret med α = 0,05.

Resultater

For at karakterisere ydeevne af enheden (figur 1A), vi bestemt celle opsamlingsprocent med PSMA-positive kræftceller. Vi bestemt celle capture som en funktion af varierende mAb J591 koncentrationer (1,5-20 ug /ml) under anvendelse forskydningsspænding størrelser repræsentative for dem, der opleves af de funktionaliserede overflader af indretningen (0,08-0,24 Pa). Disse forsøg viste en dosisafhængig stigning i celle optage op til mAb-koncentration på 10 pg /ml, som blev anvendt til alle efterfølgende eksperimenter (figur 1B).

oversigt (A) GEDI enhed. Med uret fra øverst til venstre: skematisk af blodstrømmen gennem enhed, billedet af silicium enhed med silikone pakning, overfladefunktionalisering ordningen. (B) Cell capture ydeevne som funktion af forskydningsspænding og antistofkoncentration. Titreringskurver for anti-PSMA J591 antistof i en standardiseret geometri indikerer optimal antistofkoncentration for celle capture.

Selvom J591 antistof er specifikt for PSMA-udtrykkende celler, ikke-specifik leukocytadhæsion har været en stort problem for alle blod-baserede immunocapture teknikker. For at minimere leukocytadhæsion gennemførte vi en parametrisk undersøgelse for at karakterisere kollision sats (CPR; kollision pr række) som en funktion af cellestørrelse og hindring offset. Kollision satser fra en delmængde af disse forskydninger udviser en skarp afskæring ifølge cellestørrelse, som vist i figur 2A; dermed vi valgt en hindring offset (7 um), der genererer en skarp afskæring ved cellediameter på 14 um. Fysikken beskriver denne cutoff er bedst illustreret af størrelse-afhængige celle pathlines (figur 2A), der viser, hvor store celler oplever gentagne sammenstød mens små celler adskilt fra de forhindringer og undslippe fange. Vi derefter testet denne hypotese ved måling indfangning af LNCaP-prostatacancerceller (figur 2B). I dette eksperiment spiked LNCaP-celler blev fløjet ind J591-funktionaliserede indretninger, der havde en 7 um offset (GEDI)

versus

dem, der ikke havde offset (straight). Selv om disse to enheder har samme overfladeareal-til-volumen-forhold, den GEDI geometri stærkt forøget celle capture effektivitet, målt ved indfangede og opregnede celler normaliseret ved input celletal

(A) Venstre:. Top visning af mikrofluid hindring array med arrays geometriske parametre. Δ = hindring offset. Λ = hindring afstand i retningen af ​​bulk-flow. Γ = hindring afstand i retningen vinkelret på bulk-flow. 2

r

= hindring diameter. Strømliner (grå) betegne fluidstrømning. Pathlines (forskellige farver) betegne baner celler med forskellige diametre. Hindring vifte afstand og orientering parametre er også defineret. Højre: Hastigheden af ​​cellevægsenzymer kollisioner for celler, der kører gennem matrixen er en stærk funktion af forskydningen parameter af array; den GEDI design metode indebærer anvendelse af en offset parameter, der fører til størrelsesafhængig sammenstød satser. Resultaterne forudsagt for strømningen gennem geometrien til venstre er vist til højre ved den fuldt optrukne linie; de fire specifikke cellestørrelser føre til resultater, betegnet med de fire farvede prikker på denne graf. Andre geometriske arrangementer fører til forskellige resultater, der er vist til højre i de stiplede og stiplede linjer. (B) Lige arrays eller arrays med små forskydninger (guld kasser) føre til lavere capture effektivitet (til venstre) og størrelse uafhængighed (til højre). Omhyggeligt udvalgte forskydninger (magenta feltet) fører til høje opsamlingsprocent (venstre) og størrelse afhængighed (til højre). Capture satser på venstre sammenligne GEDI (7-um offset) og lige (ingen forskydning) geometri præstationer målt ved LNCaP capture effektivitet på J591-funktionaliserede enheder. Priser på højre beskriver simulerede kollision satser i disse geometrier. Både eksperimentelle resultater har det samme overfladeareal-til-volumen-forhold. (C) Enheder med det samme overfladeareal og volumen-forholdet giver vidt forskellige resultater: lige arrays føre til sammenstød, der sænker som blodet bevæger sig gennem apparatet; Gedi arrays fører til sammenstød, der øger med rejser gennem enheden.

På grund af afhængighed af celle bane på celle diameter, kollision satser er en kompliceret funktion af parametre såsom rækken forskydninger både celle diameter og array- . Kollisionen pr række (CPR) er en stærk funktion af rækken offset, udviser diskontinuitet, størrelse afhængighed, og start virkninger relateret til den endelige array-størrelse (Figur 2C). Den dramatiske forskel mellem udførelsen af ​​forskellige designs er forårsaget af afbøjning af partikler-i dårligt valgte geometrier, afbøjningen får cellerne til at aflede på strømliner, der ikke kommer i nærhed med senere forhindringer, mens der i velvalgte geometrier, de deformation årsager celler til at afbøje onto strømliner, der kommer i nærhed med senere forhindringer. Således kollision stiger som cellerne fortsætte gennem enheden, for at GEDI design, og falder for dårligt udvalgte designs som lige arrays (Figur 2C). Denne cutoff giver brugeren mulighed for at identificere en cutoff mellem hematocytes ( 14 um) og cellen befolkning, der vil opleve maksimale kollisioner ( 15 pm).

Cell capture, billedbehandling, og optælling af CTCs fra metastatisk prostata cancer patienter

Dernæst brugte vi GEDI enheden til at indfange og karakterisere cirkulerende tumorceller (CTCs) fra blodet af patienter med metastatisk CRPC. En ml perifert blod blev fløjet gennem anordningen blev indfangede celler fikseret og immunfarvet for PSMA, CD45, EpCAM og DAPI, og de indfangne ​​celler blev analyseret ved konfokal mikroskopi. CTCs blev defineret som intakt, kerneholdige, PSMA + /CD45- celler. Repræsentative eksempler på CTCs og leukocytter er vist i figur 3A. Interessant PSMA + celler havde variabel EpCAM-farvning, der spænder fra yderst positiv for svag til negative i form af EpCAM fluorescerende intensitet. I en undergruppe af patienter, vi kvantificeret procenten af ​​PSMA-tilfangetagne CTCs der var EpCAM positive. Vi observerede, at 40-70% af GEDI-tilfangetagne CTCs var positive for begge mærker, med medianen op på 60% (data ikke vist). Kontroller for antistof ydeevne blev inkluderet med hver eksperiment ved hjælp af to prostata cancer cellelinjer, der udtrykker forskellige niveauer af PSMA og EpCAM (c4-2: PSMA + /EpCAM + /CD45- og PC3: PSMA- /EpCAM- /CD45-) og CD45 + leukæmi celle U937 (Figur S1A).

(A) Repræsentative billeder af cirkulerende tumorceller taget med GEDI enheden fra 1 ml blod fra patienter med prostatacancer. CTCs er afbildet på enheden og identificeres efter immunfarvning med DAPI, PSMA, CD45, og EpCAM. Intakte, kerneholdige celler, som er PSMA + /CD45- er identificeret som CTCs. Leukocytter er identificeret som DAPI + /PSMA- /CD45 + (nederste række, pil). Bemærk heterogenitet EpCAM udtryk i PSMA + cellepopulationen (øverste og nederste rækker, EpCAM-, midterste række, EpCAM +). Målestokken: 10 um. (B) Sygdom-specifikke GEDI indfangning af CTCs. CTC tælling (CTCs /ml) blev udført under anvendelse af blod fra raske donorer (median = 3) og CRPC patienter (median = 54). (P 0,001; Wilcoxon) (C) Sammenligning af CTC tælling mellem GEDI-based- og CellSearch®-baserede capture. Denne sammenligning blev udført ved hjælp af samme dag blod trækker fra 25 individuelle CRPC patienter. * Angiver, at CellSearch-baserede opregning blev udført 1 uge før GEDI-baserede opregning; ∉ indikerer samme patient, hvis blod blev trukket på to separate tidspunkter med tre måneders mellemrum (blod tegne nr 14 fandt sted 3 måneder efter blod tegne ingen 19); # Indikerer samme patient, hvis blod blev trukket på to separate tidspunkter 1 år fra hinanden (blod tegne nr 22 opstod 1 år inden blod tegne nr 23).

Vi forarbejdet blod fra 10 raske donorer (kontrol ) og 30 patienter med metastatisk CRPC hjælp af GEDI enheden. Den mediane antal CTCs /ml detekteret var 3 (område 0 til 22) og 54 (mellem 0 og 1200), (p 0,001; Figur 3B). Dernæst udførte vi en direkte sammenligning af CTC opsamling og tælling ved at sammenligne GEDI microdevice med FDA-godkendte EpCAM-baserede CellSearch® CTC Test på samme dag blod trækker fra 25 CRPC patienter (figur 3C). Vi har registreret en 2 til 400 gange forøgelse i antallet af CTCs /ml rapporteret med GEDI microdevice forhold til CellSearch ® CTC Test (figur 3C;

s

0,0001, beregnet med Wilcoxon test), og en svag sammenhæng (

r

= 0,44; outliers fjernes med Cooks distance begrænsning) mellem GEDI CTC tæller og CellSearch® (figur S2)

Molekylær karakterisering af indfangede celler: Påvisning af en enkelt. punkt mutation i androgen receptor og udtryk for TMPRSS2-ERG fusion i spidse celler og CTCs

for at vurdere, om vi molekylært kunne karakterisere GEDI-erobrede CTCs, udførte vi proof-of-principle forsøg, hvor prostatakræft celler blev tilsat til 1 ml blod fra en rask donor, fanget af indretningen og analyseret for tilstedeværelse af androgen receptor (AR) punktmutationer eller ekspression af TMPRSS2: ERG genfusion protein. At påvise T868A (ACT-GCT) enkelt punktmutation i AR ligandbindende domæne [19], 50 c4-2 celler blev tilsat til 1 ml rask donor blod strømmet gennem GEDI enheden, og RNA blev ekstraheret ved direkte lysis på enheden efterfulgt af cDNA-sekventering (figur 4A). Parallelt blev sekventering udført på RNA ekstraheret fra 1 ml af den samme donor blod behandles på lignende måde (negativ kontrol) og på RNA ekstraheret fra 50 c4-2 celler (positiv kontrol). Som forventet blev T868A mutationen klart påvist i c4-2 celler (figur 4A, top og midterste panel), men fraværende fra den negative kontrol. Punktmutationen blev også påvist i den spidse blodprøve, med mutanten top (A) tegner sig for 70% af nucleotidet til stede ved denne position, og vildtype (T) i 30%. Dette resultat er i overensstemmelse med den tidligere rapporterede celleindfangningsanordningen renhed på 68% opnået med fluorescensmærkede prostatacancerceller tilsat til 1 ml perifert blod fra en rask donor og strømmet gennem GEDI microdevice [10].

(A ) opfangede celler udviser høj renhed, således at identifikation af individuelle punktmutationer. Den T868A (ACT-GCT; Thr-Ala) AR single-point mutation der registreres fra RNA udvundet fra 50 c4-2 celler tilsat i 1 ml sundt donorblod og fanget af GEDI enhed (tredje række, pil). Sekventering resultater fra 1 ml blod fra samme rask donor (øverste række) eller fra 50 c4-2 celler i kultur (midterste række) er også afbildet. (B) Den TMPRSS2: ERG fusionsprotein detekteres i Gedi-erobrede CTCs fra en CRPC patient. PSMA-tilfangetagne CTCs blev farvet på enheden med et anti-ERG antistof. Repræsentative eksempler på tre PSMA + /CD45- CTCs er vist, hvoraf to er positive for ERG. Scale barer: 10 mikron

Derudover tilstedeværelsen af ​​TMPRSS2:. ERG fusionsprotein kunne påvises ved immunfarvning med kanin monoklonalt anti-ERG antistof [20] i fusion-positive VCap prostatakræft celler fanget af indretningen og analyseret ved multiplex konfokal mikroskopi (figur S3). Lignende analyse på Gedi-fanget CTCs fra en CRPC patient afslørede tilstedeværelsen af ​​både ERG positive og ERG negative celler, mens CD45 + leukocytter var negative for ERG-protein (fig S3, panel C), hvilket indikerer specificiteten af ​​ERG farvning for prostatacancer-afledt celler

Funktionelle analyser:. tubulin bundling ved udsættelse for taxaner

i betragtning af den høje renhed og levedygtighed Gedi-erobrede CTCs, vi næste testede den hypotese, at CTC kemosensitivitet til taxaner efter

ex vivo

behandling på GEDI microdevice kunne forudsige en patients kliniske respons på behandlingen. Taxaner (paclitaxel, docetaxel og cabazitaxel), der er almindeligt anvendt til behandling CRPC patienter [21] – [23] virker ved at stabilisere mikrotubuli polymerer og inducere dannelsen af ​​bundter mikrotubulus. Mikrotubulus bundling er let påviselige ved immunfluorescensfarvning, grundet deres øgede fluorescensintensitet, distinkt form og cytoplasmatisk organisation, når de ses i maksimal signal projektion [24]. Mikrotubuli bundling er den første begivenhed fremkaldt af taxan behandling, hvilket resulterer i downstream mitosestandsning og apoptotisk celledød, og er derfor en passende markør for effektiv taxan drug-target engagement.

For at først afgøre den optimale koncentration og varighed af

ex vivo

on-chip behandling af patient-afledte CTCs, vi spiked 200 c4-2 celler til 1 ml blod fra en rask donor, behandles prøven i GEDI enheden, og derefter inkuberes de erobrede celler på indretningen i 24 timer i medier indeholdende 100 nM eller 1 uM af docetaxel (DTX) ved 37 ° C. Docetaxel behandling med 100 nM resulterede i distinkte mikrotubuli bundter i indfangede c4-2 celler (figur 5A, midterste panel pile), i modsætning til den fine og indviklede mikrotubulus netværk af de ubehandlede Gedi-opfangede celler (figur 5A, øvre panel). Behandling med 1 uM DTX resulterede i robust mikrotubulus bundling og induktion af apoptotiske begivenheder (figur 5A, nedre panel pilespidser). Apoptotiske hændelser blev bestemt ved tilstedeværelsen af ​​lyse og fragmenterede kerner ledsaget af tab af tubulin farvning. Lignende resultater blev opnået med 48 timer, on-chip,

ex vivo

behandling (data ikke vist). Disse resultater, sammen med det faktum, at AUC af serum docetaxel koncentration for patienter administreret 55-100 mg /m

2 af docetaxel er omtrent lig med 1,5-5 timer mg /l [25], førte os til at vælge en 24 hr behandling med 100 nM af et taxan (1,92 timer mg /l) for at evaluere den

ex vivo

respons patient-afledte CTCs.

tubulin respons på taxan behandling kan vurderes i GEDI-opfangede celler. (A) c4-2 prostatacancerceller fik tilsat ved 200 celler /ml i det raske donorer fuldblod. En ml spiked blod blev derefter flød i hver af tre Gedi enheder. Indfangede celler blev inkuberet på hver enhed ved 37 ° C i 24 timer med enten DMSO kontrol (øvre panel) eller DTX 100 nM (midterste panel) eller 1 uM (nedre panel). Efter lægemiddelbehandling blev cellerne fikseret og behandlet for immunfluorescensfarvning anvendelse af antistoffer mod tubulin og CD45. DAPI blev anvendt som en DNA kontrastfarve at vurdere nuklear integritet. Bemærk den fine og indviklede mikrotubuli netværk i DMSO kontrol (øverste panel), og de tydelige mikrotubuli bundter i DTX behandlede enheder (pile, midterste og nederste paneler). Apoptotiske kerner blev observeret ved højere DTX koncentrationer (pilespids, nederste panel). (B) Gedi-fanget CTCs fra blodet af en CRPC patient blev behandlet

ex vivo

på GEDI enhed med 100 nM DTX (øverste panel) eller tilsætning af 100 nM PTX (nederste panel) ved 37 ° C i 24 timer. Efter lægemiddelbehandling de PSMA-opfangede celler blev fikseret og forarbejdet til immunfluorescensfarvning som i (A) med tilsætning af cytokeratin-18 som alternativ epithelial markør. I denne patient, tilstedeværelsen af ​​en uforstyrret mikrotubulus-netværk efter DTX behandling (øverste panel) indikerer mangel på effektiv drug-target engagement. I modsætning hertil tilsætning af PTX resulterede i mikrotubulus bundtning (nederste panel).

En række assays er blevet udført for at vise muligheden for funktionel analyse i det beskrevne apparat. I disse tilfælde blev celler fanget i enheden behandlede

ex vivo

med DTX og /eller PTX i 24 timer (figur 5B og S3). Disse fremhæver evnen til at udføre funktionelle assays på chip og assay lægemiddel-target engagement hos patienter i forbindelse med deres kliniske respons. Ikke-respons, som indikeret ved en mangel på beviser for mikrotubuli bundling eller apoptotiske kerner efter

ex vivo

DTX behandling, kunne observeres hos nogle patienter. Figur S4C viser en patient, der var ikke-responsiv af mikrotubuli assay, i overensstemmelse med denne patients manglende klinisk respons ved hjælp fastlagte kriterier RECIST og PSAWG2. Fig.