PLoS ONE: Undersøgelse af stråling-induceret Transkriptomet Profil af radioresistente ikke-småcellet lungekræft A549 Cells Brug RNA-seq

Abstrakt

Radioresistance er en vigtig hindring for effektiv strålebehandling for ikke-småcellet lungekræft ( NSCLC). Trods flere forsøg og kliniske undersøgelser af resistens over for stråling, stadig uklart, den præcise mekanisme for radioresistance i NSCLC celler og væv. Dette resultat kan forklares ved begrænsning af tidligere undersøgelser, såsom en delvis forståelse af den cellulære radioresistance mekanisme på et enkelt molekyle niveau. I denne undersøgelse var det et mål at undersøge omfattende stråling responser i radioresistente NSCLC-celler og til at identificere radioresistance-associerende faktorer. For første gang, ved hjælp af RNA-seq, en massiv sekventering tilgang, vi undersøgte hel-transkriptom ændring i radioresistente NSCLC A549 celler under bestråling, og verificeret betydelige stråling-ændrede gener og deres kromosom distributionsmønstre. Også blev bioinformatiske metoder (GO analyse og IPA) udført for at karakterisere den stråling reaktioner i radioresistente A549 celler. Vi fandt, at epitelial-mesenkymale overgang (EMT), migration og inflammatoriske processer kan meningsfuldt relateret til regulering af stråling reaktioner i radioresistente A549 celler. Baseret på resultaterne af bioinformatik analyse for stråleinduceret transkriptom ændring, valgte vi syv væsentlige stråling-ændrede gener (

SESN2, FN1, TRAF4, CDKN1A, COX-2, DDB2

og

FDXR

) og sammenlignes derefter stråling virkninger i to typer NSCLC celler med forskellige radiosensitivitet (radioresistente A549-celler og radiosensitive NCI-H460-celler). Interessant, under bestråling,

COX-2

viste den mest markante forskel i mRNA og proteinekspression mellem A549 og NCI-H460-celler. IR-inducerede stigning af COX-2-ekspression blev optrådte kun i radioresistente A549-celler. Kollektivt, foreslår vi, at COX-2 (også kendt som prostaglandin-endoperoxid syntase 2 (PTGS2)) kunne have mulighed som en formodet biomarkør for radioresistance i NSCLC celler

Henvisning:. Yang HJ, Kim N, Seong KM , Youn H, Youn B (2013) Undersøgelse af Stråling-induceret Transkriptomet Profil af radioresistente ikke-småcellet lungekræft A549 Cells Brug RNA-seq. PLoS ONE 8 (3): e59319. doi: 10,1371 /journal.pone.0059319

Redaktør: Eric Y. Chuang, National Taiwan University, Taiwan

Modtaget: November 15, 2012; Accepteret: 13 februar 2013; Udgivet: 22 Mar 2013

Copyright: © 2013 Yang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Nuclear Research Development Program (2012-0006383) og Basic Science Research Program (2012-0003201) gennem National Research Foundation Korea finansieret af Ministeriet for Uddannelse, Videnskab og Teknologi. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. KMS i øjeblikket medarbejdere i Radiation Health Research Institute, Korea Hydro Nuclear Power Co, Ltd Andre forfattere erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikter. Der er ikke yderligere patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Strålebehandling, alene eller i kombination med kirurgi eller kemoterapi, spiller en afgørende rolle i behandlingen af NSCLC. Men de terapeutiske resultater er ikke fuldt tilfredsstillende i mange tilfælde. Med uventede stråling reaktioner under strålebehandling, (iboende /erhvervet) radioresistance betragtes som en væsentlig faktor, som begrænser effekten af ​​strålebehandling for NSCLC [1].

radiosensitivitet af celler og væv har været knyttet direkte til opformeringsrater , og strålingsinducerede modifikationer af genekspression deltager fortrinsvis i cellecyklusprogression, DNA-reparation og apoptose [2]. Radioresistance i NSCLC er blevet forbundet med tab af p53-funktion, ændret ekspression af overlevelse proteiner, såsom X-linked inhibitor af apoptose protein (XIAP) og survivin, aktivering af phosphoinositid 3-kinase (PI3K) /Akt signalering [3], eller overekspression af Pim-1-kinase [4]. Også, akkumulering tyder på, at radioresistance ofte er korreleret med epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) og overekspression af anti-oxidant enzymer, såsom Mn-superoxiddismutase (Mn-SOD) [5], [6]. Selv om disse undersøgelser har bidraget til forståelsen af ​​mekanismerne for cellulære radioresistance, kan de forklare kun en delvis aspekt af radioresistente reaktioner, og de omfattende funktionelle mekanismer stort set undvigende. Dette resultat er ikke overraskende i betragtning af arten af ​​radioresistance reguleret af komplekse vekselvirkninger mellem flere gener og /eller proteiner. Desuden er der flere rapporter om, at radiosensitivitet ikke udelukkende relateret til stråling-induceret apoptose, og kan afhænge af flere molekyler og processer, som endnu ikke er blevet identificeret [7]. Derfor har det været vanskeligt at klarlægge den nøjagtige mekanisme af radioresistance og forstå hele ændring af stråling responser i NSCLC.

Omfattende genekspression profilering analyse kan øge fortolkning af den molekylære mekanisme for radioresistance moduleret af komplicerede genetiske og biokemiske netværk. Microarray er den mest omfattende tilgang til at måle genekspression og har ført til udestående forskud i viden om radioresistance [8], [9]. Men microarray har flere begrænsninger, såsom sonde hybridiseringskinetik, sonde valg (brug for at vide genomisk loci og faciliteter), baggrund hybridisering og cross-platform sammenlignelighed [10]. er udviklet sekventering baseret ekspressionsanalyse at overvinde disse begrænsninger i hybridisering-assay. I løbet af de seneste 10 år, har indførelsen af ​​high-throughput næste generation sekventering (NGS) teknologier revolutioneret transcriptomics ved at skabe muligheder for flerdimensionelle studier af cellulære transcriptomes. Det bliver muligt, fordi store udtryk data er erhvervet til en enkelt-base-opløsning. Som en primær kvantitativ transkriptom profilering platform har RNA-seq blevet betragtet som en ny eksperimentel fremgangsmåde til at erstatte mikroarray. I RNA-seq, (total eller messenger) RNA population omdannes til et bibliotek af cDNA-fragmenter med adaptere fastgjort til den ene eller begge ender. Hvert bibliotek, med eller uden amplifikation, er derefter sekventeret til opnåelse kort sekvens læser fra den ene ende (single-ende-sekventering) eller begge ender (parret ende sekventering). De læste sekvenser er typisk 30-400 bp i længde, afhængigt af sekventering platforme: Illumina, Roche 454 eller fast system. Efter sekventering, læser den resulterende enten tilpasset henvisning genom eller udskrifter, eller samles

de novo

uden den genomiske sekvens [11]. På grund af høj dybde af læse- dækning, RNA-seq giver en mere præcis måling for niveauer af transkripter og deres isoformer end andre værktøjer. Desuden kan det anvendes til at undersøge transcript strukturer i forbindelse med transcription start sites, alternativ splejsning mønstre og andre post-transkriptionelle modifikationer. RNA-seq er blevet anvendt til at identificere lange ikke-kodende RNA, som spiller en vigtig rolle i transkriptionel og posttranslationel genregulering [11].

Indtil nu har der ikke været nogen undersøgelser for at vurdere de globale stråling svar på hele transkriptom niveau i NSCLC celler. Vi fokuserede på RNA-seq at overvinde begrænsningerne af tidligere undersøgelser indikerer noget fragmentariske beviser på radioresponses, og derefter foreslået, at RNA-seq kunne være en ideel metode til at få indsigt i den komplekse stråling respons. I denne undersøgelse, vi havde til formål at karakterisere transkriptom af radioresistente NSCLC A549 celler og til at undersøge funktionelle regulerende net på det genetiske niveau. For at nå disse mål, gjorde vi fuld brug af en strategisk kombination af RNA-seq-afledte genekspression data og resultaterne af bioinformatiske og biologiske assays. Det er den første undersøgelse at anvende denne nye teknologi, RNA-seq til profil strålingsinduceret genekspression i radioresistente NSCLC-celler. Vi foreslår, at vores resultater kunne give nyttige oplysninger til identifikation af potentielle biomarkører for radioresponses såsom radioresistance, og i sidste ende bidrage til at forstå den stråling effekter i NSCLC celler.

Materialer og metoder

Reagenser

Cell dyrkningsmedier (RPMI 1640), blev FBS og antibiotika (penicillin og streptomycin) erhvervet fra Hyclone (Logan, UT). Antistoffer mod EGFR, p53, Sestrin2, COX-2, TRAF4 og β-actin blev købt hos Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Antistoffer for phospho-EGFR (Tyr1068), phospho-EGFR (Tyr845), phospho-Akt (Ser473), phospho-Akt (Tyr308), Akt, phospho-p53 (Ser15), p21 og fosfatase og tensin homolog (PTEN) er erhvervet fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Antistof mod γ-H2A.X (Ser139) blev erhvervet fra Millipore (Billerica, MA). Antistof til FDXR blev købt fra Abcam (Austin, TX).

Cell Kultur og Bestråling

Menneskelig NSCLC cellelinjer (A549 og NCI-H460) blev erhvervet fra koreanske cellelinje Bank (Seoul, Republikken Korea). Begge celler blev dyrket i RPMI 1640-medium suppleret med penicillin (100 U /ml), streptomycin (100 U /ml) og 10% FBS. Celler blev udsat for ioniserende stråling (IR) ved hjælp af

137Cs γ-strålerøret (IBL 437C, CIS Bio International) i en dosis på 0,8 Gy /min. Bestrålede celler blev inkuberet i yderligere 4 timer.

RNA-seq Bibliotek Forberedelse og sekventering

Totalt RNA blev isoleret fra bestrålede og ikke-bestrålede A549 celler under anvendelse RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA). RNA kvalitet blev vurderet ved agarosegelelektroforese (visuel fravær af signifikant 28S og 18S rRNA nedbrydning) og ved spektrofotometri. Dernæst blev total RNA integritet kontrolleres ved anvendelse af en Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer med en RNA integritet nummer (RIN) værdi større end 8. mRNA blev oprenset og fragmenteret fra totalt RNA (2 ug) ved anvendelse af poly-T oligo-attached magnetiske perler med to runder af oprensning. Spaltede RNA-fragmenter primet med vilkårlige hexamerer blev revers transkriberet til første-streng cDNA under anvendelse af revers transkriptase og vilkårlige primere. RNA-templaten blev fjernet og syntetiseret en udskiftning streng til at generere dobbeltstrenget cDNA. End reparation, A-hale, adaptorligering, cDNA skabelon oprensning og berigelse af de rensede cDNA skabeloner ved hjælp af PCR blev derefter udført. Opført biblioteker var 100 bp parret ende sekventeret ved en Illumina GAIIx sequencer på to baner af flowcellen, efter producentens anvisninger.

Gene Ontology (GO) Analyse

GO analyse er et almindeligt anvendt metode til funktionelle studier af store genomiske eller transkriptomisk data [12]. Gene Ontology Enrichment Analysis Software Toolkit (GOEAST, https://omicslab.genetics.ac.cn/GOEAST/php/illumina.php) blev anvendt til at identificere betydeligt beriget GO termer blandt den givne liste af gener, der udtrykkes forskelligt i afhængighed til IR. Statistisk overrepræsenteret GO kategorier med p-værdi. 0,01 blev betragtet som signifikante

Ingenuity Pathway Analysis (IPA)

IPA software (Ingenuity System, Redwood City, CA) blev anvendt til at analysere vores RNA -seq data i form af biologiske reaktioner og kanoniske veje. Ranking og betydningen af ​​de biofunctions og de kanoniske veje blev testet ved p-værdien. Derudover blev kanoniske pathways bestilt af forholdet (antal gener fra input datasæt, til virksomheden pathway divideret med det samlede antal molekyler, der findes i den kanoniske pathway). IPA også genereret mobilnetværk, hvor forskelligt regulerede gener kan relateres efter i forvejen kendte sammenslutninger mellem gener eller proteiner, men uafhængigt af etablerede kanoniske veje. Top netværk repræsenteret associative netværk funktioner baseret på en score, der anser -log (

s

-værdi), der samler sandsynligheden for generne i netværket bliver fundet sammen på grund af tilfældig chance. Score ≥2 blev betragtet som signifikant.

Real-time Reverse Transcription (RT) -PCR

Total RNA blev udsat for RT med tilfældige hexamerer hjælp af SuperScript First-Strand Synthesis System (Invitrogen, Carlsbad , CA) til opnåelse af cDNA’er. Real-time PCR blev udført under anvendelse af en Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) ifølge producentens instruktioner. Threshold cykler (Ct) blev automatisk beregnet af Mastercycler ep realplex (Eppendorf, Hamburg, Tyskland). PCR tilstand var som følger: polymerase aktivering ved 95 ° C i 10 minutter, efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 15 sek, 60 ° C i 1 min. Intensiteten af ​​hvert gen blev normaliseret mod GAPDH-ekspression. Differentiel ekspression blev beregnet som et forhold mellem ekspressionsniveauerne af målgener i bestrålede og ikke-bestrålede celler, ifølge ΔΔ C

t

metode [13]. For alle primere parvis blev specifik amplifikation af PCR-produkterne bekræftet ved smeltekurveanalyse og agarosegelelektroforese. Primere blev konstrueret under anvendelse af Primer Express® 4.0 (Applied Biosystems, Foster, CA) og sekvenserne er vist i tabel 1.

Western blot-analyse

Efter 4 timer bestråling, total celle lysater (5 x 10

6 celler) blev fremstillet under anvendelse RIPA lysebuffer (50 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM NaF, 1 mM EDTA, 1 mM Na

3VO

4, 1 mM PMSF, 0,25% Na-deoxycholat, og 5 U /ml aprotinin). Til Western blot-analyse, denatureret proteinlysater (40 ug) blev underkastet SDS-PAGE. Adskilte proteiner blev overført til en nitrocellulosemembran og blokeret med 5% skummetmælk i TBST (10 mM Tris, 100 mM NaCl og 0,1% Tween 20) i 1 time ved stuetemperatur. Membranerne blev derefter undersøgt med specifikke primære antistoffer, efterfulgt af peroxidase-konjugeret sekundært antistof, og fremkaldes med et ECL detektionssystem (GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, England).

Resultater

Design af RNA-seq Study in radioresistente NSCLC Celler

Hver cellelinje afledt fra NSCLCs er blevet rapporteret for deres forskellige radiosensitivitet. A549 celler, en velkarakteriseret radioresistente NSCLC cellelinje, viser signifikant tolerance over for stråling og beskedne tab af cellelevedygtighed efter udsættelse for IR [4], [14]. I denne undersøgelse vil vi gerne undersøge stråling-induceret hel transkriptom ændring i radioresistente NSCLC celler ved hjælp RNA-seq, og desuden at identificere radioresistance-associerende faktorer (potentielle biomarkører for radioresistance). For at kontrollere de passende eksperimentelle betingelser for RNA-seq analyse undersøgte vi den tidsafhængige udtryk for flere proteiner kaldet radioresponsive faktorer [15], [16], [17] i radioresistente NSCLC A549 celler under bestråling. Også overvejer kumulative virkninger af stråling, blev strålingsdosis sat til 2 Gy. Dette var inden for dosisintervallet indgives typisk i stråling biologi forsøg med celler [18]. Som vist i fig. 1A, ekspressionsniveauerne af phospho-EGFR (Tyr845), phospho-Akt (Ser473) og p21 viste en maksimal stigning på 4 timer efter bestråling. Derudover IR-induceret PTEN udtryk blev gradvist reduceret, mens phosphoryaltion af Akt på Ser473 blev øget i en tidsafhængig måde.

(A) Bestemmelse af passende bestråling tilstand baseret på ekspressionen af ​​repræsentative radioresponsive proteiner. (B) En skematisk diagram for design og mål for vores undersøgelse. TopHat justerer RNA-seq læser for genome reference (hg19) og finder udskrift splejsningssteder. Manchetknapper samle læser genereret fra TopHat tilpasning til udskrifter. Manchetknapper Pakken består af følgende software – Manchetknapper samler transcrips; Cuffcompare, sammenligner afskrift forsamlinger til annotation; Cuffdiff, finder differentielt udtrykte gener og udskrifter.

Efter formålet med forsøget, sekventering platforme, læse længder og sekventering typer skal være korrekt bestemmes. Disse eksperimentelle betingelser er tæt relateret til effektiviteten af ​​RNA-seq analyse. Illumina sekventering platform forekommer meget replikerbar med relativt lidt teknisk variation såsom transkript-længde skævhed [19]. Det viser en større transkriptom dækning og sekventering dybde [10]. Desuden parret-ende-sekventering er til rørledninger kvalitativ analyse såsom transkriptionsstartstedet kortlægning, detektion af genfusion udskrifter og alternativ splejsning, og kortlægning af genomiske strukturelle varianter, herunder deletioner, insertioner og omlejringer [20]. På baggrund af disse forskningsresultater, efter 4 timers bestråling, blev total RNA isoleret fra bestrålede og ikke-bestrålede radioresistente A549 celler, der anvendes til at skabe Illumina RNA-seq bibliotek og derefter udsat for 100 bp parret ende sekventering hjælp Illumina GAIIx platform. Et skematisk diagram for udformningen og mål for vores undersøgelse er vist i fig. 1B

Identifikation af Radioresponsive Gener i radioresistente NSCLC Celler gennem Transkriptomet Analyse

I alt antal RNA-seq læser (resultat format: FASTQ). Erhvervet fra bestrålede og ikke-bestrålede radioresistente NSCLC A549 celler, var 32.315.026 (6527635252 bp) og 31.084.922 (6279154244 bp), hhv. Vi justeret sekvensen læser til et humant genom reference (hg19) ved hjælp TopHat udgave 1.2.0. Splejsesamlinger blev udvundet fra RefSeq alignment (downloades fra University of California, Santa Cruz (UCSC) Genom Browser). I alt mindst én ender af 28.372.827 (87,8%) og 27.514.052 (88,5%) læser for de bestrålede og ikke-bestrålede A549 celler henholdsvis lykkedes kortlagt mod hg19. Dernæst de resulterende læste alignments (filformat: BAM) blev samlet gennem Manchetknapper udgave 1.0.3, og det skabte en ny udskrift hjælp Manchetknapper henvisning annotation-baserede udskrift (RABT) algoritme. Transkripterne kombineret af Cuffcompare blev anvendt til at beregne relative mængder af hver transkript gennem Cuffdiff. Genekspressionsniveauer blev bestemt ved måling af summen af ​​fragmenter pr kilobase i exon model per million kortlagt læser (FPKM) værdi af dets exoner. At erhverve mere præcise resultater, vi filtreret ud hver data, hvis skønnede FPKM værdier i både bestrålet og ikke-bestrålet prøve var mindre end 1,0 (jf FPKM værdi på 0,05, da den nedre grænse udtryk niveau er almindeligt indstillet). I sidste ende, vi identificeret, at 727 gener blev signifikant udtrykkes forskelligt i radioresistente A549-celler efter bestråling. Blandt disse gener, blev 367 gener opreguleres, og 360 gener blev nedreguleret. Ifølge cellulære funktionelle kategorisering, var signifikant up-regulerede gener klassificeres som følger: cellecyklus (

CDKN1A, MLL5, NEK11, TP53INP1

), reparation (

DDB2, REV3L, SESN1, SESN2, XPC

), celledød (

ACER2, BTG2, MDM2, MEF2A, OPA1, PLTP, TRIAP1

), lipid metabolisme (

COL4A3, COX-2

), cellevækst og proliferation (

DOK1, EIF2AK2, FDXR, DFRK, GDF15, GSTM1, PDK1, PGF, PIK3IP1, PPM1D, RHOBTB2, SH3BP2, SHBG, SLC22A1

) og immunsystemet reaktioner (

foxp3, TNFSF9

). Også, var signifikant ned-regulerede gener klassificeres som følger: cellecyklus (

cdc42, MT2A, SPC25, STAT5A

), reparation (

H2AFX, PDE11A, XRCC3

), cellulære udvikling (

GPER, ICAM2, OPHN1

), celledød (

CARD8, CEACAM1, PTPRG, ST6GAL1

), cellevækst og proliferation (

BAI1, F3, KLF11, MNT, MORF4L1, MYC, ROMO1 , SMAD1, ST7L, TBXA2R

) og immunsystemet reaktioner (

IL12A

). Detaljerede resultater er vist i Datasæt S1, tabel S1 og tabel S2.

Desuden at kontrollere de karakteristiske kromosomale placeringer af gener, der kontrollerer stråling responser undersøgte vi ekspressionen landskab tværs hele kromosomer ved at undersøge ændringer i genekspression i bestrålede radioresistente A549-celler. I 400 kb glidende vindue, antallet af differentielt udtrykte gener af A549 celler som respons på IR, er afbildet sammen med de hele kromosomer under anvendelse custom-styr UCSC Genome Browser (fig. 2). Vi fandt, at kromosom distributionsmønstre spænder varieret med hensyn til gen-tæthed, og især kromosom 19 udviste den højeste gen tæthed af kortlagte gener. I radioresistente NSCLC A549 celler, blev et stort antal gener, der viser IR-ændret ekspression beliggende på kromosom 1, 2, 3 og 19. Men vi kunne ikke få meningsfuld information direkte sammenhæng mellem stråling responser og disse kromosom distributionsmønstre.

(x-aksen: kromosom koordinat, y-aksen: antallet af differentielt udtrykte gener af A549 celler under bestråling i 400 kb glidende vindue).

Undersøgelse af Stråling-induceret Transkriptomet Ændring i radioresistente NSCLC celler gennem GO analyse

Inden en given gen sæt (microarray eller NGS eksperimentelle datasæt), GO-baserede funktionel analyse giver statistisk berigede GO vilkår, der beskriver genprodukter og demonstrere deres relationer efter tre ontologi kategorier: biologisk proces, molekylær funktion og cellulære komponent [12]. For at analysere vores RNA-seq data baseret på grupper af funktionelt beslægtede gener i stedet for de enkelte gener, vi brugte GOEAST som en web-baserede high-throughput funktionelle genomisk analyse værktøj. Vi derefter identificeret væsentligt beriget GO vilkår og karakteriseret stråling svarene fra radioresistente NSCLC A549 celler. I alt blev beriget GO vilkår fundet i 77 underkategorier under biologisk proces, 17 underkategorier under cellulære komponent, og 50 underkategorier under molekylær funktion. I biologisk proces ontologi, resultaterne viste, at nukleare lokalisering, TGF-β-receptor-signalvejen, cellecyklus arrest, celle migration, serin /threonin-kinase signalvejen, angiogenese, BMP signalvejen, og regulering af celle morfogenese er hovedsageligt forbundet med radioresponses i radioresistente A549-celler. Fokal adhæsion var en af ​​de store cellulære komponenter modificeret ved IR. Betydelig GO berigelse profiler i den biologiske proces og cellulære kategorier komponent (kun p-værdi mindre end 0,01) er sammenfattet i tabel 2. Vi bestemt også overrepræsenterede GO vilkår i et grafisk format i henhold til deres relationer i det hierarkiske træ molekylære funktion ontologi (fig. 3). Beriget GO molekylære funktionsudtryk i radioresistente A549-celler under bestråling blev β-galactosid α-2,6-sialyltransferase aktivitet, pyruvatdehydrogenase-kinase aktivitet, TGF-β-receptor aktivitet, GTP binding, protein transmembrane transportør aktivitet, filamin binding og activin receptor aktivitet. Gennem GO analyse, fandt vi, at overrepræsenteret GO vilkår i vores radioresponsive gen-apparater, er tæt knyttet til EMT, migration og yderligere angiogenese. Med inddragelse af fokale vedhæftning komponenter, TGFp /BMP-signalering, filamin binding og activin receptor aktivitet, er blevet rapporteret at regulere ændring af cellemorfologi under EMT eller cellevandring. Tilsammen foreslår vi, at EMT og EMT-relaterede begivenheder kan være kritisk i regulering stråling reaktioner i radioresistente A549 celler under bestråling.

Hver kasse har GO vilkår mærket ved sin GO ID, term definition og detaljerede oplysninger, der repræsenterer ‘ k /m | t /k (p-værdi) “.

q

er antallet af gener, der er forbundet med det børsnoterede GO ID (direkte eller indirekte) i vores datasæt,

m

er antallet af gener, der er forbundet med det børsnoterede GO ID (direkte eller indirekte ) på den valgte platform,

k

er det samlede antal gener i vores datasæt,

t

er det samlede antal af gener på den valgte platform, og p

–

værdi repræsenterer betydningen af ​​berigelse i datasættet af det børsnoterede GO ID med hypergeometriske fordeling. Filialer af GO hierarkisk træ uden væsentligt beriget GO termer er ikke præsenteret. Graden af ​​farvemætning for hver kasse er positivt associeret med berigelse betydning for den tilsvarende GO sigt. Markant beriget GO termer er angivet i gule bokse. Ubetydelige GO vilkår inden for det hierarkiske træ er vist som hvide kasser. Pile viser korrelationer mellem forskellige GO vilkår. Røde pile afslører relationer mellem to beriget GO vilkår, sorte solide pile afslører relationer mellem berigede og ikke-stimulusberigede vilkår, og sort stiplede pile afslører relationer mellem to stimulusberigede GO vilkår.

Undersøgelse af Stråling-induceret transkriptom Ændring i radioresistente NSCLC celler gennem IPA analyser

IPA blev udført for funktionel analyse af vores radioresponsive gen sæt erhvervet fra RNA-seq. Som et resultat, vi kontrolleret 25 netværk, top biofunctions (22 sygdomme og lidelser og 27 molekylære og cellulære funktioner) og 177 beskæftiget med stråling-induceret transkriptom ændring i radioresistente A549 celler kanoniske veje. De mest signifikant relateret biofunctions og kanoniske pathways (kun p-værdi mindre end 0,01) er vist i tabel 3. Ud fra resultaterne i IPA biofunctions under sygdomme og lidelser kategori, vi først foreslået at immunologiske /inflammatoriske responser kunne meningsfuldt forbundet med reaktioner IR i radioresistente A549-celler. Desuden blandt 25 netværk, top syv netværk suppleret med IPA-score, antal fokus gener, biofunctions, og nav gener /hub-interagerende partnere er præsenteret i tabel 4. Den høje scoringsfunktioner i nettene var celledød, bindevæv væv udvikling og funktion, cellecyklus, lipidmetabolisme, DNA-reparation, celledød, cellemorfologi og immuncelle trafficking. De øverste tre scoring netværk, som kunne være betydeligt ansvar for radioresponses i radioreisistant A549-celler, er illustreret i fig. 4. De detaljerede cellulære funktioner af hvert netværk var som følger: (i) celledød, post-translationel modifikation, og protein foldning (IPA-score på 38), (ii) kræft cellulære udvikling og bindevæv udvikling og funktion ( IPA-score på 37), og (iii) cellecyklus, cellulære udvikling, og hæmatologiske system, udvikling og funktion (IPA-score på 37). 20 hub gener som vigtige regulatorer af stråling reaktioner i radioresistente A549 celler, blev præsenteret i tabel 4. De var som følger:

AR, BID, CAMK2D, cdc42, CDKN1A, DLG4, EIF2AK2, IFIT3, MEF2A, MDM2, MYC, MYOCD, NFKB2, NOTCH1, COX-2, pTk2-, SMAD1, SMAD5, TRAF1

og

XPC

. De fleste hub gener i nettene er hovedsageligt associeret med cellecyklus, celleproliferation og apoptose. Men med immunologiske /inflammatoriske responser i biofunction kategori nævnt tidligere, er det værd varsel at COX-2 spiller en kritisk regulatorisk rolle i inflammation blev påvist som en hub gen involveret i stråling responser af radioresistente NSCLC A549-celler.

(A) netværk for celledød, posttranslationel modifikation, og protein foldning (score: 38). (B) Netværk for cellulære udvikling, bindevæv udvikling og funktion, og kræft (score: 37). (C) Netværk for cellecyklus, cellulære udvikling, og hæmatologisk system, udvikling og funktion (score: 37). Netværk vises grafisk som knudepunkter (gener /gen produkter) og kanter (biologiske relationer mellem noder). Intensitet for knuden farve indikerer graden af ​​regulering (rød: opregulering, grøn: nedregulering, hvid: ikke differentielt udtrykte men relateret til dette netværk). Vejviser

real-time RT-PCR Validering af RNA-seq resultater

Gennem GO analyse og IPA, fandt vi, at EMT-associerede begivenheder, celle migration og inflammatoriske proces er tæt forbundet med stråling reaktioner i radioresistente NSCLC A549 celler. Vi yderligere undersøgt forholdet mellem disse radioresponses og hub generne /hub-interagerende gener i IPA netværksanalyse. Baseret på resultaterne, valgte vi syv mulige kandidatgener for betydelige stråling-ændrede faktorer (

SESN2, FN1, TRAF4, CDKN1A, COX-2, DDB2

og

FDXR

). For at validere præcisionen af ​​vores RNA-seq data, blev real-time RT-PCR udført på disse udvalgte syv gener. Det blev udført under de samme betingelser som dem, der anvendes til RNA-seq analyse. En sammenligning af fold ændringer mellem RNA-Seq og real-time RT-PCR for hvert gen (

SESN2, FN1, TRAF4, CDKN1A, COX-2, DDB2

og

FDXR

) vises i fig. 5A. Som et resultat, vi kontrolleret, at real-time RT-PCR udtryk profiler var i næsten fuldstændig enighed med RNA-seq data. Selv om der var små forskelle i de fold ændre værdier mellem to målemetoder, blev disse resultater generelt meget relateret, kraftigt støtter pålideligheden af ​​vores RNA-seq analyse.

(A) Korrelation af forskellig ekspression mellem RNA- seq og real-time RT-PCR. Loggen

2 forhold blev frembragt ved at sammenligne ekspressionsniveauerne i bestrålet til ikke-bestrålede radioresistente A549-celler. (B) Forslag af genekspression-baserede formodede biomarkører for radioresistance i NSCLC celler. Amplifikation af GAPDH-fragment i PCR blev anvendt som kontrol. Resultaterne blev bekræftet ved tre uafhængige forsøg. Dataene blev præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse (SD) og analyseret under anvendelse af envejs ANOVA på sorteret data, efterfulgt af en Tukeys ærligt signifikant forskel test og tovejs ANOVA på sorteret data, efterfulgt af en Bonferroni slutværdierne anvendelse af Prism 4 (GraphPad Software, San Diego, CA). * P-værdi 0,05; bestrålede celler vs. kontrol celler, ** p-værdi 0,01; bestrålede celler vs. kontrol celler, *** p-værdi 0,001; bestrålede celler vs. kontrol celler.

Identifikation af Kandidater til Radioresistance-associerende Faktorer i NSCLC Celler

A549 og NCI-H460 celler kan bruges som modeller for radioresistente og radiosensitive NSCLC celler henholdsvis på grund af deres betydelige forskelle i radiosensitivitet [4], [14]. For at verificere, om

SESN2, FN1, TRAF4, CDKN1A, COX-2, DDB2

og

FDXR

kunne relateres til cellulær radioresistance i NSCLC celler, mRNA ekspressionen af ​​disse gener blev sammenlignet mellem radioresistente A549 og radiosensitive NCI-H460 celler gennem real-time RT-PCR (fig. 5B). Resultaterne viste, at

COX-2

og

CDKN1A

viser signifikant forskellige udtryk mønstre i begge cellelinier som reaktion på IR. Under bestråling, den mest differentielt udtrykte gen mellem A549 og NCI-H460 celler var

COX-2

. I radiosensitive NCI-H460 celler,

COX-2

blev ikke påvist, selv efter bestråling. I 50 cyklus realtids-PCR tilstand, IR inducerede kun beskeden ekspression af

COX-2

. Som vist i fig. Som vist i fig.