PLoS ONE: Anti-Cancer Property af proteiner udvundet Gynura procumbens (Lour.) Merr

Abstrakt

Gynura procumbens

(Lour.) Merr. tilhører Asteraceae familie. Anlægget er en velkendt traditionel urt i Sydøstasien, og det er almindeligt anvendt til behandling af inflammation, nyre ubehag, højt kolesteroltal, diabetes, kræft og forhøjet blodtryk. Vores tidligere undersøgelse viste tilstedeværelsen af ​​værdifulde planteforsvarsmekanismer proteiner, såsom peroxidase, thaumatin-lignende proteiner og miraculin i blade af

G. procumbens

. Virkningerne af disse forsvarsmekanismer proteiner på cancere er aldrig blevet bestemt tidligere. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi bioaktiviteten af ​​gelfiltrering fraktioneret proteiner af

G. procumbens

blade ekstrakt. Den aktive proteinfraktion blev SN-F11 /12, viste sig at inhibere væksten af ​​en brystcancer-cellelinie, MDA-MB-231, ved en EC50 værdi på 3,8 ug /mL. De mRNA udtryk for proliferationsmarkører, Ki67 og PCNA, blev reduceret markant i de MDA-MB-23 celler behandlet med SN-F11 /12. Ekspressionen af ​​invasion markering, CCL2, blev også fundet reduceret i de behandlede MDA-MB-231-celler. Alle disse resultater fremhæve den anti-cancer egenskab SN-F11 /12, derfor proteinerne i denne fraktion kan være en potentiel kemoterapeutisk middel for brystkræftbehandling

Henvisning:. Hew CS, Khoo BY, Gam LH (2013) Anti-Cancer Property af proteiner udvundet fra

Gynura procumbens

(Lour.) Merr. PLoS ONE 8 (7): e68524. doi: 10,1371 /journal.pone.0068524

Redaktør: Natarajan Aravindan, University of Oklahoma Health Sciences Center, USA

Modtaget: Marts 6, 2013; Accepteret: 29 maj 2013; Udgivet: 11. juli 2013 |

Copyright: © 2013 Hew et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af RUC bevilling fra Universiti Sains Malaysia (Projektnummer: 1001 /PFARMASI /815.034). Forfatterne takker også Instituttet for kandidatstudier af Universiti Sains Malaysia for at give stipendium til Tilhug Chaw-Sen. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Mange af de for tiden tilgængelige lægemidler er plante-baseret, og plante peptider og proteiner har vist sig at være en kritisk kilde til biologiske forbindelser, der udviste bioaktiviteter der kan udnyttes som lægemiddel. Blandt de aktiviteter, der opdagede var anti-tumor aktivitet af peptider udvundet fra

Hypericum perforatum, Chelidonium majus L

.,

Inula helenium L

.,

Equiseteum arvense L

. og

Inonotus obliquus

[1]; anti-HIV egenskab makrocykliske peptid udvundet fra

Palicourea

kondensat [2]; anti-mikrobielle aktivitet af thaumatin-lignende proteiner udvundet af maltbyg [3] og i forskellige typer af planternes proteiner [4]. De plantebaserede produkter, herunder proteiner og små molekylære forbindelser er blevet foreslået som de gunstige lægemidler til cancerbehandling i betragtning af de mange bivirkninger udøvet af nuværende kræftbehandling, nemlig kemoterapi og strålebehandling. Desuden er disse behandlinger er dyre, hvilket kan være en byrde for patienterne. Planter indeholder forskellige aktive stoffer, der kan anvendes som medicin til behandling af sygdomme, såsom brystcancer [5]. Brystkræft er den hyppigste dødsårsag som følge af cancer blandt kvinder på verdensplan [6]. Selvom strålebehandling og kemoterapi er regelmæssige former for behandling givet til cancerpatienter, effektiv behandling for brystcancer er begrænsede. I lyset af dette bør der tages betydelig indsats for at stræbe efter effektive midler fra anlæg til at identificere mere nye midler til både forebyggelse og behandling af humane kræftformer.

Gynura procumbens

(Lour.) Merr . er en velkendt traditionel urt i Sydøstasien. Planten hører til Asteraceae familie. Dette anlæg er omkring 10-25 cm høj, og det præsenteres med saftige, elliptisk og blanke lilla blade [7]. Bladene af

G. procumbens

er blevet tjent som føde i årtier i Malaysia, hvor det generelt spises rå som salat. Desuden er planten almindeligt anvendt til behandling af inflammation, nyre ubehag, højt kolesterolindhold, diabetisk, kræft og forhøjet blodtryk [7], [8]. Faktisk

G. procumbens

bruges traditionelt i Sydøstasien for sin værdifulde lægemidler ejendom. De små molekylvægt udvundet fra

G. procumbens

er blevet rapporteret at vise anti-cancer [9], anti-oxidant [10], anti-inflammatorisk [11], anti-hyperglykæmiske og anti-hyperlipidæmiske [12] aktiviteter. Desuden har vi påvist tilstedeværelsen af ​​værdifulde planteforsvarsmekanismer proteiner, såsom peroxidase, thaumatin-lignende proteiner og miraculin fra blad af

G. procumbens

[13], [14]. Imidlertid er virkningerne af proteinekstrakt på cancere aldrig blevet bestemt. Derfor vi havde til formål at analysere den cytotoksiske aktivitet af proteinerne udvundet fra bladene af

G. procumbens

hjælp lactatdehydrogenase (LDH) cytotoksicitetsassay og derefter til at bestemme hvilken rute for cytotoksicitet mekanisme gennem ekspression af spredning og invasion markører i de behandlede MDA-MB-231 celler ved anvendelse af semikvantitativ polymerasekædereaktion (PCR). Endvidere blev aktive proteiner identificeret ved anvendelse massespektrometrisk analyse. Vi håber, at de opnåede data vil være nyttige for den fremtidige indsats af protein-baserede lægemidler til kræftbehandling.

Materialer og Metoder

Plant Materialer

Blade af

G. procumbens

blev indsamlet fra Penang, Malaysia. Ingen specifikke tilladelser var nødvendige til indsamling af bladene, og planten er ikke en beskyttet plantearter. Et gavekort antal prøven (11209) blev deponeret ved Herbarium i School of Biological Sciences, Universiti Sains Malaysia. Friske blade blev vasket to gange med ledningsvand og skylles med destilleret vand.

proteinekstrakt og oprensning

Protein blev ekstraheret ved metoden ifølge Kiba

et al.

(2003) [15] med mindre modifikation. Friske blade af

G

.

procumbens

(1 kg) blev formalet til et fint pulver i flydende nitrogen under anvendelse blender og blandet med 3 liter ekstraktionspuffer [10 mM NaH

2PO

4, 15 mM Na

2HPO

4, 100 mM kaliumchlorid, 2 mM ethylendiamintetraeddikesyre, 2 mM thiourinstof, 1 mM phenylmethanesulfonylfluoride og 1,5% (vægt /volumen) polyvinylpolypyrrolidon]. Blandingen blev homogeniseret hver 20 min i 2 timer og inkuberet ved 4 ° C natten over. Homogenatet blev centrifugeret ved 15 000 rpm, 4 ° C i 30 minutter. Det rå ekstrakt blev holdt ved -20 ° C. To trin i ammoniumsulfatudfældning blev anvendt, hvor fast ammoniumsulfat blev tilsat til det rå ekstrakt af

G. procumbens

ved 4 ° C, indtil 30% mætning blev opnået. Bundfaldet blev fjernet ved centrifugering i 30 minutter ved 13 000 rpm. Efterfølgende blev fast ammoniumsulfat igen tilsat til den resterende supernatant at opnå 70% mætning, og opløsningen blev centrifugeret i 30 minutter ved 13 000 rpm, og pelleten blev udvundet. Pelleten blev derefter resuspenderet i deioniseret vand, indtil fuldt opløst. Det rå ammoniumsulfat udfældede proteiner blev fyldt til en gelfiltreringssøjle, HiPrep ™ 16/60 Sephacryl ™ S-100 High Resolution (GE Healthcare) under anvendelse ÄKTAprime plus proteinoprensning system. Proteiner blev elueret med 50 mM natriumphosphat, pH 7,2 ved en strømningshastighed på 0,5 ml /min i et totalvolumen på 180 ml elueringsbuffer blev eluatet opsamles i fraktioner på hver 5 ml. Koncentrationen af ​​protein blev bestemt under anvendelse RC /DC ™ Protein Assay Kit (Bio-Rad Laboratories).

SDS-PAGE

Natriumdodecylsulfat polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) blev anvendt til adskille de indsamlede proteiner. Hver fraktion blev blandet med ikke-reducere prøvepuffer [0,5 M Tris-HCl (pH 6,8), 10% (v /v) glycerol, 0,02% (vægt /volumen) SDS og 0,1% (vægt /volumen) bromphenolblåt]. Elektroforese proces blev kørt ved en konstant spænding på 200V. Gelen blev farvet med Coomassie blå.

LDH cytotoksicitetsanalyse

MDA-MB-231 (HTB-26 ™) cellelinje var en slags gave fra John Hopkins Forskningscenter, der blev købt fra American Type Culture Collection (ATCC). Cellerne blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) (Gibco BRL) suppleret med 10% (vol /vol) føtalt bovint serum (FBS) (Gibco BRL), 100 enheder /ml penicillin og 100 mg /ml streptomycin (Gibco BRL ). Cellerne blev inkuberet ved 37 ° C i en fugtig atmosfære, der bestod af 5% (v /v) CO

2. Den cytotoksiske aktivitet blev udført ved anvendelse af lactat dehydrogenase (LDH) cytotoksicitet assaykit (BioVision, USA), LDH er et cytoplasmatisk enzym, der forefindes i alle celler, så det vil blive frigivet i dyrkningsmediet når skaden af ​​cellen plasmamembran finder sted. LDH aktivitet blev bestemt ved en koblet enzymatisk reaktion, hvor LDH oxideret lactat til pyruvat, det dannede derefter pyruvat omsættes med tetrazoliumsalt INT til dannelse farmazan. Stigningen i mængden af ​​formazan er direkte korreleret med stigningen i antallet af lyserede celler. Formazan farvestof intensitet blev målt ved en ELISA-læser. I alt 1,0 x 10

5 celler /ml MDA-MB-231-celler blev podet i 24-brønds kulturplade, som blev inkuberet ved 37 ° C i en fugtig atmosfære bestående af 5% (v /v) CO

2, indtil cellevækst opnået ca. 70% konfluens. Mediet fra hver brønd blev bortkastet, blev cellerne vaskes forsigtigt med PBS og 2% af vækstmedium (DMEM suppleret med 2% (vol /vol) FBS, 100 enheder /ml penicillin og 100 mg /ml streptomycin) blev tilsat. Cellerne blev behandlet med stigende koncentrationer af ekstraktet (tre kopier). Et hundrede pi dyrkningsmedium blev udtaget og LDH cytotoksicitet assay blev udført ifølge vejledningen tilvejebragt. Et hundrede pi dyrkningsmedium blev overført til en immuno plade og 100 pi reaktionsblanding (blanding af katalysator og farvestof opløsning) blev tilsat til hver brønd. Pladen blev inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur i mørke. Absorbansen af ​​alle prøverne blev målt ved 490 nm og reference bølgelængde var 680 nm. Procentdelen af ​​cytotoksicitet blev beregnet som [(test prøve – lav kontrol) /(høj styring – lav kontrol)] x100, hvor lav kontrol er absorbansen af ​​dyrkningsmediet uden tilsætning af nogen ekstrakt og høj kontrol er absorbansen af ​​dyrkningsmediet hvor cellerne blev behandlet med 1% (vol /vol) Triton X-100 for at frigive 100% LDH.

polymerasekædereaktion (PCR) Analyse

Totalt RNA blev ekstraheret fra celler under anvendelse af RNeasy Mini Kits (Qiagen, USA). Den totale RNA ekstraheret blev revers transkriberet til cDNA under anvendelse af RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific). De udtryk for to proliferative markører, Ki-67 og PCNA og to invasion markører, CCL2 og IL6, blev undersøgt i behandlede og un-behandlet MDA-MB-231 celler ved anvendelse af PCR og gel densitometri. Niveauerne af mRNA’er blev udtrykt som båndintensitet af markørerne af PCR-produkterne i forhold til kontrollen beta actin PCR-produkt. De anvendte primere til PCR-reaktionerne var som følger: antigen Ki-67, Forward: 5′-AACTATCCTCGTCTGTCCCAACAC-3 ‘, omvendt: 5′-CGGCCATTGGAAAGACAGAT-3′; prolifererende celler (PCNA), Fremad: 5’-AGAAGGTGTTGGAGGCACTCA-3 ‘, omvendt: 5′-GGTTTACACCGCTGGAGCTAA-3′; chemokin (c-c-motivet) ligand 2 (CCL2), Forward: 5’- GCTGTGATCTTCAAGACCATTGTG-3 ‘, omvendt: 5′-AGTGAGTGTTCAAGTCTTCGGAGTT-3′; interleukin 6 (IL6), Fremad: 5’-CCAGTACCCCCAGGAGAAGATT-3 ‘, omvendt: 5′-CCGTCGAGGATGTACCGAAT-3′; beta actin, Fremad: 5’-CATTGCCGACAGGATGCA-3 ‘, omvendt: 5′-CCGATCCACACGGAGTACTTG-3’. PCR-reaktionerne bestod af 5 pi cDNA (5 ng), 12,5 pi Master Mix, 1 pi hver 20 pmol forward og reverse primere og DNase /RNase-frit vand til et endeligt volumen på 25 pi. Reaktionerne blev sat i 30 cykler med følgende betingelser; præ-amplifikation: 94 ° C i 10 minutter, denaturering: 94 ° C i 20 s, annealing: 55 ° C i 20 s, ekstension: 72 ° C i 30 s, ophør: 72 ° C i 10 min. Hver PCR-reaktion blev udført i tre eksemplarer og PCR-produkterne blev underkastet elektroforese på 2% (w /v) agarosegel indeholdende 0,1 ug /ml EtBr. Bands of PCR-produkt på gelen blev fanget ved hjælp af Gene Genius Image Analyser og bandet intensitet blev analyseret ved hjælp Mængde One-software (Bio-Rad, USA).

I-gel Digestion

I -gel fordøjelse blev udført under anvendelse af metoden beskrevet af [16]. Proteinbånd blev udskåret fra SDS-PAGE. Gelstykkerne blev vasket med 100 mM ammoniumbicarbonat i 10 minutter og derefter med acetonitril (ACN) i 5 min. Dette trin blev gentaget to gange. Gelstykker blev derefter tørret i en speed-vakuum-centrifuge. Den tørrede gel stykker blev tilsat 10 mM DTT i 100 mM ammoniumbicarbonat og inkuberet i 1 time ved 56 ° C. Overdreven opløsning fjernedes. Gelstykkerne blev derefter inkuberet med 55 mM iodeddikesyre i 100 mM ammoniumbicarbonat i mørke i 45 minutter ved stuetemperatur. Gelstykkerne blev vasket med 100 mM ammoniumbicarbonat i 10 minutter og derefter med acetonitril (ACN) i 5 min to gange. Gelstykkerne blev behandlet med 15 ng /pl trypsin i digestionspuffer [50 mM ammoniumbicarbonat, 5 mM CaCI

2] og inkuberet ved 37 ° C natten over. Supernatanten fra tryptiske fordøjelsesprodukt blev opsamlet, og de resterende peptider blev ekstraheret 3 gange i 5% (v /v) myresyre i 30:70 af ddH2O: ACN. Supernatanter blev puljet og slag tørret anvendelse af nitrogengas.

Omvendt fase Kapillær Kromatografi og massespektrometri

Omvendt fase kapillar chromatografi (Waters Acquity Ultra Performance Liquid Chromatography [UPLC]) koblet med kvadrupol tids- of-flight tandem-massespektrometri (Waters, Milford, MA, USA) forbundet med en LockSpary Eksakt masse kalibrator. Ioniseringskilde anvendte ESI (elektrospray blød ionisering). Prøven blev sprøjtet ind i systemet gennem en autosampler. Prøverne blev injiceret i en Trizaic UPLC nanoTile (Waters, Milford, MA, USA) bestod af en fælde-søjle og en kapillarkolonne. Proteinet digest var pre-koncentreret og afsaltet på søjlen trapping patron pakket med 1,8 um High Strength Silica (HSS) partikel med en strømningshastighed på 8

μ

L /min på 99% A i 3 minutter. Peptiderne blev derpå elueret på en omvendt-fase-kapillarsøjle (1,8 um HSS partikel, 85 um x 100 mm) ved en gradient måde fra 3% B til 40% B i 30 minutter ved en strømningshastighed på 0,45 pl /min. Opløsningsmiddel A bestod af vand med 0,1% myresyre, og opløsningsmiddel B bestod af acetonitril med 0,1% (vol /vol) myresyre. Eluatet blev underkastet MS-systemet. Alle massespektre blev opnået under anvendelse af Q-TOF massespektrometer. De Q-TOF parametre indstilles som følger: positiv tilstand; kapillær, 3,2 kV; kegle prøveudtagning, 28,0; ekstraktion kegle, 2,0; kilde temperatur, 70 ° C; desolvation temperatur, 200 ° C; kegle gasstrøm, 40,0 l /time; desolvation gasstrøm, 600,0 l /t; scanningstid, 0,2 s. Spectra blev registreret fra

m /z

2 til 1200. Ekstern kalibrering blev anvendt på alle data ved hjælp af [Glu1] -Fibrinopeptide B standard (Waters). Undersøgelse scan overtagelse blev udført on-line med kapillar kromatografisk separation; en indledende TOF-MS-scanning blev erhvervet over massen intervallet 2-1200 m /z hvert sekund, med at skifte kriterier for MS til MS /MS, der omfattede ion intensitet (100 tællinger /s) og opladning tilstand (2). MS /MS af prækursor-ion valgt blev erhvervet over massen intervallet 50-1600 m /z. Kollisionen energi var 6 eV.

Protein Identification

Database søgning blev udført på MS /MS-data genereret ved hjælp af hele taksonomi orden

Viridiplantae

under SwissProt database. Peptid tolerance og fragment mass tolerance var sat til 0,1 BDA og 2 Da henholdsvis og kun én savnet spaltning er tilladt. Carbamidomethylated cystein blev sat som fast modifikation, mens oxideret methionin blev sat som variabel modifikation.

Statistisk analyse

Data præsenteres som gennemsnit ± standardafvigelse (SE) af tre indepent eksperimenter og statistisk analyse var gøres ved hjælp af Students t-test. En værdi på p 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Mild fosfatbuffer blev brugt til at udvinde proteiner fra blad af

G.. procumbens

for at forhindre denaturering af proteinerne.

In vitro

bioaktivitet undersøgelse viste, at den frysetørrede rå blad ekstrakt af

G. procumbens

besad anti-proliferation aktivitet mod brystkræft cellelinien MDA-MB-231. Derfor fraktionering af proteinet ekstrakt blev udført for at isolere protein (er) af interesse. Ammoniumsulfatpræcipitation blev anvendt som det første trin i oprensning af proteinerne, metoden er ikke-denaturerende til proteiner, er dette salt udfældning metode til formål at fjerne små molekylvægt fra ekstrakten [17]. Salt udfældede proteiner blev derefter underkastet gelfiltrering, hvor yderligere separation af proteiner efter størrelse blev udført. Eluatet af gelfiltreringskromatografi blev opsamlet i fraktioner på 5 ml volumen hver. Alle fraktioner blev testet for anti-proliferation aktivitet mod brystkræft cellelinien, MDA-MB-231

in vitro

. Stærk anti-spredning aktivitet blev påvist i fraktioner 11 og 12, hvor fraktion 11 blev bestod af de 51

st til 55

th ml eluat mens fraktion 12 blev indsamlet fra 56

th til 60

th ml eluat (figur 1) fra i alt 180 ml elueringspuffer anvendes. Figur 2 viser SDS-PAGE analyse for fraktionerne 9 til 14.

gelfiltrering separation blev udført under anvendelse HiPrep 16/60 Sephacryl S-100 HR-søjle. Protein- fraktioner blev elueret med 50 mM natriumphosphat, pH 7,2, og strømningshastigheden af ​​0,5 ml /minut. De aktive proteinfraktioner 11 og 12 blev elueret ud inden for 50 ml til 60 ml elueringspuffer.

Vores foreløbige analyse fandt, at fraktionerne 11 og 12 besad anti-proliferation aktivitet på MDA-MB-231. Både fraktionerne 11 og 12 viste identiske protein-profiler.

Brøker 11 og 12 blev samlet og betegnes SN-F11 /12. LDH cytotoksicitet assay blev udført på MDA-MB-231-cellelinje, hvor cellen blev behandlet med SN-F11 /12. Figur 3a viser procentdelen af ​​LDH frigivet i de dyrkningsmedier, der blev behandlet med forskellige koncentrationer (5-25 ug /ml) af SN-F11 /12, blev behandlingerne udføres i 24, 30, 36, 42 og 48 timer og efter hver behandlingsperiode LDH procentdel frigivet til medierne blev målt. Effektiv koncentration (

50 EF) værdi er defineret som den koncentration, udtrykt i ug /ml proteiner i ekstrakten, der inhiberede 50% af cellevækst. EF

50 værdier for forskellige behandlingsperioder blev bestemt og er vist i figur 3b, hvorfra den konstante EF

50 værdi for SN-F11 /12 fandtes at være på 3,8 ug /ml proteiner.

Hver kurve af% LDH-frigivelse blev plottet mod respektive behandling tidspunkt. B. EC50 værdi blev plottet mod respektive behandling tidspunkt til bestemmelse af konstant EC50 værdi. Den konstante EC50 værdi på SN-F11 /12 om MDA-MB-231 var 3,8 mg /ml.

Yderligere evaluering af anti-spredning mekanisme udstillet af SN-F11 /12 om MDA-MB -231 blev udført ved anvendelse af PCR-teknikken, hvor bestemt konstant EC50 værdi blev anvendt til at behandle MDA-MB-231-celler og efterfølgende ekspression af to proliferative markører, Ki67 og PCNA, blev undersøgt. Beta actin blev anvendt som indlæsning kontrol. Ekspressionen af ​​Ki-67 og PCNA blev fundet nedreguleret sammenlignet med celler dyrket uden behandling (figur 4a). Ki-67-ekspression blev reduceret betydeligt i MDA-MB-23 celle efter 36 og 48 timers behandling med SN-F11 /12 sammenlignet med det ikke-behandlede celler. Ekspressionen af ​​PCNA mellem behandlet og ubehandlet celle var ikke signifikant forskellig selvom SN-F11 /12 behandlede celler udtrykte lavere niveauer af PCNA (figur 4b).

Tallene viser normaliseret mRNA-ekspression af (A) Ki67 og (B) PCNA på de behandlede MDA-MB-231-celler. Målgenet mRNA-ekspression blev normaliseret til mRNA-ekspression af beta-actin. Hver data repræsenterer middel ± SE fra tre uafhængige forsøg. Statistisk analyse blev bestemt ved hjælp af Students

t

test med *

s

. 0,05 som statistisk signifikans sammenlignet med de ikke-behandlede celler på hvert tidspunkt

Ud over de proliferative markører, ekspressionen af ​​to invasion markører, CCL-2 og IL-6 blev også undersøgt under anvendelse af PCR-teknikken. Udtrykket af CCL2 i MDA-MB-231 celler blev nedreguleret efter SN-F11 /12 behandling i forhold til ubehandlet celle (figur 5a). Tværtimod ekspressionen af ​​IL-6, som normalt er involveret i at fremme celleinvasion, blev fundet opreguleret efter SN-F11 /12-behandling (figur 5b).

Tallene viser normaliseret mRNA ekspression af (A) CCL2 og (B) IL6 på de behandlede MDA-MB-231-celler. Målgenet mRNA-ekspression blev normaliseret til mRNA-ekspression af beta-actin. Hver data repræsenterer middel ± SE fra tre uafhængige forsøg. Statistisk analyse blev bestemt ved hjælp af Students

t

test med *

s

. 0,05 som statistisk signifikans sammenlignet med de ikke-behandlede celler på hvert tidspunkt

SDS-PAGE protein profilering på SN-F11 /12 viste tilstedeværelsen af ​​15 proteinbånd, blev hvert bånd udskåret i-gel fordøjelse og de tryptiske-fordøjede peptider blev analyseret ved LC /Q-TOF. Figur 6 viser SDS-PAGE profil for den aktive fraktion SN-F11 /12 og proteinet identificeret var opført i tabel 1, blev 13 proteinbånd vellykket identificeret, mens 2 proteinbånd viste ingen protein hits.

Den identificerede protein bands blev nummereret som vist til højre. Analysen identificerede 15 proteinbånd på gelen.

Diskussion

Tidligere små molekylvægt fra bladet ethanolekstrakt og blade vandigt ekstrakt af

G. procumbens

blev vist at inhibere væksten af ​​brystcancer-cellelinie T47D [9] og human mesangial celleproliferation [18], hhv. Til dato er der ingen oplysninger om bioaktivitet af protein ekstrakt fra blad af

G. procumbens

. Dette er den første rapport afslører den cytotoksiske egenskab af bladet proteiner af

G. procumbens

. I denne undersøgelse, at blad protein ekstrakter af

G. procumbens

blev udsat for et par rensning, inden olien anvendes til testning. Ekstrakterne første undergik salt udfældning at fjerne små molekylvægt mens proteinerne blev saltet ud som pellet. Pelleten blev vist at vise cytotoksisk aktivitet på MDA-MB-231-brystcancercellelinier observeret ved et omvendt mikroskop. Efterfølgende blev pelleten underkastet oprensning ved gelfiltreringskromatografi til fjernelse af salt og også for yderligere separation af proteiner efter størrelse [17]. Herefter blev aktive proteinfraktioner 11 og 12 vist at have identiske proteinprofiler og de blev samlet som SN-F11 /12-fraktionen. SN-F11 /12 viste sig at udvise potent cytotoksisk aktivitet på MDA-MB-23 brystcancer-cellelinie som vurderet ved LDH cytotoksicitet assay.

De indsamlede fra LDH cytotoksicitetsassayet data viste, at SN-F11 /12 viste kraftig inhiberende egenskab på væksten af ​​MDA-MB-231-celler med en konstant EC50 værdi på 3,8 ug /mL. Den anti-proliferative effekt af SN-F11 /12 blev afsløret ved undertrykkelse af mRNA’erne af to proliferationsmarkører, nemlig Ki67 og PCNA, som er essentielle for DNA-replikation [20]. Begge markører er cellecyklus beslægtede gener, der almindeligvis anvendes til evaluering af

in vitro

antiproliferativ af narkotika [19]. Ki67 er et nukleart antigen udtrykt i G1, G2 og M-faser [20], mens PCNA udtrykkes i G1, G2 og S faser [21] af cellecyklus. Vores resultater viste den differentielle ekspression af disse to markører i SN-F11 /12-behandlet og ubehandlet MDA-MB-231-celler, hvor ekspressionen af ​​Ki67-mRNA var signifikant (p 0,05) nedreguleret i sidstnævnte, mens reduktion af PCNA mRNA-ekspression ikke synes at afvige væsentligt. Ki67 og PCNA har forskellige karakteristika og halveringstiden [22]. Generelt er ekspression af Ki67 udelukkende angiver celleproliferation, hvorimod PCNA-ekspression, foruden celleproliferation, indikerer også DNA-reparation eller celledød. Observation af forskellige niveauer af Ki67 mRNA og PCNA mRNA kunne tilskrives halveringstiden af ​​PCNA, hvilket er 20 gange længere end for Ki67. Desuden er PCNA protein fundet efter cellecyklus og celledød. Påvisningen af ​​PCNA efter celledød kan være årsagen til ubetydelige differentiel PCNA-ekspression mellem SN-F11 /12-behandlede og ubehandlet MDA-MB-231-celler. Derfor er anti-proliferative effekt af SN-F11 /12 på MDA-MB-231-celler sandsynligvis korreleret med Ki67 og PCNA, de almindeligt anvendte proliferative indeks for

in vitro

undersøgelse.

CCL2 og IL6 er involveret i kræft celle invasion. I processen med udvikling af cancer, CCL2 sammen med makrofag-kolonistimulerende faktor (M-CSF) og vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) spiller en aktiv rolle for at rekruttere cirkulerende blodmonocytter til tumorstedet, hvor de rekrutterede monocytter vil blive differentieret ind tumorassocierede makrofager (TAM) og etablere et symbiotisk forhold til tumorcellerne. Efterfølgende vil TAM secernerer vækstfaktorer, såsom EGF, TGFp, FGF, VEGF, IL1, TNF og IL6, der fremmer tumorcelleproliferation, invasion og metastase [23]. MRNA-udtryk i de to invasion markører, CCL2 og IL6, var omvendt til hinanden. Den CCL2 mRNA-ekspression blev nedreguleret mens IL6 mRNA-ekspression var opreguleret i SN-F11 /12-behandlet MDA-MB-231-celler. CCL2 er en af ​​chemokiner væsentlige for brystkræft udvikling og progression [24]. Overekspression af CCL2 fremmer brystkræft metastase [25]. Tværtimod inhibering af CCL2 og dets receptor-signalvejen reducerer metastase

in vivo

og forlænger overlevelsen af ​​tumorbærende mus [26]. IL6 er et interleukin, der spiller en nøglerolle i patofysiologien af ​​adskillige cancerformer og forskellige inflammatoriske lidelser i immunsystemet [27]. IL6 over-ekspression er blevet impliceret i tumorigenese af myelomatose, ovarie-, nyre- celle, prostata, cervikale og brystcarcinomer [28], [29], [30], [31]. I en tidligere undersøgelse blev CCL2 rapporteret at bidrage til udviklingen af ​​lungefibrose ved at reducere IL6-niveauer [32]. I denne undersøgelse, behandling af MDA-MB-231 celler med SN-F11 /12 faldt ekspressionen af ​​CCL2 mRNA i cellerne. Tværtimod ekspressionen af ​​IL6-mRNA i SN-F11 /12-behandlede MDA-MB-231-celler var opreguleret i sammenligning med den ikke-behandlede celler. Som IL6 havde vist sig at være et pleiotropisk cytokin med både tumorfremmende og inhibitorisk aktivitet [33], opregulering af ekspressionen af ​​IL6-mRNA i SN-F11 /12-behandlede MDA-MB-231-celler kan forårsage en inhiberende virkning til væksten af ​​brystcancer cellelinje.

Som SN-F11 /12 har vist lovende resultater af anti-proliferation og anti-invasion på MDA-MB-231-celler, proteinfraktionen blev yderligere bedømt ved SDS-PAGE og massespektrometrianalyse. Ud af de tolv proteiner identificeret i SN-F11 /12, to proteiner, nemlig superoxiddismutase cooper zink (Cu, Zn-SOD) og Toll Interleukin 1 receptor-nukleotidbindingsstedet-Leu-Rich Repeat (TIR-NBS-LRR) klasse sygdomsresistens protein tilhørte kategorien plante forsvar proteiner. Disse anlæg forsvar proteiner er også blevet påvist i

Corydalis cava

knolde ekstrakt, hvor de blev fundet at hæmme væksten af ​​HeLa-cellelinje [34]. Superoxiddismutase (SOD) er en antioxidant, som katalyserer dismutation af superoxid anioniske grupper til hydrogenperoxid og oxygen [35]. Proteinet tilhører metalloenzym gruppe, hvor aktiviteten er afhængig af metalion i form af Cu, Zn-SOD, Mn-SOD og Fe-SOD [36]. Zhang

et al

. (2002) [37] rapporterede, at overekspression af Cu, Zn-SOD undertrykker væksten af ​​humane tumorceller. Imidlertid Cu, Zn-SOD ekstraheret fra hvidløg viste antagonistvirkning for doxorubicin, en af ​​de mest almindeligt anvendte anticancerlægemidler, lindrer anticancerlægemidlet cytotoksicitet på tumorcellelinjer [38], [39]. I vores nuværende undersøgelse, Cu, Zn-SOD blev påvist i fire forskellige proteinbånd af SN-F11 /12. Men om Cu, Zn-SOD er ​​det protein, der bidrager til den anti-cancer egenskab af den aktive proteinfraktion SN-F11 /12 kræver yderligere vurdering.

TIR-NBS-LRR klasse af sygdomsresistens ( R) proteiner er blevet rapporteret at spille en afgørende rolle i programmeret celledød som en del af anlægget immunsystem [40]. NBS domæner udviser ATPase-aktivitet, mens LRR domæne er kendt for at mediere protein-protein og protein-ligand-interaktioner. TIR-NBS-LRR klasse af sygdom resistens (R) proteiner er også involveret i det specifikke anerkendelse af patogen-afledt fremkaldende [41]. I planteriget, TIR domæne, der er til stede ved N-terminalen af ​​R-proteiner bærer NBS og LRR, og samtidig være nødvendige for celledød signalering [42].

ascorbatperoxidase (APX) er en plante forsvar protein, der også blev påvist i SN-F11 /12. APX sammen med glutathion peroxidase og katalase, udgør de antioxidant enzymer, der er involveret i afgiftning af hydrogenperoxid (H

2O

2). Efter dannelsen af ​​hydrogenperoxid ved enzymatisk reaktion af SOD, er afgiftning af hydrogenperoxid udføres med sådanne antioxidant enzymer, som katalyserer omdannelsen af ​​hydrogenperoxid til vand [43]. En balance forhold mellem SOD til de antioxidantenzymer er en nødvendig for korrekt funktion af cellen, hvor høje niveauer af SOD forhold til antioxidantenzymer vil føre til en ophobning af superoxidradikaler der er giftige for makromolekyler, mens lave niveauer af SOD forhold til de antioxidantenzymer vil resultere i en stigning i koncentrationen af ​​hydrogenperoxid, der efterfølgende omdannes til hydroxid radikal (-OH), en meget reaktive species, som er ansvarlig for den oxidative beskadigelse af cellen [37].

Malate dehydrogenase var den mest rigelige protein påvist i den aktive proteinfraktion af SN-F11 /12, idet det blev påvist i syv af de SDS-PAGE-proteinbånd. Malat dehydrogenase katalyserer en reversibel NAD

+ – afhængig dehydrogenase reaktion i TCA-cyklus [44]. Kim

et. al

(2008) [45] viste, at aktiviteten af ​​malat dehydrogenase antagoniseres af aktiviteten af ​​glucose-6-phosphat-dehydrogenase i dehydroepiandrosteron (DHEA) behandlet levercellecancer rotter.