PLoS ONE: Integreret og Functional Genomics Analyse validerer relevans Nuclear Variant ErbB380kDa i prostatakræft Progression

Abstrakt

EGF-familien af ​​tyrosin-kinase receptorer aktiverer cytoplasmatiske veje involveret i celle formering, migrering og differentiering som svar på specifikke ekstracellulære ligander. Ved siden af ​​disse kanoniske veje, den nukleare lokalisering af ErbB receptorer i primære tumorer og kræft cellelinjer førte til at undersøge deres rolle som transkriptionelle regulatorer af kræft gener. Den nukleare lokalisering af ErbB3 er blevet rapporteret i forskellige væv og andre cellelinier, men de nukleare funktioner og det formodede korrelation med tumorprogression og modstandsdygtighed over for terapi er fortsat uklare. Vi vurderede først ErbB3 udtryk i normale og tumor prostata væv. Det nukleare farvning skyldes primært en isoform matcher C-terminalen domæne af den fulde længde ErbB3

185kDa receptor. Nuklear farvning blev også begrænset til cancerceller og blev øget i avanceret kastrationsresistent prostatacancer sammenlignet med lokaliserede tumorer, hvilket tyder det kunne være involveret i progressionen af ​​prostatacancer op til den terminale kastrationsresistent fase. Chip-on-chip eksperimenter blev udført på udødeliggjorte og tumorcellelinier valgt ved karakterisering af endogen nuklear ekspression af et ErbB3

80 kDa isoform. Blandt de 1840 mål initiativtagere identificeret, 26 blev udvalgt før ErbB3

80 kDa-afhængig genekspression blev evalueret ved real-time kvantitativ RT-PCR, som godtgør, at ErbB3

80 kDa udøvede transkriptionel kontrol på disse gener. Nogle mål er allerede kendt for at være involveret i prostatakræft progression, selvom nogen forbindelse tidligere blev etableret med ErbB3 membran og /eller nuklear signalering. Mange andre, som endnu ikke er forbundet med prostatakræft, kunne give nye terapeutiske muligheder for patienter, der udtrykker ErbB3

80 kDa. Afsløring ErbB3

80 kDa kunne således udgøre en nyttig markør for prognosen og respons på behandling

Henvisning:. El Maassarani M, Barbarin A, Fromont G, Kaissi O, Lebbe M, Vannier B, et al. (2016) integreret og funktionelt Genomics Analyse validerer relevans Nuclear Variant ErbB3

80 kDa i Prostata Cancer Progression. PLoS ONE 11 (5): e0155950. doi: 10,1371 /journal.pone.0155950

Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, ØSTRIG

Modtaget: Juli 20, 2015; Accepteret: 7 maj 2016; Udgivet: 18. maj 2016

Copyright: © 2016 El Maassarani et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Microarray data findes på ArrayExpress: E-mtab-3499, E-mtab-3504

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Ligue contre le cancer, LCC PS /2012-13-14 til PS; Groupe Pasteur Gensidighed til AB; og Ministère de l’Education Nationale de la recherche et des teknologier 2010-2014 til MEM. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

familien EGF-receptorer består af fire tyrosinkinase (TK) receptorer (EGFR /ErbB1, HER2 /ErbB2, HER3 /ErbB3 og HER4 /ErbB4) med et ekstracellulært ligandbindende domæne, et transmembrant domæne og et intracytoplasmatisk domæne. Ved specifik ligand binding ved celleoverfladen, ErbB-receptorer dimerisere og udløser intracellulære signalveje, der er involveret i celleproliferation, migration og differentiering [1]. Dereguleringen af ​​ErbB downstream veje, gennem tre lysnettet mekanismer -Øget receptor-ekspression, øges ligand udtryk eller aktivere mutation af TK domæne-ofte involveret i tumorigenese [2]. Ud over deres lokalisering på plasmamembranen, har ErbB-receptorer også blevet beskrevet i kernen og forskellige funktioner er blevet tilskrevet de translokeres ErbB receptorer blandt hvilke er celleproliferation, DNA-reparation og transskription kontrol [3-8]. I denne henseende er den fuld-længde ErbB1 receptor i kernen forbundet med forøget ekspression af proliferative og metastatiske gener [9-11]. Ekspressionen af ​​det pro-apoptotiske og pro-angiogen COX-2-protein er moduleret ved ErbB2-binding på

COX-2

promotoren i brysttumorceller [12]. ErbB2 fungerer også som en transkriptionel co-aktivator af Stat3 proteinet på

CCND1

(cyclin D1) promotor [13], og samarbejder med ErbB1 til opregulere

STAT1

genekspression [14] . Den fulde længde ErbB3

185kDa protein eller korte isoformer er blevet beskrevet i kernen af ​​normale mammaepitelceller [15] og Schwann-celler [16] samt i forskellige humane cancercellelinier: bryst (SKBR3, MCF-7 ET BT474), lunge (H226 et SCC6) hoved og hals (SCC6 et SCC1) og kolon (LoVo et Caco2) [15, 17-19]. I H358 ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) og SKBR3 bryst cellelinier har ErbB3 blevet vist at udøve funktionen som et co-transkriptionel aktivator for

CCND1

genekspression [17,19]. Den stærke transaktivering potentiale ErbB3 bygger næsten udelukkende på den C-terminale domæne af receptoren [19].

Prostatacancer (PCA) er den mest almindelige urologiske malignitet og den næststørste årsag til kræft dødsfald i de industrialiserede lande . Tumor tilbagefald efter kirurgisk ablation eller strålebehandling hyppigt forekommer i en signifikant del af patienterne, der udvikler disseminerede aggressiv sygdom. Som PCA celler er afhængige af androgen receptor (AR) aktivitet for vækst og spredning, har androgen tilbagetrækning terapi blevet godkendt i de avancerede tilfælde [20]. Gavnlige virkninger observeres i omkring 24 måneder før patienten udvikler dødelig kastrationsresistent-prostata-cancer (CRPC). Molekylære mekanismer involveret i terapi modstand stadig uklart. En forklaring på en patients tilbagefald efter behandling kunne komme fra krydstale mellem AR signaleringen og epitelvækstfaktor familie af receptorer (EGFR) pathways [21]. ErbB-receptorerne og deres ligander udtrykkes i normale voksne prostata at opretholde homøostase af organet og ErbB1, ErbB2 og ErbB3 ofte forøges under PCa progression [22]. I CRPC, øget ErbB2 receptor og /eller ErbB1, ErbB2 eller ErbB3-ligander udtryk er forbundet med dårlig prognose og metastase [23-25].

Til omgåelse mekanismerne i modstand mod androgen-terapi, ErbB1 og ErbB2 TK-hæmmere er blevet testet sammen med hormon-baseret behandling af patienter med høj kvalitet, CRPC tumorer. Men forsøg var ikke vellykket som tumorceller udviklet kompenserende veje ved at regulere ErbB3 udtryk og lokalisering [18,26]. Faktisk har flere undersøgelser rapporteret den nukleare lokalisering af ErbB3 i prostata væv og PCA-cellelinjer potentielt korreleret med sygdom progression [18,27] .Den nukleare ErbB3 protein kunne således spille en central rolle i PCa progression og terapi modstand, men den molekylære mekanismer involveret stadig uudforsket.

den aktuelle undersøgelse viser den funktionelle relevans af ErbB3 nukleare lokalisering i PCa og giver nye spor til forståelse af veje, der er forbundet med kræft progression og terapi modstand.

Materialer og metoder

patienter Tissue microarrays

skriftlige informerede samtykke blev indhentet fra patienter i overensstemmelse med kravene i den institutionelle etik udvalg af Centre Hospitalo-Universitaire de Poitiers, der godkendte undersøgelsen. 169 formalinfikserede, paraffinindlejrede, arkivering væv fra patienter behandlet ved “Centre Hospitalier Universitaire de Poitiers” for PCa, blev inkluderet. 137 vævsprøver blev opnået fra hormon-følsomme (HS) patienter der undergik radikal prostatektomi for klinisk lokaliseret cancer, ingen af ​​disse patienter fik hormon deprivationsbehandling inden operation. Af disse 97 var stadium pT2 og 40 pT3. Den Gleason scoring var henholdsvis 6 i 38 patienter, 7 i 83 patienter, og 8 eller mere i 16 patienter. 32 vævsprøver blev opnået ved trans-uretral resektion fra CRPC patienter. Normalt udseende prostatavæv fra 50 patienter behandlet med radikal prostatektomi blev også inkluderet. Immunfarvning blev udført under anvendelse af de følgende antistoffer: ErbB3 C-ter (kanin polyklonalt sc-285, Santa Cruz Biotechnology 1/200), ErbB3 N-ter (Mouse monoklonalt Ab-5 Clone H3.105.5, NeoMarkers, 1/50), CCND1 (Rabbit monoklonalt, klon EP12, DAKO, 1/50) og Ki67 (Mouse monoklonale, klon MIB-1, DAKO, 1/100). Negative kontroller blev opnået ved anvendelse af et irrelevant antistof. Væv fra mantle zone lymfom blev anvendt som positiv kontrol for Ki67 og CCND1. Objektglas blev analyseret ved 2 observatører i en blind måde. For ErbB3C-ter, CCND1 og Ki67-farvning, blev hvert væv kerne givet en kontinuerlig værdi, der repræsenterer procentdelen af ​​tumorceller der udviser nukleare farvning. For hver patient, blev kernen med den højeste procentdel valgt.

Cellelinjer

Humane prostata RWPE celler (ATCC

® CRL11609 ™), normale epitelceller udødeliggjort af HPV-18, blev opretholdt i keratinocyt serumfrit medium suppleret med ekstrakt fra bovin hypofyse (BPE, 0,05mg /ml) og human rekombinant epidermal vækstfaktor (EGF, 5 ng /ml) (Invitrogen). Human prostata LNCaP-cellelinje (ATCC

® CRL1740 ™) afledt af lymfeknude og PC3 (ATCC

® CRL1435 ™) cellelinie afledt fra knoglemetastaser, blev dyrket i DMEM suppleret med 10% føtalt kalveserum og 1% penicillin /streptomycin.

Western blotting

Protein ekstrakter og western blot-analyse blev udført som beskrevet i [17]. Nukleare og ikke-nukleare ekstrakter blev fremstillet som følger: cellerne blev resuspenderet i Tris-HCI 10 mM pH 7,5, NaCI 120 mM og lyseret med NP40 til en endelig koncentration på 0,3%. Efter centrifugering i 5 min ved 2500 g, blev supernatanter tilsat EDTA 1 mM, DTT 1 mM, SDS 0,1%, PIC 1/50 og PMSF 1/100 for at udgøre den ikke-nukleare fraktion. Pelleten svarende til kerner blev vasket tre gange i Tris-HCI 10 mM pH 7,5, NaCI 120 mM, NP40 0,3% for at fjerne cytoplasmatiske rester, lyseres derefter som ovenfor.

Chip-on-chip

Celler blev behandlet med 1% formaldehyd og chromatin ekstraktion blev udført med Simple chip Enzymatisk chromatin IP kit (Cell Signaling Technology, CST) i overensstemmelse med fabrikantens anbefalinger. Det udvundne kromatin blev fordøjet af Micrococcal nuclease til opnåelse kromatin-fragmenter omkring 500pb størrelse. På dette trin blev der i alt DNA-prøve (Indgang) skal indsamles til senere brug. Immunfældning blev udført ved anvendelse af anti ErbB3 C-ter-antistoffer (sc-285 eller sc-7390, SCBT) eller anti-H3 (positiv kontrol, histon H3-antistof ChIP formulerede # 2650, CST) og for inkubering med ikke-relevant normalt kanin IgG (chip negativ kontrol). Totalt DNA og chip-DNA blev amplificeret under anvendelse af hele genomet Amplification Kit (WGA-2, Sigma-Aldrich) og henholdsvis mærket med Cy-3 eller Cy-5 fluorochromer under anvendelse BioPrime Array Genomisk Labelling kit (Invitrogen). Mærkede prøver blev hybridiseret Menneskerettig- Promoters Microarrays (Agilent Human Promoter chip-on-Chip Microarray Set 244K, P /N G4489A) i henhold til producentens anbefalinger.

Normalisering og analyse af microarray data

data fra Agilent høj opløsning mikromatrice scanner blev analyseret ved hjælp af Feature Extraction 10.1 Software (Agilent Technologies). De fluorescens pletter, der ikke har bestået kvalitetskontrol blev udelukket. Signaler af berigelse nøgletal (chip /Input) i forbindelse med fusionerede replikater blev beregnet ved hjælp Cocas software [28]. ErbB3-beriget promotorer fra tre uafhængige forsøg blev isoleret under anvendelse af topdetektion algoritme i cocas efterfulgt af berigelse scorer beregnes ved måling af effektive topareal.

Real-time kvantitativ PCR (qPCR) analyse

qPCR forsøg blev udført på ErbB3-immunpræcipiteret eller IgG-kontrol-DNA, under anvendelse af GoTaq qPCR Master Mix (Promega) ifølge producentens anvisninger på en 7500 Fast Real Time PCR-system (Applied Biosystems). Relativ berigelse blev anslået efter kvantificering af PCR signal ved at måle forholdet IP ErbB3 /IgG. Liste over chip-qPCR primere er givet i tabel 1.

RNA isolering og RT-qPCR

LNCaP og PC3 celler blev transficeret med 20pmol af kontrol- eller ErbB3-specifikke siRNA’er (Eurogentec ) før totalt RNA blev ekstraheret ved anvendelse RNAble (Eurobio). cDNA blev syntetiseret fra 2-6μg af total RNA og amplificeret ved qPCR som beskrevet ovenfor. GAPDH blev anvendt som intern kontrol for at normalisere genekspression. Liste over cDNA RT-qPCR primere er givet i tabel 2.

Resultater

ErbB3 udtryk og lokalisering i normale og tumor prostata væv

137 HS, 32 CRPC og 50 normalt udseende tumor-tilstødende væv blev analyseret ved immunohistokemi (figur 1). I alle prøver, farvning for ErbB3 N-ter, når til stede, var placeret hovedsagelig på membranen, og ingen nuklear farvning blev observeret (Fig 1A). Alle de 169 prøver viste cytoplasmatisk farvning med ErbB3 C-ter. (Fig 1B). I modsætning hertil blev nuklear farvning observeret med ErbB3 C-ter i 60 af de 169 (35%) PCA prøver, men i ingen af ​​de ikke-tumorprøver. Nuklear ErbB3 ekspression blev oftest observeret i CRPC (17/32, 53%) end i HS tumorer (43/137, 31%) (p = 0,03, Chi 2 test). Hertil kommer, når til stede, procentdelen af ​​PCa udtrykker ErbB3 i kernen var højere i CRPC (median 10%, range 2-95%) end i HS cancere (median 2%, range 1-20%) (p = 0,007, Mann Whitney-test). Medianen ekspression af CCND1 var 15% af HS prostatacancerceller (interval 0-70%, ikke vist) og 20% ​​af cancerceller i CRPC væv (interval 0-80%) (Fig 1D og 1G). Medianen proliferationshastighed vurderet ved Ki67-farvning var 1% af PCA celler i HS væv (interval 0-10%, ikke vist) og 17,5% i CRPC prøver (Fig 1E og 1H). I HS, sås ikke signifikant sammenhæng mellem nuklear ErbB3, CCND1 (p = 0,09) og spredning (p = 0,1, Spearman test). I CRPC blev den nukleare udtryk for ErbB3 signifikant associeret med

CCND1

udtryk, med en positiv korrelation (p = 0,01, Spearman test) (Fig 1C og 1D vs 1F og 1G). For at genoptage, nuklear ErbB3 er meget og ofte udtrykt i CRPC og korrelerer med CCND1 udtryk, hvorimod ikke blev observeret nogen signifikant sammenhæng i HS tumorer.

Farvning med ErbB3 N-ter antistof i PCA væv blev placeret på membranen, uden nuklear ekspression (a). Nr ErbB3 C-ter-nuklear farvning blev påvist i “normale” prostatavæv (b). Nuklear ErbB3 ekspression blev observeret i PCA-celler, og oftere i CRPC avancerede tumorer sammenlignet med klinisk lokaliserede cancere. I CRPC blev højt nukleart farvning forbundet med høj CCND1 udtryk og havde tendens til at være forbundet med højere spredning (Ki67) (CRPC 1, ce), mens de fleste tumorer uden nukleare farvning viste lav CCND1 udtryk og en tendens til at vise lavere spredning (CRPC 2, fh).

ErbB3 udtryk og lokalisering i prostata cellelinjer

Vi næste vurderede endogen ErbB3 udtryk og lokalisering i prostata cellelinjer hjælp ErbB3 C-ter-antistoffer. Ved indirekte immunofluorescens, ErbB3-farvning var hovedsageligt til stede på plasmamembranen og i cytoplasmaet af RWPE celler, hvorimod en høj nuklear farvning blev detekteret i tumor cellelinier (fig 2A). Western blot analyse af ekstrakter af totalt protein viste, at de tre cellelinier udtrykte samme indhold af fuld længde ErbB3

185kDa protein. En yderligere 80 kDa protein blev specifikt påvist i hormon-følsomme (LNCaP) og hormon-resistent (PC3) tumorcellelinier (Fig 2B). Dernæst blev western blotting udført på ikke-nukleare vs proteinfraktioner nukleare. Kvaliteten af ​​ekstrakterne blev valideret af den specifikke påvisning af cytosol PAK1 protein i ikke-nukleare ekstrakter og C23 (nucleolin) protein i de nukleare ekstrakter. Som vist, blev ErbB3

185kDa primært til udtryk i det ikke-nukleare fraktioner og var fraværende eller svagt påvises i de nukleare fraktioner af alle celletyper. I stedet blev den 80 kDa proteinet næsten udelukkende påvist i de nukleare fraktioner af LNCaP og PC3-celler (fig 2C). Disse data tyder på, at den nukleare protein påvist i PCA-celler hovedsageligt kunne svare til ErbB3

80 kDa nukleare isoform tidligere beskrevet i lungekræft cellelinier [17].

(A) Både RWPE og PC3-celler udviser cytoplasmatisk og membran ErbB3 lokalisering. Desuden native PC3-celler udviser en stærk kernelokalisering detekteret af ErbB3 C-ter-antistof (sc-285, Santa-Cruz Biotechnology). (B) I alt proteinekstrakter, ErbB3 C-ter-antistof detekterer fuldlængde ErbB3

185kDa protein i alle cellelinjer og 80 kDa protein i LNCaP og PC3 tumorcellelinjer. (C) Den fulde længde ErbB3

185kDa protein er næsten kun fundet i de ikke-nukleare fraktioner, der omfatter plasmamembranen og cytoplasmatiske proteiner mens et stærkt 80 kDa signal observeret i nukleare fraktioner af tumor linjer. (D) en 719 bp amplifikationsprodukt er påvist i de tre cellelinjer med primerne designet til at amplificere både den fulde længde mRNA (NM_001982.3) og AK300909.1 variant (PCR1), hvorimod PCR2 og pCR3-primere specifikke for AK124710. 1 og AK1250281 henholdsvis ikke amplificeret helst sekvens. (E) Kvantitativ analyse med specifikke primere for ErbB3 udskrifter viser, at NM_001982.3 og AK300909.1 udtrykkes på sammenlignelige niveauer i LNCaP og PC3 cellelinjer mens AK300909.1 er lidt påvises i RWPE celler.

Blandt de formodede varianter rapporteret i offentlige databaser, der kunne transskriberet fra

ErbB3

gen, kun tre kunne svare til den nukleare ErbB3

80 kDa protein. De mangler 5′-sekvensen, der koder det ligandbindende domæne og transmembrandomænet af receptoren og har forudsagte kernelokaliseringssignaler (NLS) [29]. Til at skelne mellem disse varianter udførte vi RT-PCR med primere omkring ATG startcodon af mRNA’erne. I de tre cellelinjer blev et 719 bp PCR-produkt påvises med primerne par (PCR1), som muliggør amplifikation af både fuldlængde NM_001982.3 og variant AK300909.1 transkripter, der deler den samme nucleotidsekvens. Dette eksperiment førte os til at eliminere AK124710.1 og AK1250281 og at fokusere på den AK300909.1 udskrift (Fig 2D). Denne variant forudsiges at kode for et 699aa protein, hvis sekvens er helt identiske med det intracellulære domæne af ErbB3

185kDa. At skelne mellem NM_001982.3 og AK300909.1 ekspression i cellelinjerne blev RT-qPCR udført under anvendelse af primere, der amplificerer begge transkripter eller primere specifikke for den 5′-kodende sekvens af NM_001982.3 (fig 2E). Som vist blev begge transkripter udtrykt på samme niveau i LNCaP og PC3-celler, hvorimod AK300909.1 var næppe detekterbar i RWPE celler (Fig 2e).

Således LNCaP og PC3 prostata tumorcellelinjer koder to forskellige proteinisoformer ErbB3

185kDa og ErbB3

80 kDa, svarende til NM_001982.3 og AK300909.1 mRNA-transkripter hhv.

genom-dækkende analyse af ErbB3 for målgruppen initiativtagere i prostata kræftceller

for at identificere ErbB3-målgener, vi næste udført Chip-on-chip analyser ved hjælp chip-valideret ErbB3 C-ter-antistoffer [17] i overensstemmelse med den beskrevne arbejdsgang (fig 3A). ErbB3-bundne genomiske regioner blev først undersøgt ved hjælp af standalone Cocas V2.4 software [28]. Efter forbehandling trin, topdetektion algoritme detekteret høje sonde signaler svarende til væsentlige ændringer i Cy3 /Cy5-forhold på berigede genomiske regioner. I alt 68% af ErbB3 for målgruppen prober blev placeret i de centrale promotorer, mens 30% var inde generne og 2% nedstrøms for transkriptionsstartstedet (TSS). Markant berigede prober blev identificeret over en tærskelværdi justeret til 0,998, hvilket fører til endelig identificere 1840 ErbB3 målgruppen initiativtagere fordelt som følger: 317 initiativtagere i RWPE, 606 i LNCaP og 1297 i PC3 celler, hvoraf 8 blev fundet i de 3 cellelinier og 361 blev delt af de LNCaP og PC3 cellelinjer (fig 3B). Dataene blev yderligere bekræftet med Agilent Workbench 7.0 software. Fordelingen af ​​signalet langs promotorerne blev anvendt til at designe chip-qPCR primere i regionerne, der viste den højeste koncentration af ErbB3-beriget prober med den højeste log-forholdet (Fig 3C). Antallet af mål-promotorer var signifikant højere i hormon-resistent PC3-celler end i hormon-sensitive LNCaP-celler, hvilket antyder inddragelsen af ​​ErbB3

80 kDa i PCa progression og aggressivitet, i overensstemmelse med data opnået i patienter (Fig 1). Gene lister afledt af chip-on-chip eksperimenter blev yderligere analyseret med DAVID (Database til anmærkning, Visualisering og integreret Discovery) [30]. Funktionel anmærkning bekræftede inddragelse af ErbB3

80 kDa-mål i cellulære processer stærkt liberaliseret i tumor mekanismer (Fig 3D). Et betydeligt antal ErbB3

80 kDa mål i PC3 eller PC3 og LNCaP tumorcellelinier var allerede kendt for at være forbundet med PCa eller andre solide tumorer, hvilket tyder på, at ErbB3

80 kDa kunne regulere på en mere generel måde mekanismer tumor progression (fig 3D).

(A) kromatin immunopræcipitation blev udført på endogene forhold. Nukleare lysater blev fremstillet fra native celler dyrket i komplet medium og uden nogen androgen. Chip-DNA og total DNA (Input) mærket med Cy5 og Cy3 fluoroforer fik henholdsvis co-hybridiseret på Agilent initiativtagere tilling arrays. (B) Dataanalyse med Cocas software førte til at vælge 1840 ErbB3 målgruppen initiativtagere i de tre cellelinjer. (C) Agilent Worbench 7.0 software analyse illustrerer fordelingen af ​​positive prober (ErbB3-bundne DNA /røde prikker) og negative prober (Input /grønne prikker) i hele gener sekvensen (X-aksen). Signalintensitet er vist på y-aksen.

CCND1

MMP7

svarer til positive og negative kontroller, hhv. (D) Gene ontologi analyse af ErbB3-mål med DAVID.

chip-qPCR validering af nukleare ErbB3 mål initiativtagere i prostatacancerceller

Blandt de 1840-mål, 26 gener blev udvalgt for chip-qPCR validering (figur 4). Fire ikke-berigede initiativtagere (

ErbB3

,

EBP1

,

PSA

MMP7

) blev anvendt som negative kontroller og vises ingen signifikant forstærkning, mens

CCND1

promotor viste 7 til 12 berigelse fold i LNCaP og PC3 celler henholdsvis (Fig 4). De 3 LNCaP-specifikke mål udviste betydelig berigelse fold i LNCaP celler og ikke i PC3 celler, mens der blev observeret en stærk og specifik berigelse for de 6 PC3-specifikke mål i PC3 cellelinje (Fig 4A vs 4B). Berigelse fold observeret for de delte promotorer varieres afhængig målet og cellelinjen men var altid højere i hormon-resistent PC3 celler end i LNCaP-celler.

På grundlag af bioinformatik data, 16 tilfældigt udvalgte ErbB3-target promotorer fra LNCaP-celler (A) og 19 tilfældigt udvalgte ErbB3 målgruppen promotorer fra PC3-celler (B) blev testet. Alle viste en signifikant ErbB3 berigelse sammenlignet med den negative kontrol chip-IgG (værdi normaliseret til 1).

CCND1

promotor blev anvendt som en positiv kontrol hvorimod ikke-beriget initiativtagere

ErbB3

,

EBP1

,

PSA

, og

MMP7

blev anvendt som negative kontroller. Dataene er repræsentative for 3 uafhængige eksperimenter og er gennemsnittene af tre prøver. * P 0,05, ** P. 0,01, ns = ikke-signifikant, Students

t

test

Transkriptionel regulering af ErbB3-afhængige målgener

givet struktur AK300909.1 transkript, kan ingen specifikke for denne variant siRNA’er udformes. Så vi rettet de transkriptionelle virkninger af ErbB3

80 kDa ved subtraktiv analyse: blev anvendt to typer siRNAs, målretning enten 5′-kodende sekvens af NM_001982.3

ErbB3

transkript (siErbB3A) eller 3 ‘kodende sekvens af både NM_001982.3 og AK300909.1

ErbB3

udskrifter (siErbB3B) som angivet på fig 5A. De siRNA’er blev valideret ved RT-qPCR (ikke vist) og western blotting-analyse: ErbB3

185kDa ekspression blev inhiberet af begge siRNAs, hvorimod ErbB3

80 kDa-ekspression blev kun faldt med siErbB3B i LNCaP og PC3-cellelinjer (Fig 5A ). Under disse betingelser, vi næste analyseret ekspressionen af ​​15 ErbB3

80 kDa-mål-gener (figur 5B). Som forventet blev ekspressionen af ​​

CCND1

væsentligt reduceret i LNCaP og PC3 celler transficeret med siErbB3B vs siErbB3A, sidstnævnte viste ingen forskel med kontrol siRNA. Det samme gjaldt for

GATA2

,

RUNX2

,

MAP3K14

ErbB2

i de to cellelinjer, og

ARID1A

i PC3-celler. Omvendt siErbB3B inducerede højere udtryk for

PPIG

og

MXI1

i de to cellelinjer og for

ID3

PC3-only mål i PC3-celler (Fig 5B). For at forenkle dataanalyse blev procentdelen af ​​udtrykket fold forandring, der kan specifikt henføres til den nukleare isoform beregnet med formlen (relativ genekspression på siErbB3B behandling) /(relativ genekspression på siErbB3A behandling) for hvert mål gen (Fig 5C) . Som vist, ErbB3

80 kDa transkriptionelt aktiverer

CCND1

,

GATA2

,

RUNX2

,

MAP3K14

og hæmmer

PPIG

,

MXI1

i både LNCaP og PC3 celler, mens det hæmmer

TBCC

,

SIN3A

,

ACE

,

ID3

,

RAD52

,

CXCR3

på kun PC3 celler. Western blot-analyse udført på ErbB3

80 kDa-mål bekræftede de transkriptionelle virkninger af den nukleare ErbB3 isoformen på proteinniveauet (S1 Fig).

(A) To siRNA’er blev anvendt til specifikt at inhibere NM_001982.3 udskrift (siErbB3A) eller både NM_001982.3 og AK300909.1 udskrifter (siErbB3B) og valideret af western blotting hjælp af ErbB3 C-ter-antistof. (B) LNCaP og PC3-celler blev transient transficeret med siErbB3A eller siErbB3B før mRNA’er blev revers transkriberet og amplificeret. RT-qPCR blev udført på et udvalg af ErbB3-målgener. Expression fold ændring blev normaliseret til kontrol siRNA transficerede prøver. Transfektioner blev udført i tre eksemplarer og RT-qPCR resultater rapporteret er fra mindst tre uafhængige forsøg. (C) Ekspression gange ændring i træk til inhibering af ErbB3

80 kDa isoform i hver cellelinie og for hver målgen beregnes som forholdet (relativ genekspression ved siErbB3B behandling) /(relativ genekspression ved siErbB3A behandling). ErbB3

80 kDa-afhængig transkriptionel aktivering af

GATA2

,

RUNX2

,

MAP3K14

,

ErbB2

CCND1

inaktivering af

PPIG

, MXI1 var ens i LNCaP og PC3 mens

ARID1A

,

TBCC

,

FYN

,

SIN3A

,

TOR3A

,

ACE

,

RAD52

,

CXCR3A

syntes at være forskelligt reguleret i de to cellelinjer. * P 0,05, ** P 0,01, ns = ikke-signifikant, Students

t

test

De data, der præsenteres her kan integreres til at foreslå en model for nuklear ErbB3.

80 kDa funktioner i prostatakræft progression (Fig 6).

Blokering RA-afhængig signalering ved androgen tilbagetrækning terapi (AWT) først hæmmer tumorvækst, men snart alternative proliferative veje er reaktiveret fremkalde tumor progression. Øget ErbB3 ekspression og efterfølgende reaktivering af PI3K pathway i afhængighed af AWT er en vigtig mekanisme af tumor modstand. Alternativt rapporterer vi her den nukleare akkumulering af ErbB3

80 kDa, en variant mangler det ligandbindende og transmembrane domæne af ErbB3

180kDa, i avancerede PCa resistente over for behandling (CRPC). Som co-regulator for omskrivning af gener associeret med celleproliferation, differentiering, apoptose, onkogenese, ErbB3

80 kDa sandsynligvis vil blive stærkt involveret i terapi modstand og progression til fatal PSA.

DHT

:

dihydrotestosteron; AR

:

androgen receptor; ER

:.

androgen responsive elementer

Diskussion

Målet med denne undersøgelse var at bringe ud molekylære veje involverer ErbB3 i tumor progression og metastatisk spreder for at karakterisere nye potentielle terapeutiske mål for prostatakræft. De seneste behandlinger godkendt til tilbagevendende prostatacancer forsinkelse metastatisk progression og udvide samlet overlevelse, men stadig ikke hæmme tumor progression til fatal CRPC. Uhensigtsmæssig ekspression og /eller aktivering af ErbB-familien af ​​tyrosinkinasereceptorer er blevet rapporteret i avancerede PCa, hvilket fører til overveje ErbB1, ErbB2 og ErbB3 som potentielle diagnostiske og prognostiske markører [22,31]. Følgelig har øget ErbB3 ekspression blevet rapporteret i androgen-afhængige PCa behandles ved androgenfjernelse og var forbundet med dårlig prognose. Denne overekspression korrelerer med cellecyklusprogression og reaktivering af den transkriptionelle aktivitet af AR i fravær af androgener [26]. Desuden har den nukleare opdeling af ErbB3 blevet foreslået at spille en rolle i PCa progression men de involverede mekanismer stadig ukendt [18,27,32].

Vi først undersøgt ekspressionen af ​​ErbB3 på normale eller tumor prostatavæv. Farvning for ErbB3 N-ter var rettet mod membranen, uden nuklear ekspression. Brug af ErbB3 C-ter-antistof, blev kernefarvning vi observerede begrænset til PCA-celler og blev øget i avanceret kastrationsresistent prostatacancer sammenlignet med lokaliserede tumorer. Disse data styrke inddragelsen den nukleare ErbB3 protein i PCa progression op til terminal kastrationsresistent fase [18]. Som vi ikke har kunnet påvise nukleare farvning i CRPC med anti ErbB3 N-ter-antistoffer, antog vi, at den nukleare ErbB3 protein kan være en variant, om modellen for de tidligere beskrevne ErbB3

80 kDa eller ErbB3

50 kDa isoformer [16 , 17]. ErbB3 proteinekspression vurderes på normale og tumor prostata cellelinjer bekræftet vores hypotese, med fuld længde receptor ErbB3

185kDa primært til udtryk i fraktionen ikke-nukleare protein af alle cellelinjer og en ErbB3

80 kDa isoform hovedsageligt påvist i fraktion kerneprotein af tumorcellelinjer. Til dato, blev kun den fulde længde ErbB3

185kDa protein rapporteret i kernen af ​​prostatatumorer og cellelinier [15,19]. Mekanismerne i nuklear lokalisering analyseret hidtil involveret routing fra endosomer og /eller membran spaltning efter receptor-aktivering [5-7, 32-36]. Da ErbB3

185kDa er tyrosinkinase mangelfuld, dets phosphorylering forekommer ved dimerisering med andre medlemmer af ErbB familien [37].