PLoS ONE: Reducerede mitokondrie-DNA Indhold Associates med dårlig prognose for prostatakræft i African American Men

Abstrakt

Reduktion eller udtømning af mitokondrie-DNA (mtDNA) er blevet forbundet med kræft progression. Selvom skæv mtDNA indhold vides at forekomme i prostatakræft, forskelle i mtDNA indhold mellem African American (AA) og kaukasiske amerikanske (CA) mænd er ikke defineret. Vi leverer den første bevis på, at tumorer i AA mænd har reduceret niveau af mtDNA i forhold til CA mænd. Den mediane tumor mtDNA indhold blev reduceret i AA mænd. mtDNA indhold blev også reduceret i normale prostata væv af AA mænd sammenlignet med CA mænd, hvilket tyder på en mulig disposition til kræft i AA mænd. mtDNA indhold blev også reduceret i godartet prostatahyperplasi (BPH) væv fra AA mænd. Tumor og BPH væv fra patienter ≥ 60 år har reduceret mtDNA indhold sammenlignet med patienter 60 år. Desuden mtDNA indhold var højere i normale væv fra patienter med malignt T3 stadium sygdom sammenlignet med patienter med T2 stadium sygdom. mtDNA niveauer i matchede normale prostata væv blev næsten fordoblet i Gleason kvalitet af 7 i forhold til ≤7, hvorimod reduceret mtDNA indhold blev observeret i tumorer i Gleason kvalitet 7 i forhold til ≤7. Sammen vores data tyder på, at AA mænd besidder lavere mtDNA niveauer i normal og tumorvæv i forhold til CA mænd, der kunne bidrage til højere risiko og mere aggressiv prostatakræft i AA mænd

Henvisning:. Koochekpour S, Marlowe T Singh KK, Attwood K, Chandra D (2013) Reduceret mitokondrie-DNA Indhold Associates med dårlig prognose for prostatakræft i African American mænd. PLoS ONE 8 (9): e74688. doi: 10,1371 /journal.pone.0074688

Redaktør: Madhuri Kango-Singh, University of Dayton, USA

Modtaget: April 5, 2013; Accepteret: August 8, 2013; Udgivet: 23 september, 2013 |

Copyright: © 2013 Koochekpour et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse modtaget økonomisk støtte fra National Cancer Institute of National Institutes of Health under Award nummer R01CA160685 og K01CA123142, og den amerikanske Cancer Society Research Scholar Grant RSG-12-214-01 – CCG til DC og National Cancer Institute center Support Grant P30 CA016056 til Roswell Park Cancer Institute. Yderligere støtte blev leveret af R01MD005824, R21CA149137, og R21CA143589 til SK og R01 CA121904 og R21 CA153097 til KKS. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

med hensyn til diagnose og dødelighed, prostatakræft er en af ​​de førende kræftformer blandt amerikanske mænd. Øget prostatakræft-relaterede diagnoser og dødelighed er ofte forbundet med African American (AA) mænd i forhold til kaukasisk amerikansk (CA) mænd [1] – [3]. Selvom kost og familiens historie sandsynligvis spiller en vigtig rolle i denne forskel, kan genetiske faktorer også være vigtige faktorer, der påvirker prostata tumorigenese. Mutation eller sletning af mitokondrie-DNA (mtDNA) er blevet forbundet med flere kræftformer, herunder prostatakræft [4] – [6].

In vitro

in vivo

analyser viser, at reduktionen af ​​mtDNA indhold er forbundet med erhvervelse af en androgen-uafhængig fænotype og fører til prostatakræft progression [6] – [8]. Reduceret niveau af mtDNA og mutationer i mtDNA er blevet rapporteret i flere forskellige typer cancer, såsom prostata [9], [10] bryst [11], renal [12], og lever [13]. I modsætning hertil har øget indhold mtDNA også rapporteret i andre typer af kræft, herunder prostatakræft [14] – [16]. Nedbrydning eller reduktion af mtDNA hæmmer apoptose og dermed bidrage til kræft progression [17] – [19]. Desuden, udtømning af mtDNA fører til udvikling af resistens over for anticancermidler, herunder cisplatin og adriamycin [20]. Dog er øget mtDNA niveauer også forbundet med erhvervet resistens over for docetaxel i hoved og hals kræft celler [21]. Derfor opretholde en steady-state niveau af mtDNA i cancerceller er afgørende for et positivt resultat under kræftbehandling.

Hvordan mtDNA regulerer tumorigenese proces er ikke klart defineret, men aktuelle tyder på, at mutation, reduktion, eller deletion af mtDNA medføre defekter oxidativ phosphorylering (OXPHOS), øget reaktive oxygenarter (ROS) produktion, induktion i den glycolytiske vej, forøget ekspression af prosurvival proteiner, hvilket i sidste ende resulterer i cancer proliferation og tumorigenese [19], [22] – [ ,,,0],24]. Derfor modulering af mtDNA indhold i cancer, herunder prostatacancer, er væsentlige for forståelsen af ​​sygdomsprocessen. Selvom ubalancerede niveauer af mtDNA er blevet rapporteret i prostatacancer [7], [16], [24] – [26], er endnu ikke blevet rapporteret differentielle niveauer af mtDNA i AA og CA prostatacancerpatienter. Her giver vi den første bevis på, at reducerede mtDNA indhold kan bidrage til højere forekomst samt aggressiv prostatakræft fænotype i AA mænd i forhold til CA mænd.

Resultater

BPH og Prostata tumorvæv har reducerede niveauer af mtDNA

OXPHOS defekter er et af kendetegnene på flere typer af kræft. Det OXPHOS Systemet består af fem multisubunit komplekser, og mtDNA koder 7 underenheder af kompleks I, 1-underenheden af ​​kompleks III, 3 underenheder af kompleks IV, og 2 underenheder af kompleks V [16], [27]. Derfor, for at forstå betydningen af ​​mtDNA i prostatakræft progression, vi bestemt mtDNA indhold i normale prostata vævsprøver, benign prostatahyperplasi (BPH) væv, prostata tumorer, og hvide blodlegemer (WBCs). Vi observerede, at den mediane mtDNA-indholdet blev reduceret til ~72% i BPH sammenlignet med normale prostata epitelvæv i prostatacancerpatienter (tabel 1). Desuden blev mtDNA indhold også reduceret til ~77% i primære prostatatumorer sammenlignet med normale prostata epitelvæv. Interessant nok blev mtDNA-indhold signifikant reduceret i WBCs sammenlignet med normale prostata epitelvæv eller tumorer (se tabel 1-7 og figur 1 og 2). Den resterende patient demografiske oplysninger, herunder alder, race, iscenesættelse, Gleason sortering, prostata-specifikt antigen (PSA) status, og antallet af patienter, der deltager er nævnt i tabel 1.

A, mtDNA-indhold blev sammenlignet efter alder anvendelse af Wilcoxon rank-sum test. B, Median mtDNA indhold i normal, BPH, og tumorer fra patienter 60 og ≥ 60 år er plottet til sammenligning. C, mtDNA-indholdet blev sammenlignet ved løb under anvendelse af Wilcoxon rank-sum test. D, Median mtDNA indhold i normal, BPH, og tumorer fra AA og CA patienter er plottet til sammenligning. Vejviser Vejviser

prostatakræft patienter over 60 år Harbor Reduceret mtDNA indhold i tumorer men Øget mtDNA indhold i normal prostata væv

Age sammenligning af mtDNA indhold i prostata cancer patienter viste, at i normale prostata epitel væv, median mtDNA indhold steg ~229% hos patienter ≥60 år sammenlignet med patienter 60 år. Ligeledes blev middelværdier også øget hos patienter ≥60 år (figur 1A og B). I modsætning til normale prostata epitelvæv blev mtDNA indhold reduceret i både BPH og tumorvæv fra patienter ≥ 60 år sammenlignet med patienter i alderen 60 år. Selv om den gennemsnitlige mtDNA indholdet i tumorer blev -7 gange lavere hos patienter i alderen ≥60 versus 60 år, de medianværdier viste kun ~16% reduktion i ældre patienter med prostatacancer (figur 1A og B). Det er interessant at bemærke, at mtDNA indhold i tumor prøver viste høj variabilitet, hvilket er i overensstemmelse med tidligere fund, at tumorceller viser høje niveauer af mtDNA variabilitet [16]. Niveauerne af mtDNA i WBCs blev også reduceret hos patienter ≥ 60 år (figur 1A).

Primære Prostata tumorer og Normal prostata væv fra AA Mænd har reduceret mtDNA Indhold I forhold til CA Mænd

Prostatakræft er meget aggressive i AA mænd sammenlignet med CA mænd; imidlertid er de underliggende mekanismer endnu ikke defineret. Nedsat mtDNA indhold er en af ​​de vigtigste faktorer i kræft progression, herunder prostatakræft [7], [25], [26]. Imidlertid har komparative analyser af mtDNA mellem AA og CA patienter ikke er blevet forsøgt. For at forstå, hvorfor AA mænd viser højere forekomst og aggressivitet prostatakræft i forhold til CA mænd, vi analyserede mtDNA indhold i disse to grupper af patienter med prostatacancer. Vi observerede, at i normale prostata epithelvæv, niveauerne af mtDNA i AA mænd var signifikant lavere (54%) sammenlignet med CA mænd (p = 0,047). Selv om den gennemsnitlige mtDNA indholdet i prostata tumorvæv fra AA mænd var 6 gange lavere end CA mænd, viste medianen mtDNA indhold kun ~16% reduktion. Tilsvarende blev mtDNA indhold også reduceret til ~73% i BPH fra AA sammenlignet med CA patienter (figur 1C og D). WBCs fra disse to grupper af patienter viste ingen væsentlige ændringer i mtDNA indhold (figur 1C).

Højere mtDNA Niveauer i normalt væv Svarer til Højere Iscenesættelse i prostatakræft

For yderligere at etablere og vurdere betydningen af ​​mtDNA i kræft progression, vi sammenlignet forskellige prostatakræft stadier i begge grupper af samlede befolkning. Overraskende, vi observerede højere mtDNA indhold i matchede normale væv ved T3 fase (dvs. tumor spredes via prostatakapslen) sammenlignet med T2 fase (dvs. godartet stadium). Fordi T3 fase tumorer har dårligere prognoser sammenlignet med T2 scenen, mtDNA i normale væv fra T3 tumorer behov for yderligere undersøgelse. Selvom årsagen til forøget mtDNA i normale væv fra tumorer af højere kvalitet og fase ikke er kendt, kunne man plausibel forklaring skyldes ophobning af et forøget antal af ændrede eller defekte mitokondrier i normale celler, som ikke blev transformeret, således forårsager øget mængde af mtDNA i normale væv ved højere lønklasse og scene. Interessant nok blev mtDNA indhold ikke påvirket i tumorvæv eller BPH prøver. Vigtigere, forøgede mtDNA niveauer i WBCs på T3 fase tyder på, at mtDNA indhold også kan være en mulig markør for mellemstationer og forudsigelse aggressivitet prostatacancer (tabel 2).

Analyser af PSA niveauer og mtDNA indhold viste, at median mtDNA indhold var positivt associeret med PSA-niveauer i normale væv, mens det faldt i tumorer fra patienter med PSA-niveauer 10. blev ikke observeret nogen specifik tendens i BPH prøver (tabel 3).

mtDNA Indhold Omvendt Relaterer med Gleason Grade i prostatacancerpatienter

Med hensyn til Gleason kvalitet, mtDNA indhold i normal prostata epitelvæv var næsten fordoblet i Gleason kvalitet af 7 sammenlignet med Gleason klasse ≤7. I modsætning hertil viste prostata tumorer reducerede medianværdier af mtDNA i prøver med Gleason klasse ≥7; blev dog ingen forskel i mtDNA indhold mellem forskellige Gleason kvaliteter observeret i BPH prøver (tabel 4).

Når vi sammenlignet medianværdier af mtDNA indhold i tumorer mellem Gleason klasse ≤3 og ≥4, vi observerede -30 % reduktion i mtDNA i Gleason mindre klasse ≥4 forhold til lønklasse ≤3, mens der blev observeret nogen ændring i median mtDNA indhold i tumorer i Gleason store. Øget mtDNA niveauer blev observeret i Gleason klasse ≥4 i matchede normale prostata epitelvæv af Gleason større; dog blev de median mtDNA niveauer faldt i matchede normale væv af ≥4 i Gleason minor (tabel 5 og 6).

Differential Trends af mtDNA Indhold i Prostata tumorer og normale Prostata væv mellem AA og CA Mænd

for at fastslå betydningen af ​​mtDNA i dissekere prostatakræft sundhedsmæssige uligheder, er det vigtigt at måle indholdet af mtDNA i normale noncancerous prostata epitelvæv samt tumorvæv opnået fra AA og CA prostatacancerpatienter. Vi observerede, mtDNA-indholdet blev reduceret i tumorvæv sammenlignet med matchede normale prostatavæv i kombinerede data fra både AA og CA-patienter (p = 0,053). I CA prostatacancerpatienter, mtDNA indholdet var 42% lavere i tumorvæv sammenlignet med matchede normale prostata epitelvæv (p = 0,068). I AA prostata kræftpatienter, de mtDNA niveauer i tumorer viste begrænsede ændringer i forhold til matchede normale væv, når vi sammenlignede medianværdier. Imidlertid var den gennemsnitlige mtDNA indholdet reduceres i tumorvæv sammenlignet med matchede normale prostatavæv. Alligevel mtDNA indhold i tumorer fra AA mænd var lavere end dem fra CA mænd (figur 2).

A, Grundet parret beskaffenhed af data, median mtDNA værdier blev sammenlignet mellem tumor og normale prøver under anvendelse af Wilcoxon signed- rang test (øverste panel af tabellen). Normale, BPH, og WBC’er blev sammenlignet under anvendelse af Kruskal-Wallis test (midterste panel). Tumor, BPH, og WBCs blev sammenlignet med hinanden ved anvendelse af Kruskal-Wallis test (nederste panel). B, er Median mtDNA værdier fra øverste tabel af panel A plottet til sammenligning.

BPH og WBCs Vis Reduceret mtDNA sammenlignet med den normale prostata og tumorvæv

Analyser af mtDNA-indhold i kombinerede populationer af prostatacancerpatienter udviste signifikant lavere niveauer af mtDNA i BPH og WBCs sammenlignet med normale prostatavæv (p = 0,001). Tilsvarende blev mtDNA indhold reduceret i BPH prøver og WBCs i sammenligning med normale væv i AA og CA patienter individuelt (figur 2). Sammenligning af median mtDNA indhold mellem BPH /tumorer og WBCs viste signifikante forskelle i mtDNA niveauer. Tilsvarende, Californien og AA patienter viste også signifikante ændringer i mtDNA niveauer i tumor /BPH og WBC-prøver. mtDNA niveauer var ens i WBCs mellem AA og CA patienter (figur 2).

AA Mænd har reduceret mtDNA Indhold Både i Normal og Prostata tumorvæv Sammenlignet med CA Mænd efter justering for alder, Gleason Grade, og PSA

Når vi sammenlignet mtDNA indhold i tumorer opnået fra AA og CA patienter efter justering for alder eller Gleason klasse, eller PSA, men ikke statistisk signifikant, vi observerede en ~7-8, -5, eller 4-5 gange falde i mtDNA i henholdsvis AA patienter. Age, Gleason kvalitet, og PSA justering af BPH viste ingen ændringer i mtDNA niveauer i BPH fra AA patienter sammenlignet med CA patienter (Tabel 7). Ligeledes blev der ikke tendenser observeret i WBC prøver mellem AA og CA mænd. Alder, Gleason, og PSA justering af normale matchede prostatavæv viste også ~34%, 32% og 46% fald i henholdsvis mtDNA-niveauer i normale prostatavæv fra AA patienter sammenlignet med CA patienter (tabel 7). Disse data antyder, at AA patienter besidder lavere niveauer af mtDNA i normale prostatavæv samt i tumorvæv, som kunne være en medvirkende faktor for højere forekomst og /eller aggressivitet af prostatacancer i AA mænd. De signifikansniveauer af parvise sammenligninger mellem normale prostata væv, er BPH, WBCs, og tumorer også vist i tabel 8.

Diskussion

Vores undersøgelse giver det første bevis på, at prostata tumorvæv fra AA mænd harbour reduceret mtDNA niveauer i forhold til CA mænd. Normale prostata epitelvæv fra AA mænd også show faldt mtDNA indhold i forhold til CA mænd. Selv om den nøjagtige betydning af disse resultater kræver yderligere undersøgelser, vore data antyder, at reducerede mtDNA niveauer i AA mænd kan være forbundet med den højere forekomst og aggressive natur af prostatacancer i AA mænd. Fremtidige studier med øget antallet af DNA-prøver fra AA og CA patienter kan give større forståelse med hensyn til virkningen af ​​reduceret indhold mtDNA på prostatakræft sundhedsmæssige uligheder. Det er uvist, hvor mtDNA indhold fald i prostatatumorer fra AA mænd sammenlignet med CA mænd, men det er muligt at mtDNA polymerase γ (pol y), den eneste DNA-polymerase i mitokondrier, der spiller en væsentlig rolle i mtDNA replikation og reparation [28] kan ikke være fuldt funktionsdygtig i normale prostata epitelial og kræftceller fra AA mænd. Det er også kendt, at p53 regulerer integritet mtDNA [29] gennem dets interaktion med pol γ [30]. Selvom p53-mutationer er sjældne i primær prostatacancer, højere tumor fase og grad, androgen-uafhængig, og metastatisk prostatacancer er forbundet med højt niveau af p53-mutationer [31] – [33]. Mitokondriel dysfunktion er forbundet med undertrykkelse af p53-aktivitet [34] og p53 regulerer mitokondriel respiration [35], [36]. Disse resultater tyder på, at reducerede mtDNA niveauer i normale prostata epitelial og kræftceller fra AA mænd kan være forbundet med defekter i pol γ og p53 funktioner.

Da forekomsten af ​​prostatakræft i AA mænd er højere end i CA mænd samt prostatakræft er mere aggressive i AA mænd [1] – [3], reducerede indhold mtDNA i normale prostata epitelceller og tumorceller fra AA mænd tyder på, at nedsat mtDNA indhold kunne være en af ​​de medvirkende faktorer for prostatakræft forskelle i amerikanske mænd. Humant mtDNA koder 13 proteinunderenheder af mitokondrie respiratoriske kæde, 22 transfer RNA’er, og 2 ribosomale RNA’er [27]. Således kan det reducerede indhold mtDNA forårsage inhibering af mitokondrielle respiration på grund af mangel af funktionelle OXPHOS [27], [37]. Mangel på respiration resulterer i reduceret oxygenforbrug fører til nedbrydning af 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA-reduktase (HMGR), som i sidste ende kan bidrage til modning af Ras onkogenet [38]. Aktivering af Ras resulterer i konstitutiv aktivering af multiple overlevelse signalveje såsom ERK, AKT, og NF-

k

B. Derfor reduceres mtDNA i normale celler fra AA mænd tyder på, at AA befolkning er modtagelig for en højere forekomst af prostatacancer. Faktisk er forekomsten af ​​prostatacancer hos AA mænd er ~1.6 gange større end CA population [1], [2]. Nedsat mtDNA indhold i prostata epitelceller fra AA mænd vil resultere i nedsat OXPHOS kapacitet transformerede prostata epitelceller, som begunstiger hurtigere vækst og invasivitet [39]. Nylige fund ved hjælp af dyremodeller yderligere at støtte vores konklusion, at mtDNA mutationer og reducerede mtDNA indhold resultater i tumor udvikling og forkorter levetiden af ​​dyr [40].

Reduktion eller udtømning af mtDNA og ophævelsen af ​​mitokondrie respiration hæmmer apoptose induceret af flere anticancermidler [18], [41] – [44]. Vi observerede en reduktion i mtDNA niveauer i tumorer sammenlignet med normale prostata epitelvæv, hvilket antyder, at prostatakræft i AA mænd er refraktære over for de anticancermidler. Den relativt højere indhold mtDNA i Californien prostatacancerceller er mere tilbøjelige til at reagere på behandling sammenlignet med AA prostatacancerceller. Øget indhold mtDNA er også kendt at tilvejebringe resistens over for anticancermidler såsom docetaxel [21], som kan være forbundet med lav ROS grund af øget aktivitet af F

0F

1-ATP syntase. Disse virkninger kan også skyldes forskelle i cancer celletyper. Den relativt højere indhold mtDNA i CA patienter kan føre til forbedret mitokondriefunktionen og respiration, hvilket forårsager forøget apoptotisk celledød i CA patienter sammenlignet med AA-patienter. I modsætning hertil kan højere indhold mtDNA i tumorer fra CA prostatacancerpatienter føre til spredning af mitokondrier grund af induktion af gener involveret i mitokondriel biogenese. Dette antyder, at relativt højere indhold mtDNA i Californien prostatacancerpatienter kan forårsage akkumulering af rigelige men morfologisk ændrede mitokondrier, som kan inducere apoptose eller alternative former af programmeret celledød i prostatatumorer. Disse resultater er i overensstemmelse med tidligere rapporter, at øget mtDNA mutationer i skjoldbruskkirtlen tumorer fremkalde ophobning af defekte og ændrede mitokondrier [45], [46]. Den nøjagtige mekanisme for nedsat mtDNA indhold i tumorer fra AA mænd såvel som det relativt højere indhold mtDNA i CA mænd er ukendt, men fordi kræft udvikling er påvirket af eksterne og miljømæssige faktorer ud over genetiske faktorer, kan begge faktorer spiller en rolle i den differentielle ekspression af mtDNA i normale prostata epitelvæv og tumorer fra disse to populationer.

Hvordan reduktionen i mtDNA forbundet med aggressive karakter af prostatakræft i AA mænd? Udtømning af mtDNA inducerer prostatakræft progression [7], [24], [25]. Udtømning af mtDNA forhindrer apoptose og fremmer cellemotilitet gennem opregulering af phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) /Akt2 signalering [26]. Derfor udtømning af mtDNA sandsynlige blokke apoptose, og fremmer overlevelse og motilitet af kræftceller via Akt2 aktivering. Vore data viser, at Gleason kvalitet og PSA justeret AA prostatacancerpatienter er forbundet med nedbrydning af mtDNA sammenlignet med CA patienter, hvilket understøtter vores konklusion, at mtDNA reduktion er associeret med inhibering af apoptose og invasivitet af prostatacancer i AA mænd. Udtømning af mtDNA inducerer epitel-mesenkymale overgang (EMT) [8], som er en indikator for cancer progression. mtDNA depletion reducerer også PARP-1-niveauer [25], som fremmer progression af den neoplastiske fænotype i prostatacancer. Disse resultater støtter vores konklusion, at reducerede mtDNA indhold i AA mænd kan være forbundet med en mere aggressiv prostatakræft.

Sammen vore resultater giver det første bevis på, at mtDNA indhold er nedsat hos normale prostata epitel- og cancervæv fra AA mænd sammenlignet med CA mænd. Disse fund kan have betydning at forudsige den differentierede resultater af prostatakræft progression og behandling i amerikanske mænd. Fordi både normale prostata væv og tumorvæv af CA mænd havnen højere mtDNA niveauer i forhold til AA mænd, forventer vi, at CA mænd vil være mere tilbøjelige til at reagere på anticancer terapi og være mere modtagelige for den cytotoksiske effekt af midler mod cancer sammenlignet med AA mænd. Derfor kan en klar forståelse af mekanismerne i mtDNA ubalance i amerikanske mænd give nye og effektive metoder til prostata forebyggelse og terapi kræft.

Materialer og metoder

Kilde til vævsprøver, etiske overvejelser, og Genomisk DNA Extraction

prøvetagning blev udført efter at have indhentet skriftligt informeret samtykke fra patienterne for brugen af ​​deres prøver til diagnostiske og videnskabelige formål. Alle kliniske prøver blev leveret baseret på en unik og tilfældig alfanumerisk kodet system, uden at henvise til patienterne ved navn eller ved hjælp af andre personlige id sigt. Under databehandling og analyser blev prøver tildelt et andet tilfældigt tal. Etisk godkendelse er indhentet fra Institutional Review Boards (interne metoder) på Louisiana State University Health Sciences Center (LSUHSC), School of Medicine, New Orleans, LA, og Roswell Park Cancer Institute, Buffalo, NY. Undersøgelsen var i overensstemmelse med principperne i Helsinki-erklæringen. Alle væv biospecimens blev indhentet fra de biospecimen core faciliteter på Louisiana Cancer Research Consortium (LCRC) tilknyttet Tulane Medical School og School of Medicine, New Orleans og LSUHSC, New Orleans (https://www.louisianacancercenter.org/collaborative-initiatives/shared-resources/biospecimen-core).

Normal forsøgspersoner (kilden til BPH prøver) i denne undersøgelse defineres som mænd uden tegn på prostatacancer. Hvide blodlegemer (WBCs) blev opnået fra patienter diagnosticeret med primær prostatacancer. Friske frosne matchede normale og maligne prostata væv blev opnået fra African American og kaukasiske amerikanske patienter diagnosticeret med primære tumorer. I denne undersøgelse er normalt prostata væv betragtes som matchede normale prostata prøver taget fra patienter med primær prostatacancer. Kun ondartede væv med 70% eller højere indhold tumor blev betragtet i undersøgelsen. Genomiske DNA’er blev ekstraheret under anvendelse af QIAGEN DNeasy Blood Tissue Kit, som anbefalet af producenten. Genomisk DNA-prøver blev kvantificeret ved anvendelse af en NanoDrop 8000 spektrofotometer (Thermo Scientific).

Analyser af mtDNA indhold ved hjælp af Real-time PCR

mtDNA indhold blev bestemt som tidligere [47] beskrevet. Kort fortalt blev totalt genomisk DNA (indeholdende både mtDNA og nuklear DNA) isoleret fra matchede normale og prostata tumorvæv, BPH, og WBCs fra AA og CA prostatacancerpatienter som beskrevet ovenfor. Efter kvantificering af DNA-prøver, som NanoDrop 8000 Spectrophotometer blev mtDNA indhold bestemt ved anvendelse af Applied Biosystems 7300 real-time PCR-system.

β-actin

cytochrom c oxidase subunit II (COX II)

blev anvendt til forstærkning af nukleare og mtdna hhv. Primere til

β-actin

COX II

blev anvendt som beskrevet tidligere [47], [48], og sekvenserne er som følger:

β-actin

(frem ): 5′-TCAC CCACACTGTGCCCATCTACGA-3 ‘,

β-actin

(revers): 5′-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3′.

COX II Hotel (frem): 5′-CCCCACATTAGGCTTAAAAACAGAT-3 ‘,

COX II Hotel (omvendt): 5′ TATACCCCCGGTCGTGTAGCG GT-3 ‘. Real-time PCR-reaktioner blev udført i et totalt reaktionsvolumen på 10 pi indeholdende 5 pi 2X iTaq SYBR Green Supermix med ROX (Bio-Rad, Cat # 172-5850), 10 ng template-DNA, 500 nM af hver af forward og revers primere og nuklease-frit vand. Smeltekurve analyser blev udført i slutningen af ​​amplificeringen at verificere fravær af ikke-specifik amplifikation eller primer dimer formation. Tærsklen cyklusnummer (Ct) værdier for hver reaktion blev beregnet under anvendelse af 7300-systemet SDS software. Standardkurver blev dannet under anvendelse af 10 ng til 10 pg af DNA fremstillet fra ubehandlede LNCaP-celler og billede PCR effektivitet baseret på ligningen E = 10

∧ (-1 /hældning) -1 [49]. Gennemsnitlige Ct-værdier blev opnået ved forstærkning af

COX II Hotel (mtDNA-specifik) og

β-actin (

nDNA-specifik). mtDNA indhold blev bestemt som 2

∧ΔCt, eller fold forskel på mtDNA fra nDNA [29], [47], [50].

Statistiske Analyser

mtDNA indhold blev rapporteret ved brug de midler, medianer og standardafvigelser. Andre kliniske og demografiske karakteristika blev rapporteret ved brug frekvenser og relative frekvenser. Grafiske analyser (QQ plots) fandt mtDNA indhold at være ikke-normalfordelte og blev derfor ikke-parametriske metoder anses for analyser af denne variabel. For hver gruppe (normal, tumor, BPH, og WBCs) blev mtDNA indhold sammenlignet mellem alder, race, tumor stadium, prostataspecifikt antigen (PSA), Gleason sum, Gleason mol og Gleason større anvendelse af Wilcoxon rank-sum eller Kruskal- Wallis eksakte test, som er relevant. Yderligere analyser inden for hver gruppe omfattede sammenligninger af mtDNA indhold mellem racemæssige grupper, mens justering for alder, Gleason sum og PSA ved hjælp af to-vejs variansanalyse (ANOVA). Fordi mtDNA indhold er ikke-normalfordelt, blev passende p-værdier opnået ved anvendelse af standard bootstrap metoder. mtDNA indhold blev sammenlignet i en parvis måde mellem grupperne i den samlede prøve, og inden hvert løb ved hjælp af Wilcoxon signed-rank (sunde vs. tumor) eller Wilcoxon rank-sum (alle andre sammenligninger) eksakte test. Alle data analyser blev udført i SAS v9.3 (Cary, NC) på et signifikansniveau på 0,05.

Tak

Vi takker Dr. Neelu Yadav og medlemmer af Chandra laboratorium for kritisk læsning af manuskriptet. Vi undskylder til de kolleger, hvis publikationer uforvarende kunne ikke blive nævnt.