PLoS ONE: MIR-20a Fremmer Livmoderhalskræft spredning og Metastase In vitro og in vivo

Abstrakt

MikroRNA’er (miRNA) er små, ikke-kodende RNA, der er kritiske regulatorer af forskellige sygdomme. MicroRNA-20a (MIR-20a) har tidligere ændret signifikant i en række cancere. I denne undersøgelse har vi påvist sammenhængen mellem MIR-20a og udvikling af livmoderhalskræft ved QRT-PCR, fandt vi, at ekspressionsniveauet af MIR-20a var signifikant højere i cervikale cancerpatienter end i normale kontroller, den afvigende ekspression af miR -20a blev korreleret med lymfeknudemetastaser, histologisk bedømmelse og tumor diameter. Så vi succes etableret de stabile anti-miR-20a livmoderhalskræft cellelinier ved lentivirus. Hæmmet MIR-20a forhindret tumorprogression ved at modulere cellecyklus, apoptose, og metastase in vitro og in vivo. TIMP2 og ATG7 blev vist sig at være direkte mål for miR-20a, hjælp luciferaseanalyse og western blot. Disse resultater indikerer, at MIR-20a undertrykker proliferation, migration og invasion af livmoderhalskræft celle ved at målrette ATG7 og TIMP2. Vores resultater støtter inddragelsen af ​​miR-20a i cervikal tumorigenese, især lymfeknude metastaser. Vi foreslår, at miRNA kan anvendes som terapeutisk middel til livmoderhalskræft

Henvisning:. Zhao S, Yao D, Chen J, Ding N, Ren F (2015) MIR-20a Fremmer Livmoderhalskræft spredning og Metastase In Vitro og in vivo. PLoS ONE 10 (3): e0120905. doi: 10,1371 /journal.pone.0120905

Academic Redaktør: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, KINA

Modtaget: September 25, 2014 Accepteret: 27 Januar 2015; Udgivet: 24 marts 2015

Copyright: © 2015 Zhao et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data ligger inden for de supplerende oplysninger filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Guangxi Natural Science Foundation (No.2011GXNSFA018184 og 2013GXNSFBA019132), National Natural Science Foundation of China (No.81460398), og støttet af Guangxi Health Department (No.Z2013018). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Cervical cancer er den næstmest almindelige form for cancer hos kvinder over hele verden, som er en førende årsag til kræft dødsfald, hvilket resulterer i omkring 300.000 dødsfald hvert år [1]. De fleste livmoderhalskræft patienter får standard strålebehandling og kemoterapi. Men kliniske resultater varierer betydeligt. Ifølge verden, var der omkring 500.000 nye tilfælde hvert år, 85% af de patologiske typer var pladecellekræft. Selvom den cervikale cytologi screening kommer en masse i tidlig påvisning og behandling i de seneste årtier, livmoderhalskræft sygelighed fortsat høje, og der var flere og flere unge sager for nylig. Så mange forskere hellige sig at finde patogenese og mere effektiv tumor terapi. microRNA (miRNA) er små ikke-kodende RNA på ca. 21-25 nukleotider (nt) og fungerer som post-transkriptionelle regulatorer af genekspression [2]. Disse små molekyler har vist sig at regulere gener involveret i forskellige biologiske processer, såsom celleproliferation, udvikling, differentiering, apoptose og andre. Talrige undersøgelser har vist, at ændringer i miRNA-syntese i humane cancere ofte er relateret til tumorudvikling, progression og metastase [3]. Vores tidlige eksperimenter med hybridisering arrays sammenlignede microRNA udtryk profilen mellem normale cervikale væv og livmoderhalskræft planocellulært karcinom væv, blev 89 miRNA undersøgt, og miR-20a blev opreguleret betydeligt. MIR-20a var kendt for at tilhøre den MIR-17-92 klynge, som er den mest omfattende undersøgt klynge, der har et onkogent funktion [4]. I denne undersøgelse fokuserer vi på miR-20a, som kunne være en lovende udgangspunkt for at udvikle fremtidige miRNA-baserede livmoderhalskræft terapi.

Materialer og metoder

Etisk Statement

godkendelsesproceduren og ledningsevne af denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité i Guangxi Medical University. Undersøgelsen blev foretaget i overensstemmelse med bestemmelserne i Helsingfors-erklæringen principper. Data blev indsamlet anonymt. Verbal informeret samtykke blev opnået fra alle fag, vidne, og formelt registreret for hver undersøgelse. Skriftligt samtykke til at bruge prøverne til forskningsformål blev opnået fra alle patienter før operation. Animal eksperiment blev udført i nøje overensstemmelse med vejledning for pleje og anvendelse af forsøgsdyr af det amerikanske National Institutes of Health, og forsøgsprotokollen blev godkendt af Udvalget for den etiske af dyreforsøg i Guangxi Medical University.

Patienter og prøver

cervikal vævsprøver blev indsamlet fra afdelingen for gynækologisk onkologi, den Tilknyttet Tumor Hospital i Guangxi Medical University mellem 2010 og 2011. Firs livmoderhalskræft prøver af international Federation of Gynækologi og obstetrik (FIGO ) stageⅠ-ⅱA blev opnået fra patienter, som gennemgik kirurgisk behandling. Tyve prøver af stageⅡB-Ⅳ blev fik fra cervikal biopsi. Alle prøver blev pladecellecarcinom. Ingen tidligere lokal eller systemisk behandling var blevet gennemført på disse patienter før operation eller biopsi. LNM blev bekræftet hos patienter med stadie Ⅰ-ⅡA som vi brugte operation for den første behandling. Den mediane alder for patienter var 49 år med et interval fra 25 til 69 år. Normale cervikale epitel prøver blev indsamlet fra 120 patienter, som havde hysterektomi for benign sygdom. Den gennemsnitlige alder for kontrolindivider var 45 år, der spænder fra 33 til 57 år. Vævene blev frosset i flydende nitrogen umiddelbart efter kirurgisk fjernelse og opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse.

Kvantitativ Real-Time polymerasekædereaktion

RNA blev ekstraheret fra frosne friske livmoderhalskræft væv, normale cervikale epitel væv og livmoderhalskræft celler ved anvendelse af miRcut miRNA isolation kit (Tiangen, Kina) i overensstemmelse med fabrikantens instruktioner. De reverse-transkriptionsreaktioner blev udført under anvendelse af et MiraMasTM Kit (Bioo videnskabelige, USA), som indeholder poly (A) polymerase anvendes til polyadenylering af miRNA. QRT-PCR blev udført under anvendelse af en standard SYBR Green PCR-kittet (Takara, Japan) .De primere blev syntetiseret (Shanghai GenePharma, Kina) som følger: MIR-20a videresender primer: TAC GAT AAA GTG CTT ATA GTG CAG GTA G. U6 fremad primer: ATT GGA ACG ATA KAG AGA AGA TT. Universal reverse primer: GTC CTT GGT GCC CGA GTG. PCR-blandingen 20 pi bestod af 12,5 pi SYBR Green Supermix, 3,5 pi RNase-frit vand, 1 pi fremadrettede primere, 1 pi reverse primere, og 2 pi revers transkriberet produkt. Reaktionsbetingelserne var 40 amplifikationscykler ved 95 ° C i 3 minutter, 95 ° C i 12 s, og 62 ° C i 50 s under anvendelse af en BIO-chromo4 (Bio-Rad, USA) kvantitativ realtids-PCR System. U6 blev brugt som referencer for miRNA. Hver prøve blev analyseret i tre eksemplarer. Sammenlignende tærskel cyklus (CT) metode-fold ændring (2-ΔΔCT) blev anvendt til at analysere relative ændringer.

Cell Kultur

CC cellelinjer SiHa, HCC94, C33A og Caski blev opnået fra centrale laboratorium Tilknyttet Tumor Hospital i Guangxi Medical University. Disse celler blev holdt ved 37 ° C i en atmosfære af 5% CO2 i RPMI-1640, med 10% føtalt bovint serum.

Etablering af stabile anti-MIR-20a cervikale cancercellelinier af lentivirus

de lentivirusvektorer med miRNA, der var baseret på rammen miR-20a blev bygget af GeneChem Company (Shanghai, Kina). Kort fortalt blev den dobbeltstrengede oligonukleotid kodende anti-miRNA og negativ kontrol annealet og indsat i den lineariserede eukaryote Pfu-GW-009 vektor (GeneChem). Alle disse vektorer blev bekræftet ved sekventering. De rekombinatoriske vektorer og emballage vektorer (pHelper 1.0 og pHelper 2,0) (GeneChem) blev co-transficeret ind 293T-celler (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) med lipofectamin 2000 (Invitrogen). Kultursupernatanterne blev opsamlet ved 48 timer efter transfektion, koncentreret. Alle lentivirale vektorer udtrykt forstærket grønt fluorescerende protein (GFP), hvilket tillod tittering og måle deres infektionseffektivitet i inficerede celler. Cellerne blev inddelt i tre grupper efter vores mål: a: uden infektion af virus (NC); b: infektion af kontrol virus (NC-LV); c:.. infektion af anti-miR-20a virus (anti-miR-20a-LV)

Cellebiologi funktion in vitro

Cellular levedygtighed assay

kapacitet til cellulær proliferation blev målt med 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) assay. Fireogtyve timer efter transfektion 1 × 10

4-celler blev podet i 96-brønds mikrotiterplade i 24, 48, 72 og 96 timer, hhv. Derefter blev cellerne inkuberet med 20 pi MTT (5 mg /ml, pH = 7,4) i 4 timer ved 37 ° C og 150 pi dimethylsulfid blev tilsat for at opløseliggøre krystallerne i 20 minutter ved stuetemperatur. Optisk densitet (OD) blev målt ved en bølgelængde på 490 nm. Alle forsøg blev udført tre gange og blev beregnet ved hjælp af gennemsnitlige resultater, som vi brugte til at drage de vækstkurver. Væksthæmning blev beregnet som følgende: (AC-AT) /AC × 100% (AC = ekstinktionværdi for NC og AT = absorbans værdi forsøgsgruppen)

Cell cyklus assay.. Celler blev fikseret i 70% ethanol i 2 timer ved 4 ° C. Efter vask med PBS blev cellerne behandlet med RNaseA (50 ug /ml) og farvet med propidiumiodid (25 ug /ml) i 30 min ved 37 ° C. Prøverne blev analyseret ved hjælp af en flowcytometer og distribution af celle-cyklus faser blev bestemt under anvendelse af Modfit Software (BD Biosciences). Den proliferative indeks blev beregnet som procentdelen af ​​celler i S /G2 /M-fase.

Cell apoptose assay.

Celler blev høstet og farvet med annexin V-PE og 7AAD hjælp annexin V-PE Kit (Beckman) ifølge producentens protokol og underkastet flowcytometrianalyse.

invasive og migration assay.

50.000 celler blev podet i transwell indsats (Corning) suppleret med 1640 med 10% serum. Den nederste side af transbrøndene blev fyldt med 1640 med 20% serum. For transmigration assay Matrige l (BD Biosciences) blev podet i transwell insert og lodes vokse til konfluens i 1 dag. 50.000 celler blev podet i transwell inserts suppleret med 1640 med 10% serum. Den nederste side af transbrøndene blev fyldt med 1640 med 20% serum. Efter 24 timer blev membraner farvet under anvendelse hæmatoxylin-eosin-farvning blev celler talt under det fluorescerende mikroskop. Dette eksperiment blev udført uafhængigt tre gange i dubletter.

Kolonidannelse assay.

Ca. 500 celler blev anbragt i en frisk plade med 6 brønde i yderligere 12 timer og opretholdt i RMPI 1640 indeholdende 10% FBS i 2 uger. Kolonier blev fikseret med methanol og farvet med 0,1% krystalviolet i 20% methanol i 15 minutter. Celler blev talt under det fluorescerende mikroskop. Dette forsøg blev udført uafhængigt tre gange i dubletter.

In vivo assays til tumor spredning

Fireogtyve 6 uger gamle vejer 19-21 g immundefekte beige /nude /XID nu /nu-kvinde mus blev indkøbt fra Guangxi Medical University, og holdt under patogenfrie betingelser med bestrålet chow. I vort eksperiment, 2 × 10

6 celler af forskellige grupper i 0,2 ml PBS blev injiceret subkutant ind i bagagerummet på 24 mus, hvilket fører til dannelsen af ​​en tumor per dyr. 0,2 ml chloralhydrat blev intraperitoneal injiceret at tage fluorescerende billeder efter anæstesi, når diameteren af ​​tumoren var 2 cm. Tegn vækstkurven. Tumorvækst blev overvåget af tumor volumen, der blev beregnet som beskrevet:. Volumen (mm

3) = bredde

2 (mm

2) × (mm) /2

Western blot

Cellulære proteiner blev fremstillet ved anvendelse af cellelyse-buffer (50 mM Tris-HCI, pH 8,0, 1% NP-40, 2 mM EDTA, 10 mM NaCl, 2 mg /ml aprotinin, 5 mg /ml leupeptin, 2 mg /ml pepstatin, 1 mM DTT, 0,1% SDS og 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid). Lige store mængder protein (50 ug) blev separeret ved 10% SDS PAGE og derefter overført til nitrocellulosemembraner (NY, USA) ved elektroblotting. Membranerne blev blokeret med 5% BSA i TBST (10 mM Tris-HCI, pH 8,0, 150 mM NaCl og 0,05% Tween 20) i 1 time, og derefter inkuberet med primære antistoffer (Santa Cruz) natten over ved 4 ° C før efterfølgende inkubering med sekundært antistof (BD) i 1 time ved 37 ° C. Protein blev visualiseret ved hjælp af forøget kemiluminescens reagens (Santa Cruz).

Luciferaseassayreagens

MIR-20a bindingssteder fra 3’UTR ATG7 /TIMP2 eller mutant 3’UTR blev klonet ind i pGL3 reporter luciferase vektor (GeneChem). For reporter assay 100 nM MIR-20a efterligner eller kontrol miRNA blev cotransficeret med 0,1 ug af pGL3-3’UTR vildtype eller mutante plasmid-DNA’er i SiHa-celler i 96-brønds plader under anvendelse af Lipofectamine 2000 Luciferaseaktivitet blev målt 48 timer efter transfektion som beskrevet tidligere.

Statistisk analyse

Alle data blev behandlet ved hjælp PASW Statistics 16. data blev præsenteret som gennemsnit ± SEM. hjælp t test for 2-gruppe sammenligninger. Mens resultaterne ikke vise normalfordeling, valgte vi at analysere data med ikke-parametriske metoder. (Mann-Whitney U test mellem to grupper og Kruskal-Wallis H test for tre eller flere grupper). En

P Drømmeholdet værdi mindre end 0,05 anses statistisk signifikant.

Resultater

MIR-20a er opreguleret i livmoderhalskræft

Brug en qRT- PCR-fremgangsmåden blev mIR-20a-niveauer detekteret i 100 livmoderhalskræft væv og 120 normale cervikale væv, samt cervikale cellelinier. Blandt de 100 patienter med cervikal cancer, rapporterede dataene i fig. 1A viser miR-20a er absolut opreguleret i svækket væv med en median på 6,92, hvilket tyder på, at stigningen i miR-20a blev en hyppig begivenhed i livmoderhalskræft. Patienter med opreguleret ekspression af MIR-20a tendens til at have LNM (

P

= 0,001) som i fig. 1B, øget tumor størrelser (

P

= 0,013, Mann-Whitney U test), fremskreden (

P

= 0,004, Kruskal-Wallis H test), og avancerede histologisk bedømmelse (

P

= 0,027, Mann-Whitney U-test) af livmoderhalskræft. Disse resultater antyder, at MIR-20a kan spille en kritisk rolle i livmoderhalskræft metastase og progression

A:. MIR-20a blev målt ved QRT-PCR. Datas blev præsenteret som log10 af fold-ændring. Mann-Whitney-test blev udført for at undersøge forskellen mellem normale kontroller og livmoderhalskræft patienter blev Kruskal-Wallis H test anvendt til at definere forskellen mellem trin I-IV af cervikale kræftpatienter. B: Vi sammenlignede ekspressionen mellem patienter, som havde lymp node metastase eller ikke i samme fase. C: Ekspressionsniveauerne for MIR-20a blev påvist ved QRT-PCR i cervikale cancercellelinier (SiHa, HCC94, C33A og Caski).

P

-værdi. 0,05 blev betragtet som signifikant

Desuden var ekspressionsniveauerne af miR-20a påvist ved QRT-PCR i livmoderhalskræft cellelinjer (SiHa, HCC94, C33A og Caski) (fig. 1C), som var højest i SiHa cellelinje.

mIR-20a letter Livmoderhalskræft vækst og metastase in vitro

noterer sammenhængen mellem up-regulerede miR-20a niveauer og livmoderhalskræft progression, undersøgte vi effekten af ​​miR-20a på vækst, migration og invasion evner livmoderhalskræft cellelinjer. SiHa cellelinje blev inficeret med enten anti-MIR-20a eller kontrol lentivirus og etablere stabile anti-MIR-20a SiHa cellelinie (fig. 2A). Sammenlignet med ekspressionen af ​​kontrolgruppen, MIR-20a var signifikant nedreguleret i SiHa-cellelinien efter infektion med anti-MIR-20a-LV (fig. 2B). Cellerne blev inddelt i tre grupper efter vores mål: a: uden infektion af virus (NC); b: infektion af kontrol virus (NC-LV); c:. infektion af anti-MIR-20a-virus (anti-MIR-20a-LV)

A: GFP etikettering flowcytometri-analyse indikerede, at procentdelen af ​​GFP-positive celler var omkring 97% i stabilt lentivirus-inficerede SiHa cellelinie. B:. MIR-20a blev lavere udtrykt i stabil anti-MIR-20a SiHa cellelinie mens ekspressionsniveauet af MIR-20a stadig var meget høj i celler inficeret med negativ kontrol

Dernæst cellevækst egenskaber, cellecyklus, klon dannelse, celle migration, vedhæftning, blev udført celle invasion forsøg. Vækstkurver viste, at infektion af anti-MIR-20a livmoderhalskræft cellelinie aftog (fig. 3A). Flowcytometri viste gennemsnittet af G1 periode af celler i anti-MIR-20a-LV gruppe er 69,6%, mens den tilsvarende kontrolgruppe var 55%, det er at reducere proliferation cyklus af celler (fig. 3B). Apoptotisk blev forøget og nåede forskelle statistisk signifikans i hver gruppe (

P

0,001) (. Figur 3C). Migration, vedhæftning evne invasion i livmoderhalskræft celle blev også påvist, kunne miR-20a lette metastaser (

P

0,01) (. Figur 3D og 3E). Den dannede mængde af de to grupper koloni, var ingen signifikant forskel (

P

0,01). B:. Billeder af tumorer i hver gruppe

MIR-20a Direkte Mål og Hæmmer ATG7 og TIMP2

For at forstå hvordan miR-20a letter livmoderhalskræft kræft vækst og metastase, vi brugte tre algoritmer (Targetscan, Pictar og Miranda) til at identificere miR-20a mål i humane livmoderhalskræft. Af disse målgener, der blev forudsagt af alle tre algoritmer (fig. 5A), autofagi relateret protein 7 (ATG7) og vævsinhibitorer af metalloproteinase 2 (TIMP2) tiltrukket vores opmærksomhed straks som de er blevet impliceret i tumorgenese og metastase. Vi klonede ATG7 og TIMP2 3′-UTR i en luciferase reporter vektor. Luciferase assay viste, at MIR-20a direkte bundet til ATG7 og TIMP2 3′-UTR, og hvorved det bemærkelsesværdigt reduceret luciferaseaktiviteter (fig. 5B). Men mutation af de formodede miR-20a sites i 3′-UTR af ATG7 og TIMP2 ophævet luciferase lydhørhed over for miR-20a. For direkte at vurdere virkningen af ​​miR-20a på ATG7 og TIMP2 udtryk, vi udførte western blot analyse. Som det ses i fig. 5C knockdown af MIR-20a, gennem infektion af anti-MIR-20a-LV, i SiHa-celler forøget ATG7 og TIMP2 proteinniveauer. Tilsammen indikerer disse resultater ATG7 og TIMP2 er direkte downstream mål for miR-20a i SiHa celler. Ovenstående resultater fik os til at undersøge, om miR-20a undertrykker livmoderhalskræft kræft vækst og metastase gennem undertrykke ATG7 og TIMP2 udtryk

A:. Forudsagt følgeskader parring af målområde og miRNA ved Targetscan, Pictar og Miranda. B: Luciferaseaktivitet viste et signifikant fald efter MIR-20a tvungen ekspression sammenlignet med negativ kontrolgruppe. C:. Western blot-analyser viste knockdown af miR-20a, gennem infektion af anti-miR-20a-LV, i SiHa celler øget ATG7 og TIMP2 protein niveauer

Diskussion

Vores gruppe har været fokus på den molekylære mekanisme af livmoderhalskræft pladecellekræft udvikling i de senere år, især afsætter til undersøgelse af vækst og metastase. Lymfeknudemetastase (LNM) er den mest vigtigste prognostiske faktor af patienterne med Stage IB eller IIA, de fem-års overlevelse på patienter falder dramatisk fra ca. 80-95% hos patienter uden lymfeknudemetastaser til ca. 50-65% i patienter med positive lymfeknuder. Derfor forventede vi, at deregulering af microRNA kan lette den avancerede udvikling af livmoderhalskræft pladecellekræft. Zhang J, et al kaste lys på den negative feedback regulering af NF-KB /miR-130a /TNF-α /NF-KB i livmoderhalskræft og kan give indsigt i carcinogenese af livmoderhalskræft [5]. Wen SY, et al fandt, at MIR-506-ekspression blev nedreguleret i ca. 80% af den livmoderhalskræft undersøgte prøver og omvendt korreleret med ekspressionen af ​​Ki-67 [6]. Blandt onkogene miRNA, en af ​​de bedst karakteriserede MIR-17-92, en polycistronisk miRNA klynge, betegnet OncomiR-1 [7]. Forstadiet transkript indeholder seks tandem stem-loop hårnålestrukturer der i sidste ende afkaster seks modne miRNA: MIR-17, MIR-18a, MIR-19a, MIR-20a, MIR-19b-1 og MIR-92-1 [8]. Især er MIR-17-92 placeret ved 13q31.3, en region amplificeret i adskillige hæmatopoietiske maligniteter og faste tumorer, herunder diffuse B-cellelymfomer, follikulære lymfomer, Burkitt lymfomer og lungecarcinom [9].

Nyere resultater viser, at disse miRNA er integrerede komponenter i de molekylære veje, der regulerer tumorudvikling og tumor vedligeholdelse, er virkningerne af mIR-20a overekspression blevet undersøgt i flere dyremodeller, humane cancere, og cellekultursystemer for sin evne til at regulere en række cellulære processer, der fremmer malign transformation [10-11]. Disse undersøgelser som helhed viste, at miR-20a fungerer pleiotropically under både normal udvikling og malign transformation til at fremme spredning, hæmmer differentiering, forøge angiogenese, og opretholde celle overlevelse. Men potentialet funktion af denne microRNA i human cervical pladecellecarcinom progression har få rapporter. I den foreliggende undersøgelse, er vi interesseret i den potentielle rolle for miR-20a i den maligne progression af SiHa celler.

I denne undersøgelse fandt vi, at miR-20a var ofte opreguleret i vævsprøver. , Formodede vi, at miR-20a kan være en roman tumor onkogen miRNA og deregulering kan involvere den avancerede udvikling af human cancer. Dernæst undersøgte vi funktionen af ​​MIR-20a i SiHa-celler. Fastlægge stabile anti-MIR-20a cervikale cancercellelinier af lentivirus, og forud til celle vækstkarakteristika, cellecyklus, klon dannelse, cellemigration, adhæsion og invasion eksperimenter. Modellen af ​​down-udtrykte miR-20a livmoderhalskræft implanteret i nøgne mus blev også fastslået som udforske potentialet af anti-miR-20a in vivo. Derefter fandt vi, at inhiberede MIR-20a forhindret tumorprogression ved at modulere cellecyklus, proliferation, apoptose, og invasion. Vækstkurver viste, at infektion af anti-MIR-20a livmoderhalskræft cellelinie aftog. Modellen for down-udtrykte MIR-20a livmoderhalskræft xenotransplantater i nøgne mus blev etableret, viste resultaterne, at lentivirus-medieret anti-MIR-20a væsentligt kan undertrykke væksten af ​​livmoderhalskræft xenografter i nøgne mus.

Vi yderligere karakteriseret ATG7 og TIMP2 som funktionelle mål for miR-20a ved luciferasereportergen assays og western blot analyse henholdsvis. Autophagy leverer cytoplasmatiske komponenter til lysosomer for nedbrydning og genanvendelse af nedbrydningsprodukterne, såsom aminosyrer, kulhydrater og lipider, der anvendes til at syntetisere nye proteiner og organeller eller metaboliseres til at levere energi [12]. Autophagy er nært forbundet med eukaryot celledød og apoptose. Faktisk i nogle tilfælde de samme proteiner kontrollere både autofagi og apoptose. Apoptotisk signalering kan regulere autofagi og omvendt autofagi kan regulere apoptose. Det er blevet foreslået, at “autophagic celledød” er en anden type “aktiv” programmeret død [13]. ATG7 er en af ​​master regulatorer af autophagy proces, der er ansvarlig for to store reaktioner der er involveret i autophagosome dannelse og i vesikel progression [14]. Det blev desuden allerede fastslået, at Atg7 – /- knockout mus dør inden for en dag fra fødslen og viser reduceret pup størrelse, på grund af en forringet autofagi pathway [8]. Yoshihiro Inami, et al fandt, at tabet af Atg7 i muselever forårsager hepatocellulære adenomer [15]. Gennem brug af gain-or-lose molekyler, demonstrerede vi, at MIR-20a var i stand til at modulere autofagi varierende endogene ATG7 ekspressionsniveauer, og denne virkning blev medieret via et MIR-20a konsensus sekvens indeholdt i 3′-UTR af genet .

under processen med tumorinvasion, væsentlige trin omfatter nedbrydningen af ​​basalmembraner og remodellering af den ekstracellulære matrix (ECM) af proteolytiske enzymer, såsom matrixmetalloproteinaser (MMP’er), der reguleres af vævsinhibitorer af metalloproteinaser (TIMP’er ). MMP’er, især MMP-2 og MMP-9, er vigtige enzymer, der vides at nedbryde komponenterne i omgivende ECM under cancer invasion og metastase [16]. Den beregningsmæssige forudsigelse af miRNAtarget sites foreslog TIMP2 måske målet for miR-20a, som blev bekræftet ved western blot og luciferaseanalyse også.

Konklusioner

Vores resultater tyder på, at miR-20a udtryk kan være relateret med ondartet proces med livmoderhalskræft, især invasion og metastase ved at målrette ATG7 og TIMP2. Der er behov for omfattende og langsigtede opfølgende undersøgelser for at bekræfte betydningen af ​​miR-20a i livmoderhalskræft. MiRNA kan være et attraktivt mål for terapeutisk intervention.

Støtte Information

S1 Fig. . Vector map

A: lentivirusvektor kortet; B pGL3 promotor vektor kort

doi:. 10,1371 /journal.pone.0120905.s001

(DOC)

S2 Fig. Lentivirusvektor sekventering resultater

doi:. 10,1371 /journal.pone.0120905.s002

(DOC)

S1 datasættet. . Target gensekvenser ved kemisk syntese

Begge sider af de kodende sekvenser var XbaI restriktionsenzymskæring sites, mærkede zoner blev binging sites

doi:. 10,1371 /journal.pone.0120905.s003

(DOC)

S1 tabel. Association mellem ekspressionen af ​​miR-20a med klinisk-patologiske træk hos patienter med livmoderhalskræft

doi:. 10,1371 /journal.pone.0120905.s004

(DOC)

S2 Table. OD-værdi efter infektion (MTT)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0120905.s005

(DOC)

S3 Table. Hæmning af væksten af ​​SiHa xenografter i nøgne mus med anti-miR-20a-LV

doi:. 10,1371 /journal.pone.0120905.s006

(DOC)